看第十三章植物细胞的遗传转化ppt课件.ppt

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1、植物遗传转化系统的建立植物遗传转化系统的建立张志胜张志胜 Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，China Tel 38297154 E-mail 内内 容容一、一、 植物遗传转化系统概述植物遗传转化系统概述二、植物遗传转化受体系统的建立二、植物遗传转化受体系统的建立三、三、 植物基因转化的方法植物基因转化的方法四、转基因植株的再生及其检测四、转基因植株的再生及其检测采用PP管及配件：根据给水设计

2、图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一、一、 植物遗传转化系统概述植物遗传转化系统概述 (general situation of plant genetic transformation system)1、植物遗传转化（植物遗传转化（plant genetic transformation）是指利用重组）是指利用重组DNA技术，将外源基因导入植物技术，将外源基因导入植物细胞，外源基因与受体植物染色细胞，外源基因与受体植物染色体整合并稳定遗传和表达的过程体整合并稳定遗传和表达的过程或技术。或技术。 植物遗传转化技术是分子育种植

3、物遗传转化技术是分子育种的核心技术之一，已经成为培育的核心技术之一，已经成为培育植物新品种的有效方法之一植物新品种的有效方法之一. 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 全球转基因作物种植面积全球转基因作物种植面积采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物1、怎样开展遗传转化工作确定育种目标确定育种目标获得目的基因获得目的基因受体材料的选择受体材料的选择工程载体的构建工程载体的构建遗传转化受体系统的建立遗传

4、转化受体系统的建立采用一定的方法将目的基因导入细胞采用一定的方法将目的基因导入细胞转化细胞的筛选和植株再生转化细胞的筛选和植株再生和目标性状鉴定和目标性状鉴定采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物植物遗传转化受体系统植物遗传转化受体系统是指用于是指用于转化的外植体通过组织培养途径转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并接受外源稳定地再生无性系，并接受外源基因的整合，对用于转化选择的基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的系统（王关林

5、和方抗生素敏感的系统（王关林和方宏筠，宏筠，1998）二、植物遗传转化受体系统的建立二、植物遗传转化受体系统的建立采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物1、植物遗传转化常用的受体、植物遗传转化常用的受体 （1） 植物组织和器官：幼叶、未成熟植物组织和器官：幼叶、未成熟子叶、子叶、未成熟胚、成熟胚、子叶子叶、子叶、未成熟胚、成熟胚、子叶节、子房、下胚轴、茎尖、花粉、球茎、节、子房、下胚轴、茎尖、花粉、球茎、根和鳞茎等。根和鳞茎等。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角

6、切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（2）中间繁殖体：采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（3）原生质体采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 高效稳定的再生能力高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性较高的遗传稳定性 具有稳定的来源具有稳定的来源 对抗生素敏感对抗生素敏感 抑菌抗生素：在农杆菌介导的遗传转化抑菌抗生素：在农杆菌介导的遗传转化 中用来抑制农杆菌生长的抗生素。中用来

7、抑制农杆菌生长的抗生素。 选择性抗生素：用来对转化子进行早选择性抗生素：用来对转化子进行早 期筛选的抗生素期筛选的抗生素采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物植物材料对所选用的抗生素有一定的敏感性抗生素对受体植物没有剧烈的毒性常用的选择性抗生素： 抑菌抗生素：氨苄青霉素、羧苄青霉抑菌抗生素：氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢霉素素、头孢霉素选择性抗生素：潮霉素、卡那霉素选择性抗生素：潮霉素、卡那霉素农杆菌敏感性农杆菌敏感性 LAB4404 EHA105采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用

