生物化学第34章DNA的复制和修复ppt课件.ppt

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1、第34章 DNA的复制和修复（DNA replication and repair）一、一、DNA的复制的复制二、二、DNA的损伤修复的损伤修复三、三、DNA的突变的突变一、DNA的复制（一）（一）DNA的半保留复制的半保留复制DNA复制的三种可能模式 Conservative Semiconservative dispersiveAfter onegenerationAfter twogenerationsWatson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型oldnewDNA半保留复制的实验证明 1958年，年，Meselson和和Stahl利用利用15N标记大肠标记大肠杆菌杆菌DNA的实验，

2、首先证明了的实验，首先证明了DNA的半保留复制。的半保留复制。他们让大肠杆菌在以他们让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养为唯一氮源的培养基中生长，经过连续培养基中生长，经过连续培养12代，使所有的代，使所有的DNA分分子都标记上子都标记上15N。15N-DNA的密度比普通的密度比普通14N-DNA大，在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种大，在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种DNA。DNA半保留复制的实验证明 这时将大肠杆菌转移到普通培养基（含这时将大肠杆菌转移到普通培养基（含14N）上培养，经过一代以后，所有上培养，经过一代以后，所有DNA的密度都介于的密度都介于15N-DNA和和1

3、4N-DNA之间，说明这时的之间，说明这时的DNA为为14N和和15N的杂合分子。两代后，的杂合分子。两代后，14N分子和杂合分子分子和杂合分子等量出现。当把杂合分子加热，使它们分开成单等量出现。当把杂合分子加热，使它们分开成单链再离心，可见有一半与单链链再离心，可见有一半与单链15N-DNA的密度相的密度相同，另一半与单链同，另一半与单链14N-DNA的密度相同。的密度相同。The Meselson-Stahl experimentDNA extracted and centrifuged to equi- librium in CsCl density gradient（二）DNA复制的起

4、点和方式 DNA上能独立进行复制的单位称为复制子上能独立进行复制的单位称为复制子（replicon），每个复制子都有复制起始点，可能），每个复制子都有复制起始点，可能还有复制的终点。还有复制的终点。DNA复制起始点一般有特定的复制起始点一般有特定的序列，序列，DNA在复制起始点处解开双链，形成一个在复制起始点处解开双链，形成一个复制泡（也叫复制眼）。有些复制泡（也叫复制眼）。有些DNA的复制从复制的复制从复制起始点开始起始点开始向两边复制向两边复制，也有些，也有些DNA的复制从复的复制从复制起始点开始制起始点开始向一边复制向一边复制，它们分别称为，它们分别称为双向复制双向复制和和单向复制单向复

5、制。DNA复制的方向未复制未复制DNA单向复制单向复制双向复制双向复制DNA复制的方向 先将大肠杆菌在含有少量先将大肠杆菌在含有少量3H标记的胸腺嘧啶的培养基中标记的胸腺嘧啶的培养基中培养，然后换到含有大量培养，然后换到含有大量3H标记的胸腺嘧啶的培养基中短时标记的胸腺嘧啶的培养基中短时间培养，放射自显影可以观察到复制叉。间培养，放射自显影可以观察到复制叉。中国仓鼠卵巢细胞DNA复制的电镜照片 大箭头所指大箭头所指为复制泡，小箭为复制泡，小箭头所指为复制叉头所指为复制叉处的单链部分，处的单链部分，注意两个复制叉注意两个复制叉处的单链部分在处的单链部分在相反的链上。相反的链上。各种生物DNA的结

