第三章-基因工程的载体ppt课件.ppt

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1、我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第二章第二章 基因工程的载体基因工程的载体和工具酶和工具酶第一节第一节 载体载体我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物引引 言言 基因克隆的本质基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就达、不易进入受体细胞、

2、不能稳定维持，所以就必须借助于必须借助于“载体载体”及其及其“寄主细胞寄主细胞”来实现。来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：作为基因克隆的载体必须具备以下特性：载体必须是复制子。载体必须是复制子。具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具备多克隆位点（具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。），便于外源基因插入。自身分子量较小，拷贝数高。自身分子量较小，拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。在宿主细胞内稳定性高。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物一、一

3、、 质粒载体质粒载体（plasimid vectors）（一）质粒载体的生物学特性一）质粒载体的生物学特性（二）质粒载体的制备二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的三）质粒载体的改造改造我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（1）质粒质粒是是独立于染色体以外的能自主复制的裸露独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状的双链环状( (少数为线形和少数为线形和RNARNA） DNADNA分子。分子。广泛从在于细菌细胞广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。中，比

4、病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。肠杆菌的质粒。大肠杆大肠杆菌的质粒主要有菌的质粒主要有F质粒（质粒（F因子）、因子）、R质粒（抗药性质粒（抗药性因子）和因子）和Col质粒（大肠质粒（大肠杆菌素因子）三种。杆菌素因子）三种。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（2）质粒的大小质粒的大

5、小差异很大差异很大，最小的只有，最小的只有1kb,1kb,只只能编码中等大小的能编码中等大小的2-32-3种蛋白质分子，最大的种蛋白质分子，最大的达到达到200kb200kb。（3）质粒的生存质粒的生存在寄主细胞中在寄主细胞中“友好友好”地地“借借居居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。点不一定能在其它生物细胞中繁殖。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（

6、一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（4）质粒的复制类型质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的在的数目称为该质粒的拷贝数拷贝数。据拷贝数将质粒分为。据拷贝数将质粒分为两种复制型：两种复制型：“严紧型严紧型”质粒质粒（stigent plasmidstigent plasmid）, ,拷贝数为拷贝数为1-31-3；“松弛型松弛型”质粒质粒（relaxed plasmidrelaxed plasmid）, ,拷贝数为拷贝数为10-6010-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大

7、的变同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。化。（5）质粒的不亲和性质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。体的质粒应是不同的不亲和群。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性 质粒的转质粒的转移移 接合型质粒接合型质粒分子量大分子量大严紧型复制严紧型复制 非接合型质非接合型质粒粒分子量小分子量小松弛型复制松

8、弛型复制 是否含有接是否含有接合转移基因合转移基因 非转移性质粒，不含非转移性质粒，不含tra基因；可以为转基因；可以为转移性质粒所带动转移。移性质粒所带动转移。转移性质粒，含有转移性质粒，含有tra基因；能通过结合基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。作用从一个细胞转移到另一个细胞。在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：有一定的相关性。现归纳如下：我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（一）质

9、粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（7）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，线状双螺旋三种，双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（环（SC构型）构型）开环双螺旋开环双螺旋（OC构型）构型）线状双螺旋线状双螺旋（L构型）构型）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（二）质粒DNA的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DN

10、A分开及除去蛋白质和RNA。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物碱变性法质粒提取的原理：碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNADNA与线性染色体与线性染色体DNADNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。的。 在在pHpH值值12.012.012.512.5范围内时，线性的范围内时，线性的DNADNA会会被变性而共价闭合环状质粒被变性而共价闭合环状质粒DNADNA却却不会被变性。不会被变性。 通过冷却或恢复中性通过冷却或恢

11、复中性pHpH值使之复性，线性染值使之复性，线性染色体形成网状结构，而色体形成网状结构，而cccDNAcccDNA可以准确迅速可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNAcccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒粒DNADNA。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物碱变性法提取质粒的步骤：碱变性法提取质粒的步骤：1 1、取、取1.51.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加

12、在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；微量离心管中，离心收集细胞沉淀；2 2、加入、加入100100微升冰冷的溶微升冰冷的溶液液I I，（，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震）涡旋震荡悬浮菌液。荡悬浮菌液。3 3、加入、加入200200微升新配制的溶液微升新配制的溶液II II，（，（0.2M NaOH0.2M NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）缓缓缓缓混匀置室温混匀置室温5 5分钟。分钟。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的溶液毫升冰冷的溶液IIIIII

13、，（醋酸钾，（醋酸钾29.429.4克，克，冰乙酸冰乙酸11.511.5毫升，加蒸馏水至毫升，加蒸馏水至100100毫升）颠倒离心毫升）颠倒离心管管1010次后，冰浴次后，冰浴5 5分钟。分钟。5 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒集质粒DNADNA。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（三）质粒载体的改造（三）质粒载体的改造去掉不必要的去掉不必要的DNADNA区段。区段。减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。减少限制酶的识别位点，一种