8、管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（1）组织器官受体系统）组织器官受体系统 组织器官受体系统是组织器官受体系统是 指以植物的组织器官为转基因的指以植物的组织器官为转基因的受体，然后通过脱分化和再分化获得再生植株的受体系统。受体，然后通过脱分化和再分化获得再生植株的受体系统。 特点：特点： 受体来源广泛，容易获得；受体来源广泛，容易获得； 适合于各种遗传转化方法，特别是农杆菌介导法；适合于各种遗传转化方法，特别是农杆菌介导法； 适应于各种能够通过组织培养获得再生植株的植物；适应于各种能够通过组织培养获得再生植株的植物； 获得再生植株的周期长。获得再生

9、植株的周期长。 叶盘法、生殖细胞受体系统叶盘法、生殖细胞受体系统采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物n烟草叶盘遗传转化体系，其阳性转基因植株频烟草叶盘遗传转化体系，其阳性转基因植株频率可达率可达 5 7.1% （张宁等，（张宁等，2004）n大白菜，最高转化频率可达大白菜，最高转化频率可达5.74%（杨广东等，（杨广东等，2002）n水稻成熟胚、幼胚、幼穗遗传转化受体系统。水稻成熟胚、幼胚、幼穗遗传转化受体系统。幼胚最高，基因枪法比农杆菌介导法高（王芋幼胚最高，基因枪法比农杆菌介导法高（王芋华等，

10、华等，2004）。）。采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（2 2）中间繁殖体）中间繁殖体受体系统受体系统是指以植物组织培养过程中产生的中间繁殖体为转基因是指以植物组织培养过程中产生的中间繁殖体为转基因的受体，然后通过再分化获得再生植株的受体系统。的受体，然后通过再分化获得再生植株的受体系统。 特点：最理想的基因转化受体体统特点：最理想的基因转化受体体统 获得再生植株周期短获得再生植株周期短 快速简单方便快速简单方便 适合多种转化方法适合多种转化方法 接受外源基因能力强，转化率高接受外源基因能力强

11、，转化率高采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立了马铃薯栽培建立了马铃薯栽培品种品种“费乌瑞它费乌瑞它(Favorita)”茎段和试管薯的遗传转化体茎段和试管薯的遗传转化体系系,其转化频率分别可达其转化频率分别可达25.6%和和36.8% （张宁等，（张宁等，2004）采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 特点：特点： 转化率高转化率

12、高 获得再生植株无性系变异多，转化的外源基因获得再生植株无性系变异多，转化的外源基因稳定性差稳定性差 出现的嵌合体少出现的嵌合体少 技术难度大技术难度大采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（4）生殖细胞受体系统生殖细胞受体系统 以生殖细胞如花粉和卵细胞为受体进行基因转化的系统以生殖细胞如花粉和卵细胞为受体进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。利用生殖细胞进称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。利用生殖细胞进行基因转化有两种途径：行基因转化有两种途径： 一是利用小孢子和卵细胞的单倍

13、体培养，诱导出胚性细一是利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，从而建立单倍体的基因转化受体系统；胞或愈伤组织细胞，从而建立单倍体的基因转化受体系统； 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉导人法、花粉粒浸泡法和子房微注射法等。花粉导人法、花粉粒浸泡法和子房微注射法等。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物特点特点A、利用单倍体遗传转化受体系统进行基因转化，避免了基因显隐性、利用单倍体遗传转化受体系统进行基因转化，

14、避免了基因显隐性的影响，有利于基因的充分表达，通过染色体加倍后即可使基因的影响，有利于基因的充分表达，通过染色体加倍后即可使基因纯合，缩短了目的基因纯合的时间，加快了转基因育种过程；纯合，缩短了目的基因纯合的时间，加快了转基因育种过程；B、花粉管通道法和子房注射法由于操作简单，受实验室条件限制较、花粉管通道法和子房注射法由于操作简单，受实验室条件限制较小，已成为目前国内常用的转基因方法之一，同时，花粉管通道小，已成为目前国内常用的转基因方法之一，同时，花粉管通道法是利用植物自身的有性生殖过程，有利于将现代的分子育种与法是利用植物自身的有性生殖过程，有利于将现代的分子育种与常规育种紧密结合，也有