6、构 DNA有线性双链和环状双链的，也有环状单有线性双链和环状双链的，也有环状单链的。原核生物的染色体链的。原核生物的染色体DNA和质粒，以及真核和质粒，以及真核细胞中的线粒体和叶绿体细胞中的线粒体和叶绿体DNA都是双链环状的，都是双链环状的，真核生物的染色体真核生物的染色体DNA是双链线性的。病毒的是双链线性的。病毒的DNA有单链环状的，也有双链环状的，还有双链有单链环状的，也有双链环状的，还有双链线性的。线性的。DNA上复制子的数目 原核生物原核生物染色体染色体DNA和质粒和质粒DNA就是一个复就是一个复制子，从一个复制起始点开始完成整个制子，从一个复制起始点开始完成整个DNA分子分子的复制

7、。真核细胞一个染色体的复制。真核细胞一个染色体DNA上有许多复制上有许多复制子，许多复制起始点同时开始复制，每一个复制子，许多复制起始点同时开始复制，每一个复制起始点完成一段起始点完成一段DNA的复制，然后将各个片段连的复制，然后将各个片段连接起来。接起来。复制起始点的确定 大肠杆菌大肠杆菌染色体染色体DNA只有一个复制起始点。在只有一个复制起始点。在一个生长的群体中几乎所有细胞的染色体都在复制一个生长的群体中几乎所有细胞的染色体都在复制过程中，因此离复制起始点越近的基因拷贝数就越过程中，因此离复制起始点越近的基因拷贝数就越多，也就是出现的频率越高。将从大肠杆菌中提取多，也就是出现的频率越高。

8、将从大肠杆菌中提取出来的出来的DNA切成大约切成大约1%染色体长度的片段，通过分染色体长度的片段，通过分子杂交的方法测定各基因片段的频率，结果表明复子杂交的方法测定各基因片段的频率，结果表明复制起始点制起始点ori C位于基因图谱的位于基因图谱的ilv位点处（位点处（83分附分附近）。一旦复制开始，复制叉向两侧以相等的速度近）。一旦复制开始，复制叉向两侧以相等的速度向前移动。两个复制叉在离起始点向前移动。两个复制叉在离起始点180的的trp位点处位点处（33分附近）会合。分附近）会合。大肠杆菌染色体DNA复制起始点的确定DNA的复制方式直线双向直线双向多起点双向多起点双向（真核细胞染色体）（真

9、核细胞染色体）型双向型双向型单向型单向 大 肠 杆 菌大 肠 杆 菌染色体染色体DNA即即是是双向复制，双向复制，噬菌体的早期噬菌体的早期复制也是复制也是双向双向复制。复制。 DNA的复制方式滚环复制滚环复制噬菌体噬菌体DNA的后期复制即是此种方式。的后期复制即是此种方式。 先以轻链为模板复制一条重链，而原来的亲本重链被置先以轻链为模板复制一条重链，而原来的亲本重链被置换出来称为换出来称为D loop。当。当D loop扩大到整个线粒体扩大到整个线粒体DNA的大约的大约67%的位置时，被置换出来的亲本重链上的轻链复制原点的位置时，被置换出来的亲本重链上的轻链复制原点OL才暴露出来，然后开始轻链

10、的合成。才暴露出来，然后开始轻链的合成。DNA的复制方式D环复制环复制 最典型的最典型的D环复制是哺乳动环复制是哺乳动物线粒体物线粒体DNA的复制。在环状的复制。在环状双链双链DNA的特定位点即重链的的特定位点即重链的复制原点复制原点OH附近，解开双链，附近，解开双链，形成一个复制泡。形成一个复制泡。DNA的复制方式2D环环大肠杆菌的多复制叉染色体DNA酶促合成的引物链和模板链（三）DNA聚合反应有关的酶DNA聚合酶催化的聚合反应5 端端3 端端DNADNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的反应特点 以以4种种dNTP作底物；作底物； 反应需要接受模板的指导；反应需要接受模板的指导； 反应需要有引物反

