5.3 血红蛋白的提取和分离课件 （36张PPT）.pptx

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1、科学家发现，猿猴细胞中的TRIM5具有抗HIV-1的作用，它是一种具有3个结构域的胞浆体蛋白质。此后，世界各地的很多科学家开始研究TRIM5蛋白的结构，但到目前为止研究有些进展。研究TRIM5蛋白的第一步是什么？分离和提纯TRIM5蛋白。如何分离和提纯蛋白质？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质、对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离,华师附中汕尾学校杨宇涛,血红蛋白存在于红细胞内；呈红色；运输O2、CO2；本课题选用哺乳动物红细胞作为实验材料。,一、基础知识,（一）蛋白质提取与分离

2、的依据1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度4.吸附性质5.对其他分子亲和力,一、基础知识,（二）方法及原理1.凝胶色谱法：根据相对分子质量的大小分离蛋白质2.电泳法：根据分子带电性质的差异以及分子大小、形状的不同分离蛋白质,一、基础知识,（二）方法及原理1.凝胶色谱法（分配色谱法）：根据相对分子质量的大小分离蛋白质（1）材料：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些球体大多数由多糖类化合物构成，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。如葡聚糖、琼脂糖等。（2）原理：,小蛋白质,大蛋白质,混合物上柱,洗脱,大分子流动快小分子流动慢,收集大分子（先流出）,收集小分子（后流出）,（垂直

3、向下运动）,（无规则扩散运动）,一、基础知识,（二）方法及原理1.凝胶色谱法（分配色谱法）：根据相对分子质量的大小分离蛋白质（1）材料：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些球体大多数由多糖类化合物构成，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。如葡聚糖、琼脂糖等。（2）原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液（洗脱液），促使蛋白质分子的差速流动。,一、基础知识,（二）方法及原理1.凝胶色谱法（分配色谱法）：根据相对分子质量的大小分离蛋白质（3）缓冲液洗脱液概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强

4、碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。配制：通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。,一、基础知识,（二）方法及原理1.凝胶色谱法（分配色谱法）：根据相对分子质量的大小分离蛋白质（3）缓冲液洗脱液配制：通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如内环境中的缓冲液：H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HP

5、O4),目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。,例：相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（）,B,一、基础知识,（二）方法及原理2.电泳法：根据分子带电性质的差异以及分子大小、形状的不同分离蛋白质（1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（3）类型：,由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同,在凝胶中加入SDS

6、，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小,一、基础知识,（二）方法及原理3.凝胶色谱法和电泳法,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,血液,血浆,水分,其他物质：,血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞（最多）,血红蛋白（90）,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.目的：去除杂蛋白（血浆蛋白）2.步骤：血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞5倍体积生理盐水缓慢搅拌10min低速短时离心吸出上清液反复洗涤多次直至上清液无黄色3.注意：洗涤次数：洗涤次数少，无法除

7、去血浆蛋白；离心速度和时间：洗离心速度过高、时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果。,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.原理：渗透作用（红细胞吸水涨破）2.步骤：洗涤好红细胞+蒸馏水再加入40%甲苯磁力搅拌器充分搅拌（10min）3.目的分析：蒸馏水的作用：使红细胞大量吸水胀裂加入甲苯的作用：溶解红细胞的细胞膜充分搅拌的目的：加速红细胞的破裂,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.目的、原理：经过离心使血红蛋白与其他杂质分离2.步骤：红细胞破碎混合液中速长时离心（2000r/min10min）滤纸过滤除去脂溶性沉淀层分液漏斗分离出血红蛋白溶液（红色透明液体）,二、实验

8、操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,洗涤红细胞释放血红蛋白分离血红蛋白,得到血红蛋白溶液,二、实验操作,样品处理粗分离（透析）纯化纯度鉴定,1.目的：除去血红蛋白溶液中分子量较小的杂质。2.原理：渗透作用3.步骤：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,初步纯化的血红蛋白溶液,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平；2.顶塞制作：打孔安装玻璃管；3.

9、底塞制作：打孔挖凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好；4.组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液2.装填：固定色谱柱：色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝胶：根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液：凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀（或凝胶颗粒洗脱液沸水浴）装填悬浮液：一次性缓慢倒入；轻轻敲打洗涤平衡：立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,使凝胶装填紧密,使凝胶装填均匀,如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这

10、些空隙中通过，更不得出现气泡，否则会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。,缓冲液液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。也不能发生缓冲液流干（洗脱液不能断流），露出凝胶颗粒的现象，因为正式洗脱时会有气泡产生。,样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样3.再调液面,4.洗脱,5.收集,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口；2.滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面；3.样品渗入凝胶

11、床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。4.洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度（再调液面），连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。5.收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,高纯度的血红蛋白溶液,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.方法：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,血红蛋白分离的完整过程：血红蛋白提取和分离的程序可分为

12、四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非

13、常直观，大大简化了实验操作。,例：以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是（）A洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢,D,三、操作提示,1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。3.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,

14、四、结果分析与评价,1.血液样品的处理：分层明显样品处理完成。2.凝胶色谱柱的装填：放一支与色谱柱垂直的日光灯直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整装填成功。3.血红蛋白的分离：血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出，分离成功。,练习：已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是（）A.若将样品以2000r/min的速度离心10min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中B.若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快C.将样品装入透析袋中透析12h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内D.若用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远,A,解析：由于戊的分子量小于丙，将样品以2000r/min的速度离心10min，若分子戊存在于沉淀中，则丙也一定在沉淀中，A正确；由于甲蛋白质分子量最小，最容易进入凝胶内部的通道，路程最长，移动的速度最慢，B错误；分子量大小是乙丙，若分子丙保留在袋内，则乙不一定保留在袋内，C错误；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳的迁移速率完全决定于分子大小，甲和丙之间分子量差别最大，因此二者之间的电泳带相距最远，D错误。,