14、酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。（单一的限制性酶切位点）。加入易于捡出的选择性标记基因。加入易于捡出的选择性标记基因。对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。转移。改造或增加基因表达的调控序列。改造或增加基因表达的调控序列。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1 1、质粒、质粒pBR322 pBR3224363结构：结构：（1 1）氨苄青霉素抗性基因（）氨苄青霉素抗性基因（ampampr r或或ApApr r） 3 3种限制酶单一识别位点种限制

15、酶单一识别位点 。（2 2）四环素抗性基因（）四环素抗性基因（tetr或或Tcr）内部有内部有7 7种，启动区内有种，启动区内有2 2种限制种限制酶单一识别位点酶单一识别位点 。（3）DNA复制起点（复制起点（ori）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物pBR322质粒的优点：质粒的优点：（1 1）具有较小的分子量。）具有较小的分子量。 4363bp4363bp，2.62.610106 6DaDa，（2 2）具有两种抗菌素抗性）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记基因可供作转化子的选择记号

16、。号。 （3 3）具较高的拷贝数，而）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后且经过氯霉素扩增之后, ,每每个细胞中可累积个细胞中可累积1000100030003000个拷贝。个拷贝。（4 4）对多种常见的限制性）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切内切核酸酶只含有一个能切割的位点。割的位点。 pBR3224363我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物外源外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端连接酶连接酶重组子重组子(ampstetr)

17、空载体空载体(amprtetr) 插入子插入子(ampstets) 野生型的野生型的E.coli (ampstets) 导入导入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重组子转化子重组子转化子(ampstetr) 空载体空载体转化子转化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空载体空载体转化子转化子(amprtetr)因插入外源因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应而导致基因失活的现象称之为插入失活效应对比两个平板上的菌落，凡在对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性

18、克隆，分离出重组质粒。重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2、pUC质粒载体质粒载体1987年，年，J.Messing和和J.Vieria采采用用MCS技术在技术在pBR322基础上构基础上构建的建的结构：结构：（1）来自于）来自于pBR322的的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)

19、。 但核苷酸序列发生了变化但核苷酸序列发生了变化（3） LacZ基因基因 编码编码半乳糖酶的半乳糖酶的肽链即氨基末肽链即氨基末端。端。（4）MCS区段区段是一段用于插入外源是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。个载体中是唯一的。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2、pUC质粒载体质粒载体与与pBR322相比，相比， pU

20、C质粒载体优点：质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数）具有更小的分子量和更高的拷贝数 如如pUC8为为2 750bp，pUCl8为为2 686bp，控制质粒复制，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达基因的缺失，平均每个细胞即可达500700个拷贝个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体）适用于组织化学法检测重组体通过通过 -互补互补作用，利用菌落颜色筛选重组子作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。可以定向克隆防止载体自我连接。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的

21、世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 -互补互补 (alpha-complementation) 大肠杆菌大肠杆菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的 -片段片段和和 -片片段段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶 -片段片段的的LacZ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的

22、编码产生该酶的 片段片段。这样一来，含有功能性完整。这样一来，含有功能性完整的的LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的码的 -片段片段就能和寄主编码的就能和寄主编码的 片段片段发生互补并具有发生互补并具有了对底物了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是象被成为是 alpha-complementation.X-Gal：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有

23、错：表里边有一个活的生物 释放出的蓝色物质可以释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，将整个菌落染成蓝色，非 常 容 易 辨 别 ， 如 果非 常 容 易 辨 别 ， 如 果 LacZ插入外源基因被破插入外源基因被破坏，菌落则是无色的坏，菌落则是无色的 。组织化学法检测重组体组织化学法检测重组体X-Gal -半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG诱导物诱导物异丙基异丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯氯-靛蓝靛蓝我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物二、二、 噬菌体载体噬菌体载

24、体（phage vectors）（一）一） 噬菌体载体噬菌体载体（二）二） M13噬菌体载体噬菌体载体（三）柯斯质粒载体（三）柯斯质粒载体我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性溶菌周期溶菌周期指噬菌体将指噬菌体将DNADNA注入寄主细胞后很快环化，然后注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌

25、体。溶源周期溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体中，注入寄主细胞的噬菌体DNADNA是整合到寄主细是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细溶源性细菌菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNADNA被被称为称为原噬菌体原噬菌体。噬菌体噬菌体温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体烈性噬菌体, ,只具有溶菌生长周期只具有溶菌生长周期我吓了一跳，蝎子

26、是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 组成：组成：蛋白质外壳和蛋白质外壳和线状双链线状双链DNADNA分子组成。分子组

27、成。 DNA长度为长度为48502bp48502bp，在分子两端各有，在分子两端各有1212个碱基的单个碱基的单链互补粘性末端链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNADNA分分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为coscos位位点点（cohesive end sitecohesive end site）. .GGGCGGCGACCT我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也