11、应需要有引物3-羟基存在；羟基存在； DNA链的延长方向为链的延长方向为53； 产物产物DNA的性质与模板相同。的性质与模板相同。大肠杆菌DNA聚合酶 1955年，年，Arthur Kornberg等等发现了发现了大肠杆大肠杆菌菌DNA聚合酶，后来又发现了聚合酶，后来又发现了4种种DNA聚合酶，聚合酶，分别称为分别称为DNA聚合酶聚合酶、和和，它，它们有各自不同的用途。们有各自不同的用途。（DNA polymerase）The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959for their discovery of the mechanisms in t

12、he biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acidSevero OchoaArthur KornbergNew York University, College of Medicine Stanford UniversityThe Nobel Prize in Chemistry 2006for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcriptionRoger D. KornbergStanford University Stanford

13、, CA, USAb. 1947大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶由一条肽链（由一条肽链（928个氨个氨基酸残基）组成，含有一个锌原子，分子量基酸残基）组成，含有一个锌原子，分子量103kD。它是一个多功能酶，具有以下活性：它是一个多功能酶，具有以下活性： 53聚合活性；聚合活性； 35外切活性（校对活性）；外切活性（校对活性）； 53外切活性（只作用于双链外切活性（只作用于双链DNA）；）； 从从3端使端使DNA链发生焦磷酸解（聚合反应的逆反链发生焦磷酸解（聚合反应的逆反应）；应）； 无机焦磷酸盐与无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。之间的焦磷酸基交换。大肠杆菌D

14、NA聚合酶 Klenow片段 用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶，得到，得到C端端324928氨基酸残基氨基酸残基的片段，称为的片段，称为Klenow片段。片段。1-323氨基酸残基为氨基酸残基为小片段。小片段具有小片段。小片段具有53外切活性，外切活性，Klenow片段具有聚合酶活性和片段具有聚合酶活性和35外切活性。外切活性。酶切位点酶切位点Klenow片段片段Klenow片段的立体结构蓝色为模蓝色为模板链，红板链，红色为引物色为引物链。链。Klenow片段的活性位点DNA聚合酶的校对作用 在在正常聚合条件下，正常聚合条件下，35外切活性

15、不能作用于外切活性不能作用于生长链；一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，生长链；一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，生长链的生长链的3末端核苷酸落入末端核苷酸落入35外切活性位点，错外切活性位点，错配核苷酸被迅速切去，然后继续进行聚合反应。配核苷酸被迅速切去，然后继续进行聚合反应。 35外切活性起着校对的作用。外切活性起着校对的作用。 校对作用越强，校对作用越强，DNA复制的准确性越高。适当复制的准确性越高。适当的错配有利于发生突变，有利于物种的进化。突变率的错配有利于发生突变，有利于物种的进化。突变率太高也不利于保持物种的稳定性。太高也不利于保持物种的稳定性。DNA聚合酶的切口平移作用关

16、于大肠杆菌DNA聚合酶的研究 根据对根据对各种各种DNA聚合酶在大肠杆菌细胞中的活聚合酶在大肠杆菌细胞中的活性、合成性、合成DNA的速度、该酶基因突变对的速度、该酶基因突变对DNA复制的复制的影响的研究，发现影响的研究，发现DNA聚合酶聚合酶是大肠杆菌细胞中是大肠杆菌细胞中DNA复制的主酶，而复制的主酶，而DNA聚合酶聚合酶和和的功能只是的功能只是参与参与DNA损伤的修复。损伤的修复。大肠杆菌中3种DNA聚合酶性质的比较项项 目目聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶53聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性相对分子量（相对分子量（103）1031038888830

17、830一个细胞内分子数一个细胞内分子数400400？10102020生物学活性生物学活性1 10.050.051515聚合速度（核苷酸聚合速度（核苷酸/分）分）10001000200020002 2,4004001515,0000006060,000000持续合成能力持续合成能力3 32002001 1,500500 500500,000000功能功能切除引物，修复切除引物，修复修复修复复制复制大肠杆菌DNA聚合酶亚基亚基分子量分子量亚基数目亚基数目亚基功能亚基功能132,0002聚合活性聚合活性27,000235外切校对活性外切校对活性10,0002组建核心酶组建核心酶71,0002核心酶二

