牙髓干细胞在再生医学中的应用研究与进展.doc

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1、精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除牙髓干细胞在再生医学中的应用研究与进展马子洋1，郭晓霞2(1首都医科大学附属北京口腔医院，北京市 100050；2首都医科大学基础医学实验教学中心，北京市 100069)引用本文：马子洋，郭晓霞. 牙髓干细胞在再生医学中的应用研究与进展J.中国组织工程研究，2016，20(19):2872-2878.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.020 ORCID: 0000-0001-6676-4095(郭晓霞)文章快速阅读：牙髓干细胞与组织再生马子洋，男，1995年生，北京市人，汉族，首都医科大学13级七年制口腔

2、医学专业在读。通讯作者：郭晓霞，博士，副教授，首都医科大学基础医学实验教学中心，北京市 100069中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)19-02872-07稿件接受：2016-03-20http:/WWW.crter.org文题释义：牙髓干细胞：来源于牙髓腔内的软组织，可自我更新，有着较强的克隆形成能力，与骨髓间充质干细胞有极其相似的免疫表型(CD105+/CD73+/CD34-/CD45-)。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，在特定条件下能够分化为骨、软骨、神经样细胞、肌细胞等类型。牙髓干细胞的转化医学研究意义：牙髓干细胞具有来源丰富、采集方便、免疫原性低

3、、无伦理争议等优点，因此，牙髓干细胞在再生医学和组织工程修复中有着广泛的应用前景。牙髓干细胞在骨组织修复领域已进入临床研究阶段，而向其他组织分化的研究尚处于起步阶段或基础研究阶段，其调控机制存在着诸多问题，有着巨大的研究潜力。摘要背景：牙髓干细胞是具有良好分化与增殖能力的干细胞，因其取材方便，具有多向分化潜能等特征正逐渐为再生医学研究领域重视。目的：通过分析整理国内外牙髓干细胞的研究进展，对其目前在再生医学领域的应用研究加以总结，为进一步研究提供线索和方向。方法：以“dental pulp stem cell, regenerative medicine, tissue engineering

4、”为英文检索词，以“牙髓干细胞，再生医学，组织工程” 为中文检索词，由第一作者检索Medline，PubMed，万方，维普，中国知网数据库2000至2015年牙髓干细胞及再生医学相关文献，经过筛选最终获得46篇文献进行综述。结果与结论：牙髓干细胞具有自我更新与多向分化潜能，获取方法简便，在再生医学领域拥有巨大发展潜能。牙髓干细胞在骨组织修复领域已进入临床研究阶段，在向其他组织分化方向的研究，尚处于起步阶段或基础研究阶段，有待进一步研究拓展。 关键词：干细胞；分化；牙髓干细胞；再生医学；分离；储存；成骨分化；成神经分化；血管生成；心肌细胞形成 主题词：干细胞；牙髓；再生医学；组织工程 【精品文档

5、】第 2877 页Dental pulp stem cells in regenerative medicine: application and developmentMa Zi-yang1, Guo Xiao-xia2 (1 Beijing Stomatological Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China; 2 Experimental Center for Basic Medical Teaching, Capital Medical University, Beijing 100069, China)A

6、bstractBACKGROUND: Dental pulp stem cells are characterized by multi-lineage differentiation and proliferation abilities and are easy to obtain, so they are becoming an issue of concern in regenerative medicine.OBJECTIVE: To provide clues and direction for further study by analyzing progress of dome

7、stic and overseas research on dental pulp stem cells, and summarizing their application in regenerative medicine. METHODS: The “dental pulp stem cell, regenerative medicine, tissue engineering” in Chinese and English served as the search terms to search articles related to dental pulp stem cells and

8、 regenerative medicine, published from 2000 to 2015 in Medline, PubMed, CNKI, Wanfang and Cqvip databases. Totally 46 articles were selected for overview. RESULTS AND CONCLUSION: Dental pulp stem cells, which hold the capacity of self-renewal and multi-lineage differentiation, are relatively easy to

9、 obtain, and exhibit a great potential in regenerative medicine. The research of dental pulp stem cells in repairing bone defects has entered the clinical trial phase, but the research of cell differentiation into other tissues is still in basic trial phase and needs further development. Subject hea