15、利于目的基因在转基因后代中的稳定表常规育种紧密结合，也有利于目的基因在转基因后代中的稳定表达；达；C、受体取材受到季节的影响大。利用花粉管通道法等进行遗传转化、受体取材受到季节的影响大。利用花粉管通道法等进行遗传转化只能在短暂的开花期内进行，这是限制该系统应用的主要原因之只能在短暂的开花期内进行，这是限制该系统应用的主要原因之一。一。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物4、遗传转化受体系统的建立、遗传转化受体系统的建立（1）高频再生系统的建立）高频再生系统的建立 理想的高频再生系统应具备的条件理

16、想的高频再生系统应具备的条件 具有高的中间繁殖体的诱导率具有高的中间繁殖体的诱导率 具有高的植株再生能力具有高的植株再生能力 易培养，重复性好易培养，重复性好 体细胞无性系变异少体细胞无性系变异少采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物高频再生系统建立的方法高频再生系统建立的方法 高频再生系统的建立是建立高效稳定转基因受体系统的高频再生系统的建立是建立高效稳定转基因受体系统的基础基础 外植体的选择外植体的选择 外植体的生理年龄外植体的生理年龄 外植体的生理状态外植体的生理状态 外植体的遗传背景外植体的

17、遗传背景 选择的适宜外植体是建立高频再生系统的前提选择的适宜外植体是建立高频再生系统的前提 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物培养基的筛选是高频再生系统的核心培养基的筛选是高频再生系统的核心 培养基影响组培效果培养基影响组培效果 培养基影响变异程度培养基影响变异程度 培养基影响分化途径培养基影响分化途径培养基培养基采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物培养基培养基基本培养基基本培养基激素的选择：激素的

18、选择： 生长素（生长素（2 2，4-D4-D、NAANAA、 IAAIAA、IBAIBA和和2 2，4 4，5-T5-T）和）和细胞分裂素（细胞分裂素（ ZTZT、BAPBAP、6-BA6-BA、2iP2iP和和 KTKT）糖的种类和浓度糖的种类和浓度有机附加物的选择有机附加物的选择采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物培养条件培养条件培养条件是影响培养条件是影响高频再生系统的重要因素高频再生系统的重要因素 影响组培的效果影响组培的效果 影响变异频率影响变异频率 温度温度光照：强度、光周期和光质光照

19、：强度、光周期和光质采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物高频再生系统的评价n中间繁殖体诱导率中间繁殖体诱导率n中间繁殖体增殖率中间繁殖体增殖率n植株分化率植株分化率n变异率变异率n移栽成活率移栽成活率采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物抗生素敏感性试验抗生素敏感性试验选择对抗生素敏感的受体材料是建立高效稳定转基选择对抗生素敏感的受体材料是建立高效稳定转基因受体系统的保证（农杆菌介导法）因受体系统的保证

20、（农杆菌介导法） 外植体外植体 诱导培养基诱导培养基 含不同浓度抗生素培养基含不同浓度抗生素培养基 植株再生植株再生 综合评价综合评价采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物农杆菌敏感性试验农杆菌敏感性试验 选择对农杆菌敏感的受体材料是建立高效稳定转基因选择对农杆菌敏感的受体材料是建立高效稳定转基因受体系统的关键（农杆菌介导法）受体系统的关键（农杆菌介导法） 不同植物材料不同植物材料 农杆菌菌株浸染农杆菌菌株浸染 敏感性评价敏感性评价 （结瘤或发根率，发生时间，生长状况等）（结瘤或发根率，发生时间，生

21、长状况等）采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（2）受体系统常见的问题及其解决途径）受体系统常见的问题及其解决途径再生能力及其遗传稳定性再生能力及其遗传稳定性 选择合适外植体选择合适外植体 减少继代次数减少继代次数 选择合适培养基等选择合适培养基等愈伤组织褐变愈伤组织褐变再生植株玻璃化再生植株玻璃化采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物三、植物遗传转化的方法三、植物遗传转化的方法（1）载体转化系统：）载