18、聚化核心酶二聚化52,0002依赖依赖DNA的的ATP酶，形成酶，形成复合物复合物35,0001可与可与亚基结合，形成亚基结合，形成复合物复合物33,0001形成形成复合物复合物15,0001形成形成复合物复合物12,0001形成形成复合物复合物37,0004两个两个亚基形成滑动夹子，以提高酶亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力的持续合成能力DNA聚合酶全酶的结构与与结合结合两个两个亚基各亚基各催化复制叉处催化复制叉处一条链的合成。一条链的合成。二聚体的滑动夹子结构红、绿色各为一个红、绿色各为一个亚基亚基DNA聚合酶和 DNA聚合酶聚合酶和和是在是在1999年才被发现的。年才被发现的。它们

19、的功能是进行易错修复。它们的功能是进行易错修复。DNA连接酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶可以连接切口和粘性末连接酶可以连接切口和粘性末端，端，T4噬菌体噬菌体DNA连接酶除可以连接切口和粘连接酶除可以连接切口和粘性末端外，还可以连接平末端。性末端外，还可以连接平末端。（DNA ligase）DNA的连接类型（四）DNA的半不连续复制 在复制叉处，两条新生链是同时合成的，新在复制叉处，两条新生链是同时合成的，新生链延伸的方向一条是生链延伸的方向一条是53，而另一条是，而另一条是35，这就不符合，这就不符合DNA聚合酶催化反应的性质。聚合酶催化反应的性质。为了解决这个矛盾，日本学者冈崎等提出了为

20、了解决这个矛盾，日本学者冈崎等提出了DNA的不连续复制模型，认为的不连续复制模型，认为35走向的新生走向的新生DNA链实际上是由许多链实际上是由许多53方向合成的片段连方向合成的片段连接起来的。接起来的。DNA复制叉处的前导链和滞后链 53链是连续合成的，链是连续合成的， 35链是不连续链是不连续合成的，因此称为半不连续复制。合成的，因此称为半不连续复制。冈崎片段的发现 1968年，冈崎等用年，冈崎等用3H-脱氧胸苷标记脱氧胸苷标记T4噬菌体感噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的产

21、物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子，最初出现的片段，接着出现较大的分子，最初出现的DNA片片段的长度约为段的长度约为1000个核苷酸左右，这种片段称为冈崎个核苷酸左右，这种片段称为冈崎片段（片段（Okazaki fragment）。用）。用DNA连接酶变异的温连接酶变异的温度敏感株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有度敏感株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有大量大量DNA片段积累。这些实验都说明在片段积累。这些实验都说明在DNA复制的过复制的过程中，首先合成较短的片段，然后再由连接酶连接成程中，首先合成较短的片段，然后再由连接酶连接成大分子大分子DNA。原核

22、生物和真核生物的冈崎片段 细菌细菌的冈崎片段长度为的冈崎片段长度为10002000个核苷个核苷酸，相当于一个顺反子（酸，相当于一个顺反子（cistron）的长度；真）的长度；真核生物的冈崎片段长度为核生物的冈崎片段长度为100200个核苷酸，个核苷酸，相当于一个核小体相当于一个核小体DNA的长度。的长度。DNA复制中的引物 由于由于DNA聚合酶必须在已有的核酸链的聚合酶必须在已有的核酸链的3-羟基上羟基上延伸新链，所以在前导链合成开始时以及滞后链的每延伸新链，所以在前导链合成开始时以及滞后链的每一个冈崎片段开始时都需要有引物。一个冈崎片段开始时都需要有引物。 RNA聚合酶以聚合酶以DNA为模板