10、dings: Stem Cells; Dental Pulp; Regenerative Medicine; Tissue EngineeringCite this article: Ma ZY, Guo XX. Dental pulp stem cells in regenerative medicine: application and development. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(19):2872-2878.0 引言 Introduction Ma Zi-yang, Studying for masters degree, B

11、eijing Stomatological Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, ChinaCorresponding author: Guo Xiao-xia, M.D., Associate professor, Experimental Center for Basic Medical Teaching, Capital Medical University, Beijing 100069, China干细胞是未充分分化的细胞，具有自我更新与分化为特定组织器官的能力。1909年，Maksimov首次在研究中发现造血干细

12、胞，并提出“干细胞”的概念1。近年来，干细胞在再生医学领域的应用研究越来越受到研究者的重视。再生医学是指应用生物学及组织工程学的理论方法，通过干细胞的增殖分化替代损坏的细胞、组织和器官，使其具备正常组织、器官的结构和功能。再生医学的应用研究能在一定程度上解决捐献器官缺乏的问题。牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)是指牙髓内可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓细胞，由Gronthos等2于2000年首次提出，它具有与骨髓间充质干细胞相似的免疫表型。牙髓干细胞可以在不同培养环境下表达4种多能标记物：Oct-4、Lin-28、Sox-2、NANOG3。牙髓干细胞主

13、要从脱落的乳牙、智齿、正畸牙等中获得，其来源丰富，不涉及到伦理问题，故在再生医学领域的应用前景广阔。文章就牙髓干细胞在再生医学中的研究进展做一综述。1 资料和方法 Data and methods1.1 文献检索和筛选要求 1.1.1 检索数据库 中国期刊全文数据库(万方、CNKI、维普)、美国医学索引(Medline)、PubMed。1.1.2 检索数据库的选择理由 中国期刊全文数据库(万方、CNKI、维普)是国内的大型中文学术期刊全文数据库，收录范围广泛，特别是医学类期刊文献，读者很容易对研究内容进行检索并获得全文，便于浏览学习。PubMed免费提供生物医学方面的医学文献搜索以及摘要，并提

14、供全文来源数据库的连接，方便查找全文。美国医学索引(Medline)是国际性综合生物医学信息书目数据库，是当前国际上最权威的生物医学文献数据库，学校购买了西文生物医学期刊文献数据库供教师和学生查找全文。1.1.3 检索途径、检索词及各检索词的逻辑关系 为全面、准确地检索出撰写该综述的相关文献，文章写作过程中综合考虑了检索途径的选择、检索词的选择和各检索词间逻辑关系的配置，制定了科学的检索策略。检索途径：主题词检索、关键词检索、全文检索。检索词：以“牙髓干细胞，再生医学，组织工程”； “dental pulp stem cell, regenerative medicine, tissue en

15、gineering”为检索词。检索词的逻辑组配：(dental pulp stem cell AND regenerative medicine) OR (dental pulp stem cell AND tissue engineering)。检索途径、检索词、检索词的逻辑组配的确定理由：方便寻找主要论述牙髓干细胞和再生医学的文献，或牙髓干细胞用于组织工程领域的文献。检索的时间范围：2000年1月至2015年10月。1.2 文献筛选流程和筛选标准文献筛选流程：按照图1的步骤进行。排除文献是内容是否与相关，新颖，可靠，符合筛选标准检索牙髓干细胞相关文献否阅读文题和摘要是内容是否与牙髓干细胞和

16、再和生医学相关可能合格的文献纳入分析泛读和精读文献否图1 文献筛选流程文献的筛选标准：文献内容与牙髓干细胞和再生医学密切相关，且在权威期刊上已经发表的文献。文献的筛选标准的制定理由：为保障综述内容观点相关性强、新颖、明确，论据、结果、结论可靠。排除的文献：初检获得文献197篇，由全体作者共同对检索文献进行评估，排除文献151篇，最终纳入46篇文献进行综述。排除理由：重复研究，内容陈旧，内容相关性差。筛选偏离的描述、原因及对结果的影响：发表性偏离，未与作者联系，定向分化成功结果可能被高估。文献筛选结果的输出形式：文献检索和筛选结果的输出采用文献的引用形式，且保持了格式的一致性，文献的引用形式包括