28、感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2. 噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性是一个温和噬菌体是一个温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。复制复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是溶菌周期的早期是“”复制，晚期进行滚环复制复制，晚期进行滚环复制基因组成基因组成 DNADNA至少包括至少包括6161个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约一部分为噬菌体生命活动的必须基

29、因，另一部分约1 13 3为非必须为非必须区段。区段。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物噬菌体载噬菌体载体类型体类型置换型置换型 （Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的在两个位点之间的DNA区段是区段是噬菌体噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。取代。如如Charon 4 载体克隆能力大，克隆能力大，2025kb插入型插入型 （Insertion vectors

30、）这种载体仅仅有一个可供外源这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。插入的克隆位点。如：如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到克隆能力小，不到10kb 噬菌体载体的噬菌体载体的类型类型我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 Insertion vectors我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Replacement vectors 置换型载体我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什

31、么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（二）（二）M13噬菌体噬菌体 1 1、丝状噬菌体、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性是单链闭合环状噬菌体是单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组外形成丝状，基因组DNA长约长约6.4kb，可分为，可分为10个区和个区和507 bp基因间隔区（基因间隔区（IS区）区），该区可以接受外源该区可以接受外源DNADNA的插入而不会影响到噬菌体的活的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链力。这是该噬菌体能用于单链DNADNA载体的重要前提。载体的

32、重要前提。复制与增殖（图）复制与增殖（图）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物M13噬菌体的复制与增殖噬菌体的复制与增殖“”DNACPCP脱落，脱落，“”DNA复制复制RFDNA“”型复制型复制积累积累200300份份滚环复制滚环复制SSB外溢时被包装外溢时被包装M13噬菌体噬菌体我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2. M13噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建这类载体的这类载体的突出优点突出优点在

33、于其既在于其既可以提供单链可以提供单链DNADNA，也可以提，也可以提供双链的供双链的DNADNA。其。其最大的不足最大的不足在于在于插入大的插入大的DNADNA片段片段后表现后表现不稳定，在噬菌体增殖过程不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以中容易发生缺失。所以一般一般克隆的片段在克隆的片段在1kb1kb之内之内，克，克隆隆300-400bp300-400bp的片段十分稳的片段十分稳定。定。 在在ISIS区内插入区内插入LacLacZ Z基因基因 在标记基因区内组装在标记基因区内组装MCSMCS区段区段所以能通过所以能通过 互补在互补在X-Gal/ IPTGX-Gal/ IPTG平板上

34、平板上识别重组体。这类载体包识别重组体。这类载体包括了括了 M13mp8M13mp8、9 9 和和 M13mp18 M13mp18 、 1919等。等。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（三）柯斯质粒载体（三）柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点 柯斯质粒是一类人工构建的含有柯斯质粒是一类人工构建的含有 DNA的的cos序序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是是cos site carrying pl

35、asmid的缩写。的缩写。柯斯质粒的大小为柯斯质粒的大小为4-6kb，由由3部分组成：部分组成： A.多克隆位点区多克隆位点区 B. 含有含有cos位点的位点的 DNA区区 C. 复制起始位点和抗性标记区复制起始位点和抗性标记区pHC79OriMarkerMCScos DNA我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（三）（三） 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的特性柯斯质粒载体的特性1 1、具有、具有 噬菌体的特性噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外柯斯质粒

36、连接上适宜长度的外源源DNADNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的细胞。进入寄主细胞的DNADNA也能环化和复制，但是不会形成也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2 2、具有质粒载体的特性、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。3 3、高容量的克

37、隆能力、高容量的克隆能力 coscos质粒本身很小，只有复制起质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和点、选择标记和coscos位点等构成，所以其克隆上限可达位点等构成，所以其克隆上限可达45kb45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb30kb。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（三）（三） 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectors）柯斯质粒载体的应用柯斯质粒载体的应用 噬菌体的位点特异切割体系噬菌体的位点特异切

38、割体系末端酶（末端酶（terminase）体系，识别两个相）体系，识别两个相距距38-54kb cos位点，并进行切割，后被包装。位点，并进行切割，后被包装。 下面的操作中缺点是：下面的操作中缺点是：cosmid自我重组、外源自我重组、外源DNA片段串联片段串联 后重组。后重组。OriMarkerMCScos DNA我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物质粒质粒噬菌体噬菌体柯斯质粒柯斯质粒单链噬菌体单链噬菌体克隆克隆DNA大片段大片段*+-构建基因组文库构建基因组文库-+-构建构建DNA文库文库+-常规的亚克隆化常规的亚克隆化+-构建新型的构建新型的DNA结构结构+-序列分析序列分析+-+单链探针单链探针+*-+外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达+-四种常用载体的比较* * 外源外源DNADNA如超过如超过10kb10kb，则重组质粒的转化率和，则重组质粒的转化率和DNADNA得率都非常低得率都非常低* * * 已有个别材料可用于此目的已有个别材料可用于此目的