23、合成为模板合成RNA的过程称为的过程称为转录，转录是不需要引物的。转录，转录是不需要引物的。DNA复制的引物就是小复制的引物就是小片段的片段的RNA，这个，这个RNA引物的合成是由引物合成酶催引物的合成是由引物合成酶催化合成的。化合成的。RNA引物的长度通常为几个核苷酸至十几引物的长度通常为几个核苷酸至十几个核苷酸。个核苷酸。（六）DNA复制的过程DNA ligase DNA polymeraseOld Okazaki fragmentOkazaki fragmentPrimerLagging strand templatePrimerHelicase/primaseNewly synthes

24、ized leading strandDimeric replicative DNA polymerasesubunit“ sliding clamp”SSBLeading strand templateDNA gyraseDNA复制叉处的结构复制叉处的结构PrimerDNA复制时涉及的部分酶和蛋白质Gyrase：拓扑异构酶：拓扑异构酶，旋转酶。，旋转酶。 Helicase：解旋酶。：解旋酶。SSB（single-stranded DNA binding protein）：）： 单链单链DNA结合蛋白。结合蛋白。Primase：引发酶，引物合成酶。引发酶，引物合成酶。Primer：引物。引物。

25、 拓扑异构酶 拓扑异构酶可以拓扑异构酶可以改变改变DNA双螺旋的连环数，其双螺旋的连环数，其功能是引入超螺旋或解开超螺旋。功能是引入超螺旋或解开超螺旋。 拓扑异构酶可拓扑异构酶可分为两类：类型分为两类：类型的酶能使的酶能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需提供能量；的一条链发生断裂和再连接，反应无需提供能量；类型类型的酶能使的酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由接，当它引入超螺旋时需要由ATP提供能量。提供能量。拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶属于类型属于类型。它只能消除负超螺。它只能消除负超螺旋，对正超螺旋不起作用。旋，对正超螺旋不

26、起作用。 拓扑异拓扑异构酶在使构酶在使DNA的一条链断裂时，由于酶的一条链断裂时，由于酶与与DNA结合，结合，DNA链不能自由转动，超螺旋的扭曲链不能自由转动，超螺旋的扭曲张力不会自动消失。但是酶分子可牵引另一条链通张力不会自动消失。但是酶分子可牵引另一条链通过切口，然后使断链重新连接起来，从而改变过切口，然后使断链重新连接起来，从而改变DNA的连环数和超螺旋数。的连环数和超螺旋数。拓扑异构酶 拓 扑 异 构 酶拓 扑 异 构 酶 属 于 类 型属 于 类 型 ， 又 叫 旋 转 酶， 又 叫 旋 转 酶（gyrase）。它可连续引入负超螺旋，反应需要消）。它可连续引入负超螺旋，反应需要消耗耗

27、ATP。在无。在无ATP存在时，它可以松弛负超螺旋，存在时，它可以松弛负超螺旋，但不作用于正超螺旋。但不作用于正超螺旋。 大肠杆菌旋转酶由两个大肠杆菌旋转酶由两个A亚基和两个亚基和两个B亚基组成，亚基组成，A亚基是抗萘啶酮酸和奥啉酸的作用位点，亚基是抗萘啶酮酸和奥啉酸的作用位点，B亚基是亚基是抗香豆霉素抗香豆霉素A1和新生霉素的作用位点。这些抗生素和新生霉素的作用位点。这些抗生素均能抑制均能抑制DNA复制，因而推测旋转酶对复制，因而推测旋转酶对DNA复制是复制是必需的。必需的。旋转酶的作用机制解旋酶（helicase） 解旋酶解旋酶能将能将DNA两条链解开，每解开一对碱基，两条链解开，每解开一