17、作者、题名、期刊名称、发表年代、卷数(期数)、页码等。经筛选纳入评价的文献提供了全文。检索偏离的描述、原因及对结果的影响：检索词的逻辑组配不同，影响检索结果。2 结果 Results 2.1 牙髓干细胞的生物学性状 牙髓干细胞来源于神经嵴，位于牙髓，属于成体干细胞，具有一定的自我更新和定向分化能力2。间充质干细胞的一些特异性表面标记物可以在研究中被用于识别牙源性干细胞，如常被用于识别硬组织的间充质干细胞基质细胞抗原1(stromal cell antigen 1, STRO-1)已被广泛应用于牙髓干细胞的识别，显示为阳性；间充质干细胞主要表面标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD1

18、05、CD117、CD146、CD166和CD271在牙髓干细胞中呈阳性表达，其中CD105和CD117在牙髓干细胞上阳性表达，提示它有良好的增殖分化能力4。造血干细胞主要表面标记物CD45等呈阴性表达，CD34在不同的研究中阳、阴性表达有争议4-5。国际细胞治疗协会把CD105+/CD73+/CD34-/CD45-作为间充质干细胞的特征6。Yasui等7根据细胞表达2种表面标记物LNGFR(CD271)和THY-1(CD90)确定牙髓组织特异的细胞群，纯化人牙髓干细胞，这些细胞同时表达已知的间充质细胞标记物。分离的牙髓来源的 LNGFRLow+ THY-1High+细胞代表高纯度的克隆形成细

19、胞群，这些细胞表现出长期增殖、多向分化潜能，能促进新骨形成。因此建议，LNGFRLow+ THY-1High+牙髓来源的细胞可为骨再生提供一种很好的细胞来源。牙髓干细胞具有多向分化潜能，可以在特定条件下分化为骨、软骨、神经细胞、肌细胞、脂肪细胞和角膜上皮等多种组织细胞，可用于牙本质再生、骨组织再生、神经修复等研究领域8-9。在临床治疗中已有成功被用于骨组织再生的报道10。 2.2 牙髓干细胞的分离与储存 相比其他成体干细胞，牙髓干细胞可以较容易的从正畸拔除的牙齿、脱落的乳牙、拔除的阻生齿的牙髓中获取。但是，到目前为止，大多数分离、扩增方法还不能完全令人满意，因为这些方法有可能改变细胞的生物学特

20、性和分化细胞的质量11。Hilkens等12研究发现，目前广泛应用的牙髓组织酶消化法(the enzymatic digestion of the pulp tissue，DPSC-EZ)和外植体法(the explant method，DPSC-OG)分离的牙髓干细胞，均可较好的应用于骨组织再生。Eubanks等13研究发现，用以上两种分离方法从1个第三磨牙分离的细胞，经过2周培养均能回收大约106个细胞。不断有研究认为，酶消化法有可能影响细胞的表型和性能，故不适于治疗用细胞分离14-16。相比而言，外植体法更容易、快捷、安全、经济，更符合GMP指南获得临床级数量的间充质干细胞，而且获得的牙

21、髓干细胞显示相似或更高的分化能力17。Murakami等18用粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，GCSF)分离牙髓干细胞，并诱导其定向分化，然后移植入免疫缺陷大鼠，结果显示其高效安全。目前用于分离牙髓干细胞的粒细胞集落刺激因子已有商品化试剂NEUTROGIN。牙髓可以储存在4 冷藏环境中过夜，在-85 到-196 冷冻环境中可以储存1周，从冷藏或冷冻的牙髓中分离牙髓干细胞除成功分离数量有所下降外，其表面抗原仍有活性，免疫功能和分化能力上并无损失19。Munvar等将分离出的牙髓干细胞(CD105+)分别用Kamath法20：10%二

22、甲基亚砜+体积分数为70%胎牛血清+20% NH(non-hematopoietic)干细胞培养液；Papaccio法21：10%二甲基亚砜+体积分数为90%胎牛血清冻存。通过比较两种方法冻存30 d的细胞，发现Papaccio法(59.5%)比Kamath法(56.2%)有更高的细胞生存率，而对于冻存1 d(65.5%)和7 d (56%)的细胞Kamath法更优。冻存后的人牙髓干细胞表达间充质干细胞标记物，但冻存时间可能通过改变细胞膜蛋白空间构型或者在某个分化水平抑制细胞，从而影响表面标记物的表达22。因此，Ducret等23推荐在分离和培养细胞时用人胎盘型和型胶原等量混合预涂培养皿，因为