22、体转化系统：农杆菌介导法农杆菌介导法、植、植物病毒载体法；物病毒载体法；（2）直接转化系统：化学法（）直接转化系统：化学法（PEG法和法和脂质体法）和物理法（脂质体法）和物理法（基因枪法、基因枪法、电击电击法和显微注射法等）；法和显微注射法等）；（3）种质转化系统：）种质转化系统：花粉管通道法、花粉管通道法、萌萌动种胚浸泡法、子房和胚囊注射法等。动种胚浸泡法、子房和胚囊注射法等。采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪

23、边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物(一）农杆菌介导转化法1、根癌农杆菌介导转化原理、根癌农杆菌介导转化原理 农杆菌能浸染植物细胞并将其中所带农杆菌能浸染植物细胞并将其中所带有的质粒中一部分有的质粒中一部分T-DNA导入植物细胞导入植物细胞中，并整合到植物核中，并整合到植物核 DNA上，然后在植上，然后在植物细胞中得到转录和翻译，表达出目的物细胞中得到转录和翻译，表达出目的基因的性状。基因的性状。采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物2、根癌农杆菌、根癌农杆菌Ti质粒转化的基本程序质粒

24、转化的基本程序（1）受体系统的）受体系统的建立建立 （2）Ti质粒转化质粒转化载体的构建载体的构建 （3）目的基因）目的基因的转化与鉴定的转化与鉴定采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物目的基因的转化程序 根癌农杆菌的培养、纯化、保存根癌农杆菌的培养、纯化、保存 Vir区基因的活化和工程菌液的制备区基因的活化和工程菌液的制备 外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养 外植体脱菌及选择培养外植体脱菌及选择培养 转化体的选择和植株再生转化体的选择和植株再生 转基因植株

25、的鉴定转基因植株的鉴定采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物叶盘转化法 打孔器从消毒叶片上获得叶盘打孔器从消毒叶片上获得叶盘 在工程菌液中浸数秒在工程菌液中浸数秒 培养基上共培养培养基上共培养23天天 在含有抑菌剂的培养基上培养在含有抑菌剂的培养基上培养 转化体选择和再生转化体选择和再生采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边

26、剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物不同作物适宜的接种时间和接种菌液浓度不同作物适宜的接种时间和接种菌液浓度*外植体种类外植体种类接种时间接种时间/min接种菌液浓度接种菌液浓度/OD共培养时间共培养时间（d）小麦未成熟胚和小麦未成熟胚和胚性愈伤组织胚性愈伤组织600.51.023水稻胚性愈伤组水稻胚性愈伤组织织151.01.52玉米未成熟胚玉米未成熟胚101.023棉花下胚轴棉花下胚轴130.30.62大豆子叶大豆子叶10300.30.62采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物原生

27、质体共培养转化法 原生质体分离原生质体分离 原生质体培养原生质体培养 共培养共培养23天（工程菌：原生质体天（工程菌：原生质体=1：1000） 去菌培养和转化体的选择去菌培养和转化体的选择 植株再生植株再生采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物3、影响农杆菌介导法转化效率的因素、影响农杆菌介导法转化效率的因素 （1）农杆菌）农杆菌（2）质粒）质粒（3）受体材料）受体材料（4）共培养：时间、培养基和培养条件）共培养：时间、培养基和培养条件（5）抗氧化剂）抗氧化剂采用PP管及配件：根据给水设计图配置好P

28、P管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（二）基因枪法（二）基因枪法 particle gun 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物2、方法和步骤（1）DNA微弹的制备 60100mg金粉 1ml无水乙醇中，超声波洗涤 离心去乙醇 1ml无菌水洗涤2次后，加 1ml无菌水重悬 25l悬浮液 +25l DNA（1