28、对碱基，需要水解需要水解2分子分子ATP。大肠杆菌有许多种解旋酶，其。大肠杆菌有许多种解旋酶，其中解旋酶中解旋酶、可以沿着模板链的可以沿着模板链的53方向方向移动，而移动，而rep蛋白则沿着蛋白则沿着35方向移动。过去认为方向移动。过去认为在在DNA复制中，这两种酶配合作用解开复制中，这两种酶配合作用解开DNA双链，双链，但上述酶经诱变并不影响但上述酶经诱变并不影响DNA的复制。的复制。DnaB蛋白 曾经分离出一些大肠杆菌曾经分离出一些大肠杆菌DNA复制的温度敏复制的温度敏感突变株。其中一株当培养温度由感突变株。其中一株当培养温度由30升高到升高到40时，时，DNA复制立即停止，分析表明复制立

29、即停止，分析表明dnaB基因发生基因发生了温度敏感突变。该基因产物了温度敏感突变。该基因产物DnaB是一种解旋酶，是一种解旋酶，可沿可沿DNA链链53 方向移动，由方向移动，由ATP提供能量。这提供能量。这就证明该解旋酶参与就证明该解旋酶参与DNA的复制。的复制。单链DNA结合蛋白 大肠杆菌的单链大肠杆菌的单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）由）由4个相同的亚基组成，个相同的亚基组成，它的功能是与已经解开的单链它的功能是与已经解开的单链DNA结合，阻止重新结合，阻止重新形成双链，保护单链部分不被核酸酶降解。形成双链，保护

30、单链部分不被核酸酶降解。 原核生物的原核生物的SSB蛋白与单链蛋白与单链DNA的结合有正协同的结合有正协同效应，当第一个效应，当第一个SSB蛋白结合后，后面的蛋白结合后，后面的SSB蛋白的蛋白的结合力可提高结合力可提高103倍。因此一旦结合反应开始，全部倍。因此一旦结合反应开始，全部单链单链DNA迅速被迅速被SSB覆盖。但真核生物的覆盖。但真核生物的SSB蛋白没蛋白没有这种协同作用。有这种协同作用。大肠杆菌染色体oriC的结构DNA复制的起始超螺旋超螺旋模板模板起始起始复合物复合物DnaA 四聚体四聚体靠近结合位点靠近结合位点DnaA 四聚体结四聚体结合在结合位点上合在结合位点上13-bp s

31、egments 9-bp segments20-40 moreDnaA 单体单体oriC被多被多个个DnaA缠缠绕绕DNA复制的起始开放开放复合物复合物DnaB6DnaC6六聚物六聚物DnaCsubunitsDnaBsubunitsOpen oriC regionDnaT开放的复制起始区开放的复制起始区DNA复制的起始DnaB有解旋有解旋酶活性，它每酶活性，它每解开一个碱基解开一个碱基对需要消耗对需要消耗2个个ATP。预引发预引发复合物复合物SSB 结合到单链结合区结合到单链结合区打开打开 DnaA富集区域富集区域SSBDnaBsubunitDnaBsubunitOpen region引发和复

32、制引发和复制DNA复制体的装配DnaB complexDnaB complexEnd of oriCDnaAtetramerdisplacedDnaAtetramerdisplacedPrimasePrimosomeSSB tetramer onSingle-strand DNAPrimase, PriA, PriB, PriCPriB, PriCDNA复制体的装配滞后链滞后链RNA前导链前导链RNA 引物引物DnaAtetramerdisplacedDnaAtetramerdisplaced前导链前导链RNA 引物引物滞后链滞后链RNADNA复制体的装配DNA聚合酶聚合酶 最后一个最后一个D

33、naA四聚四聚物被置换物被置换DNA聚合酶聚合酶 岗琦片段的连接DNA polymerase DNA ligaseDNA连接酶催化的反应DNA复制叉的延伸Leading strand “core” DNA polymerase 2 SSB Rep proteinLeading Laggingstrand strand1st RNA primerLagging strand “core” DNA polymerase 3rd RNA primer (most recent)PrimosomeHelicase 2nd RNA primerGrowingOkazaki fragmentDNA复制的终