23、这两种胶原是牙髓细胞外基质中含量最丰富的胶原。用无异种分离试剂和确定的培养基(如SPE-IV，含临床级人白蛋白，-MEM，rhIGF-1，rhFGF-2)取代通用产品培养和传代细胞。经过上述方法分离培养的牙髓细胞在无血清培养基中冻存后，不会影响细胞的倍增时间和收集细胞数量，细胞活力与新鲜细胞相比有所下降，但与文献报道相似24。一些发达国家如日本、美国和挪威先后建立牙齿银行，为牙髓干细胞的基础和临床应用研究提供便利，但牙齿银行用于临床储存维持费用较高，较难为发展中国家接受，而最新的全牙储存方法可以在保证牙髓干细胞免疫功能及分化能力不受影响的同时降低储存成本25。2.3 牙髓干细胞在再生医学中的应

24、用 牙髓干细胞具有多向分化、获取简便的特性，被广泛应用于各种退行性疾病的再生医学治疗研究4。目前，牙髓干细胞用于骨组织修复已经进入临床应用研究阶段，在神经、心肌、肝细胞、血管修复等方面尚处于动物实验研究阶段。牙髓干细胞在再生医学方面已经显示出巨大潜能，有可能用于治疗各种人类疾病。2.3.1 应用牙髓干细胞修复牙髓和牙本质 成人牙髓干细胞亚组分CD31-/CD146- SP细胞和CD105+细胞，具有较高的血管和神经分化潜力，可以作为潜在的临床牙髓修复材料26。EI-Backly等27将新西兰白兔牙髓干细胞接种在聚乳酸乙醇酸支架上，然后移植入兔皮下12 d，观察到类似于牙本质小管的结构。Suzu

25、ki等28将人类牙髓干细胞接种在胶原支架上，然后在体外加入骨形态发生蛋白7，观察到牙髓干细胞的钙化。在牙髓干细胞胶原支架复合体中添加碱性成纤维细胞生长因子，移植入大鼠背部，观察到牙髓样细胞及血管的再生。研究发现在龋齿根管治疗后，将牙髓干细胞用于牙髓再生的效果更好。但目前尚无法将牙髓干细胞培养为完整的牙髓-牙本质复合体。2.3.2 应用牙髓干细胞修复骨组织 cDNA微阵列分析表明，牙髓干细胞参与颅面结构，包括颅面部骨骼与软骨的形成29。牙髓干细胞向骨组织分化的能力在较多实验中得到验证。在体外，牙髓干细胞表达成骨标记物包括骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、碱性磷酸酶(alka

26、line phosphatase，ALP)、牙本质涎蛋白(entin sialoprotein，DSP)，可以分化为成骨细胞9。Graziano等30应用磁激活细胞分选法分选人牙髓干细胞，被选出的CD34+干细胞能分化为前成骨细胞，不需通过扩增，将其黏附于聚乳酸支架，移植入免疫缺陷大鼠，结果发现回收的骨结节类似于原始支架尺寸，在免疫荧光和X射线下呈现骨组织的特征，且新生成的血管具有人类血管特征。de Mendoca Costa等31将人牙髓干细胞与胶原膜黏合，移植入全层颅骨缺损的非免疫缺陷大鼠，观察到颅骨缺损的修复。聚合酶链反应扩增发现新生成的骨细胞含有人类DNA，提示颅骨的修复源于牙髓干细胞

27、。Tabatabaei等32通过正畸治疗中的机械力刺激人牙髓干细胞，与对照组相比，成骨标记物碱性磷酸酶和骨桥蛋白含量显著提高，结果提示不使用试剂，仅通过机械力可以诱导牙髓干细胞向成骨方向分化。dAquino等10分离提取人第三磨牙内牙髓干细胞，扩增后黏附于胶原蛋白海绵支架，填充于由于骨吸收造成的自体下颌骨的骨缺损处，3个月后临床、X射线及组织学检测表明骨组织完全再生，1年后再生骨组织功能达到最佳，提示人牙髓干细胞可以完全恢复人类下颌骨缺损。2.3.3 应用牙髓干细胞修复神经组织 Sakai等8发现，牙髓干细胞能诱发脊髓损伤后的神经再生。将牙髓干细胞移植到大鼠的脊髓横断处，可分化为成熟的少突胶质

