5.3血红蛋白的提取和分离(共44张PPT).ppt
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1、课题3血红蛋白的提取和分离,一、课题的目标:通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离,理解色谱法、电泳法二、课题重点:凝胶色谱法的原理和方法三、课题难点:样品的预处理、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填,1.分离生物大分子的基本思路:,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2.蛋白质分离和提取的原理:,根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同种类的蛋白质。,凝胶色谱法,基础知识,3、分离方法,凝胶电泳法,2.凝胶:,大多数凝胶是由多糖类化合物(如葡聚糖或琼脂糖)构成的多孔小球体,内部有许
2、多贯穿的通道。,根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,来进行分离。,1.概念:,(一)凝胶色谱法,3.凝胶色谱法的原理,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程,洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,(二)缓冲溶液-洗脱剂,1.概念:,在一定的范围内,凡是能够抵
3、制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响,维持PH基本不变。,2.作用:,(二)缓冲溶液,3.缓冲溶液的配制:,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,4.提问:在本课题中使用的缓冲液是:_,其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和科学研究(活性),磷酸缓冲液,(三)电泳:,1.概念:,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理:,许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的PH下,这些基团会带
4、上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。,阳极(+),阴极(),带正电的离子,带负电的离子,电泳原理示意图,带电性质以及分子大小,形状的不同分子迁移速度不同,从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,1、测定蛋白质分子量:常用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的
5、具有三维网状结构的凝胶。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,2.原理:,SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链,因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,3.SDS作用机理:,二、实验操作实验步骤,血液组成成分,1、样品处理,3、纯化,4、纯度鉴定,2、粗分离,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度,凝胶色谱法进行纯化,用鸡的红细胞提取DNA,用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因
6、是什么?,鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行DNA的提取;,猪、牛、羊等哺乳动物的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,便于提取血红蛋白。,2.血液有哪些成分?,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳,血红蛋白因含有血红素而呈红色。,(1)红细胞的洗涤:,去除,利于后续血红蛋白的分离纯化.,1、采集血样2、低速离心(速度越高和时间越长,会使白细胞等一同沉淀,达不到分离的效果),目的:,操作:,杂质蛋白,短时间,3、吸取血浆:上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤:下层暗红色的红细胞+五倍体积的0.9的NaCl溶液洗涤,搅拌10min5、低速短时间离心:6、
7、重复3、4、5步骤三次上清液中已没有黄色:红细胞洗涤干净。,洗涤次数过少,无法完全除去血浆蛋白。,(2)血红蛋白的释放:,加蒸馏水到原血液体积,,加40体积的甲苯(溶解细胞膜),置于磁力搅拌器搅拌10min(加速细胞破裂),红细胞破裂,释放出血红蛋白,(3)分离血红蛋白溶液:,过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以r/min的速度离心min。,试管中溶液层次:第1层:层(无色透明);第2层:层(白色薄层固体);第3层:层(红色透明液体);第4层:层(暗红色)。,2000,10,甲苯,脂溶性物质沉淀,血红蛋白的水溶液,杂质沉淀,分离:滤纸过滤:除去层,分液漏斗中静置:分出下层的红色透明液体。,脂
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