29、g/ l），混均，再加入25l 2.5mol/L CaCl2，手指振荡5次，加入20 l 40% PEG4000，手指振荡5次， 混合液在室温下静置10min 离心5min，移去50-60 l 上清，其余混均，每次用量8 l 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物（2）材料的准备，将材料接入培养皿中，）材料的准备，将材料接入培养皿中，把培养皿放入基因枪的样品室中，把培养皿放入基因枪的样品室中，并对准子弹发射中轴。并对准子弹发射中轴。 （3）按基因枪操作程序进行微弹轰击）按基因枪操作程序进行微弹轰击

30、（4）轰击后材料的培养和鉴定）轰击后材料的培养和鉴定采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物3、影响基因枪转化效率的因素、影响基因枪转化效率的因素（1）金属微粒的种类和直径）金属微粒的种类和直径（2）沉淀助溶剂）沉淀助溶剂（3） DNA纯度和浓度纯度和浓度（4）轰击参数：粒子速度、入射速度、）轰击参数：粒子速度、入射速度、阻挡板至样品室高度、轰击次数等阻挡板至样品室高度、轰击次数等（5）植物受体系统）植物受体系统采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转

31、，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物基因枪转化法的特点基因枪转化法的特点采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物四、转基因植株的再生及其检测四、转基因植株的再生及其检测采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在

32、管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物基因中文名基因来源基因产物检测方法选择性试剂gus葡萄糖苷酸酶基因细菌葡萄糖苷酸酶荧光分析法及组织化学分析法luc荧光素酶基因萤火虫荧光素酶光分析法gfp绿色荧光蛋白基因水母绿色荧光蛋白荧光显微分析法nos胭脂碱合成酶基因细菌胭脂碱合成酶菲醌显色报告基因ocs章鱼碱合成酶基因细菌章鱼碱合成酶菲醌显色barGlufosinate 抗性基因细菌PAT 酶Basta 除草剂或 Glufosinate或 PPThph潮霉素磷酸转移酶基因细菌潮霉素磷酸转移酶潮霉素aphII新霉素磷酸转移酶基因细菌新霉素磷酸转移酶卡那霉素G418筛

33、选标记基因aroA草甘膦抗性基因细菌EPSPs草甘膦采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物 转基因的整合鉴定转基因的整合鉴定PCR检测检测 转基因的整合鉴定转基因的整合鉴定Southern blot 转基因的表达鉴定转基因的表达鉴定Northern blot转基因的表达鉴定转基因的表达鉴定Hm浸泡筛选浸泡筛选采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物五、外源基因的整合特性与表达五、外源基因的整合特性与表达1、

34、外源基因的整合、外源基因的整合 一般认为外源基因是随即插入到植物染一般认为外源基因是随即插入到植物染色体上色体上 某种特定的外源基因对特定的宿主细胞某种特定的外源基因对特定的宿主细胞染色体，其插入位点在序列上有一定的染色体，其插入位点在序列上有一定的倾向性倾向性 在载体在载体DNA上接一段与受体上接一段与受体DNA同源同源的片段能提高转化率的片段能提高转化率 基因插入的拷贝数差异很大基因插入的拷贝数差异很大采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物2、外源基因的表达、外源基因的表达n研究方法：研究方法：

35、 n拷贝数对基因的表达有一定的影响拷贝数对基因的表达有一定的影响n共抑制：导入的基因及受体内与其同源的基因共抑制：导入的基因及受体内与其同源的基因表达减弱的现象表达减弱的现象n基因沉默基因沉默n转基因的遗传及稳定性转基因的遗传及稳定性采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物六、实验安排1、高频再生系统的建立（高频再生系统的建立（8学时）学时） （1）原球茎的诱导）原球茎的诱导 （2）原球茎的增殖和分化）原球茎的增殖和分化 （3）生根和壮苗）生根和壮苗 （4）试管苗移栽）试管苗移栽 （5）变异的检测）变异的检测采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物2、抗生素敏感性实验（、抗生素敏感性实验（5）3、农杆菌转化实验（、农杆菌转化实验（13）