28、细胞，通过促进轴突再生，抑制轴突生长抑制因子，从而抑制神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的凋亡达到再生神经的目的。de Almeida等33采用小鼠挤压神经损伤模型也支持上述结论。Apel等34在阿尔茨海默病和帕金森病体外模型中将大鼠牙髓干细胞加入至原代神经元培养，2 d后加入神经毒素，发现牙髓干细胞可以减弱毒素的毒性，保护原代神经元并释放骨形态发生蛋白2和神经营养因子(包括神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、脑源性神经营养因子)。Chang等35发现，在电刺激下，含有牙髓干细胞的培养基中含有更多的微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白和少突胶质细胞，提示牙髓干细胞可以向成熟的多巴胺能神经元分化。Ma

29、tsubara等36将人牙髓干细胞鞘内注射入脊髓急性损伤大鼠，牙髓干细胞通过释放单核细胞趋化蛋白1和唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素9，加速损伤修复，使大鼠恢复行走能力。2.3.4 应用牙髓干细胞改善循环系统功能 Gandia等37采用心肌内注射法将牙髓干细胞注入心肌梗死裸大鼠模型内，牙髓干细胞通过分泌多种促血管生成与抗凋亡因子，包括血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子1和2、干细胞因子和粒细胞集落刺激因子，促进生成新的血管和心肌细胞。实验组大鼠心前壁增厚，梗死面积减小，心脏功能改善并有新血管生成。Iohara等38将牙髓干细胞移植入后肢缺血小鼠模型，通过表达促血管生成因子如血管内皮生长因子，促进

30、毛细血管的生成。2.3.5 牙髓干细胞在其他组织修复中的应用 研究发现牙髓干细胞还具有分化为肌肉、角膜、肝细胞、胰岛素生成细胞、皮肤等多种细胞与组织的能力。Yang等39将人牙髓干细胞注射入骨骼肌缺损小鼠模型中，发现有肌肉再生的现象。牙髓干细胞通过产生抗肌萎缩蛋白(dystrophin)，改善肌营养不良症状。Gomes等40使用兔眼角膜烧伤模型，将组织工程牙髓干细胞片移植入切除烧伤部位的角膜床中，3个月后角膜透明度有所改善，有少量新血管生成。Ishkitieve等41在体外培养人牙髓干细胞，使用肝生长因子刺激，培养出高纯度的肝细胞样细胞。此后，Ishkitieve等42使用人牙髓干细胞治疗胆汁

31、淤积型肝硬化，使肝功能完全恢复，且与骨髓干细胞相比出现恶性肿瘤的风险有大幅度降低。石建峰等43通过构建重组转录因子hFOXA2和hPDX1慢病毒载体，转染人牙髓干细胞成功诱导其形成胰岛素生成样细胞，提示牙髓干细胞可用于1型糖尿病的治疗。Nishino等44使用裸鼠全层皮肤缺损模型，将人牙髓干细胞移植入伤口组织，结果皮肤组织加速愈合，缺损区域有人类型胶原的形成。3 结论 Conclusion 综上所述，牙髓干细胞来源于牙髓，获取方法简便，有相对成熟的分离和储存方法。牙髓干细胞具有自我更新与多向分化能力，在适当的条件下能分化为骨组织、神经组织、肌组织、角膜、肝细胞、胰岛素生成细胞等多种组织与细胞。

32、牙髓干细胞在骨组织修复领域已进入临床研究阶段，而向其他组织分化的研究尚处于起步阶段或基础研究阶段，其调控机制存在着诸多问题，有待进一步研究。由于牙髓干细胞获得数量有限，在临床应用中受到限制，而且干细胞应用于再生医学刚刚起步，远期疗效有待观察，各国对此谨慎，在一定程度上阻滞了牙髓干细胞临床应用研究的发展。未来研究有必要进一步确定更特异的间充质干细胞标记物，并且随着研究的深入，获得临床治疗级别的更高效、可再生、安全并且标准化的牙髓干细胞分离扩增方法45-46，将使牙髓干细胞在再生医学领域的潜能被进一步发掘。 作者贡献：第一作者完成设计、收集资料、成文，通讯作者审校，第一作者和通讯作者对文章负责。利

33、益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：没有与相关伦理道德冲突的内容。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References 1 Ramalho-Santos M, Willenbring H. On the origin of the term ste

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