34、止 Ter位点是一个位点是一个20bp的短序列，其中含有一个保守核心的短序列，其中含有一个保守核心GTGTGTTGT，Tus蛋白与蛋白与Ter位点结合后起终止复制叉前位点结合后起终止复制叉前进的作用。进的作用。DNA复制的终止DNA topoisomerase （七）真核生物DNA的复制 真真核生物染色体有多个复制起始点。核生物染色体有多个复制起始点。 5-氟脱氧氟脱氧尿苷是细胞内胸腺嘧啶核苷酸合成的抑制剂，用尿苷是细胞内胸腺嘧啶核苷酸合成的抑制剂，用5-氟脱氧尿苷处理真核生物的培养细胞可以抑制氟脱氧尿苷处理真核生物的培养细胞可以抑制DNA复制，随后加入复制，随后加入3H-脱氧胸苷就可以使脱氧

35、胸苷就可以使DNA复制同复制同步化。复制进行大约步化。复制进行大约30分钟，然后制成分钟，然后制成DNA的放射的放射自显影图像，在电子显微镜下观察，可以看到很多自显影图像，在电子显微镜下观察，可以看到很多复制眼，每个复制眼都有独立的起点，并呈双向延复制眼，每个复制眼都有独立的起点，并呈双向延伸。通过测量和换算，可以估算出复制子的大小。伸。通过测量和换算，可以估算出复制子的大小。真核生物的复制子 哺乳动物的复制哺乳动物的复制子大多在子大多在100200kb之间。之间。人的细胞有人的细胞有23对染色体，单倍体基因组大约有对染色体，单倍体基因组大约有3109bp,平均每个染色体有平均每个染色体有10

36、00个复制子。果个复制子。果蝇或酵母的复制子较小，平均为蝇或酵母的复制子较小，平均为40kb。真核DNA的复制速度 真核真核生物生物DNA的复制速度比原核生物慢。大肠的复制速度比原核生物慢。大肠杆菌杆菌DNA复制叉的移动速度为复制叉的移动速度为50,000bp/min，哺乳，哺乳类动物复制叉的移动速度仅为类动物复制叉的移动速度仅为10003000bp/min。但因真核细胞染色体有许多复制起始点同时起始复但因真核细胞染色体有许多复制起始点同时起始复制，所以总的复制速度并不慢。制，所以总的复制速度并不慢。哺乳动物的DNA聚合酶DNA聚合聚合酶酶（）DNA聚合聚合酶酶（）DNA聚合聚合酶酶（M）DN

37、A聚合聚合酶酶（）DNA聚合聚合酶酶（）定位定位细胞核细胞核细胞核细胞核线粒体线粒体细胞核细胞核细胞核细胞核亚基数目亚基数目41221外切酶活性外切酶活性无无无无35外切酶外切酶35外切酶外切酶35外切酶外切酶引物合成酶活性引物合成酶活性有有无无无无无无无无持续合成能力持续合成能力中等中等低低高高有有PCNA时高时高高高抑制剂抑制剂蚜肠霉素蚜肠霉素双脱氧双脱氧TTP双脱氧双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素蚜肠霉素功能功能引物合成引物合成修复修复线粒体线粒体DNA合成合成核核DNA合成合成修复修复PCNA：proliferating cell nuclear antigen，增殖细胞核抗原增殖

38、细胞核抗原细菌和真核生物复制体的组成组组 成成细细 菌菌真核生物真核生物复制酶复制酶DNA聚合酶聚合酶全酶全酶DNA聚合酶聚合酶进行性因子进行性因子夹子夹子PCNA定位因子定位因子复合物复合物RF-C引物合成酶引物合成酶BnaGDNA聚合酶聚合酶去除引物去除引物RNase H和和DNA聚合酶聚合酶RNase H1和和MF-1滞后链修复滞后链修复DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶连接酶解旋酶解旋酶DnaB（定位需要（定位需要DnaC）T抗原抗原消除拓扑张力消除拓扑张力旋转酶旋转酶拓扑异构酶拓扑异构酶单链结合单链结合SSBRP-APCNA同源三聚体夹子真核染

39、色体末端的复制 对于线性对于线性DNA的复制，两条新链的复制，两条新链5末端的引末端的引物切除后出现缩短现象，这种现象会使染色体不物切除后出现缩短现象，这种现象会使染色体不稳定。稳定。真核染色体末端的复制 为了解决这个问题，染色体的两端有一段特殊为了解决这个问题，染色体的两端有一段特殊序列，称为端粒（序列，称为端粒（telomeres）。端粒由许多短序列）。端粒由许多短序列的串联重复组成。原生动物四膜虫端粒的重复序列的串联重复组成。原生动物四膜虫端粒的重复序列为为TTGGGG，人的端粒重复序列为，人的端粒重复序列为TTAGGG。TG链比其互补链更长，形成有数百个核苷酸的链比其互补链更长，形成有

40、数百个核苷酸的3突出突出末端。端粒的长度从原生动物的数十末端。端粒的长度从原生动物的数十bp到哺乳动物到哺乳动物的数万的数万bp。 端粒可防止染色体间末端连接，并可补偿滞后端粒可防止染色体间末端连接，并可补偿滞后链链5末端在消除末端在消除RNA引物后造成的短缺。引物后造成的短缺。端粒酶（telomerase） 端粒酶是一种含有端粒酶是一种含有RNA的逆转录酶，它以自身的逆转录酶，它以自身携带的携带的RNA为模板来合成为模板来合成DNA的端粒结构，以延长的端粒结构，以延长缩短了的端粒。四膜虫端粒酶的缩短了的端粒。四膜虫端粒酶的RNA为为159个碱基，个碱基，含有含有CAACCCCAA序列。端粒酶

41、可结合到染色体端序列。端粒酶可结合到染色体端粒的粒的3末端上，末端上，RNA模板的模板的5末端识别末端识别DNA的的3末末端碱基并与之配对，并在端碱基并与之配对，并在DNA 3末端的羟基上延伸末端的羟基上延伸合成新的重复序列。合成合成新的重复序列。合成1个重复单位后酶向前移动个重复单位后酶向前移动一个重复单位，继续延长一个重复单位，继续延长DNA的的3末端。当末端。当3突出突出足够长时，就可以在其互补链上增加一个冈崎片段足够长时，就可以在其互补链上增加一个冈崎片段的合成。这样两条链都得到了延长。的合成。这样两条链都得到了延长。新生链5 5端的短缺和端粒酶延长端粒的功能真核染色体端粒的延长细胞的

42、寿命与端粒的关系 在动物的生殖细胞中，由于端粒酶的存在，在动物的生殖细胞中，由于端粒酶的存在，端粒一直保持着一定的长度。体细胞随着分化而端粒一直保持着一定的长度。体细胞随着分化而失去端粒酶活性，在缺乏端粒酶活性时，细胞连失去端粒酶活性，在缺乏端粒酶活性时，细胞连续分裂使得端粒不断缩短，短到一定程度即引起续分裂使得端粒不断缩短，短到一定程度即引起细胞生长停止或凋亡。细胞生长停止或凋亡。 实验表明，经过多代培养的细胞其染色体的实验表明，经过多代培养的细胞其染色体的端粒变短，染色体也变得不稳定。但在肿瘤细胞端粒变短，染色体也变得不稳定。但在肿瘤细胞中却有端粒酶活性。中却有端粒酶活性。二、DNA的损伤

43、修复 尽管尽管DNA聚合酶有校对功能，聚合酶有校对功能，DNA在复制在复制过程中，仍可能产生错配；其他内因、外因也会过程中，仍可能产生错配；其他内因、外因也会造成造成DNA的损伤，如紫外线照射、电离辐射、的损伤，如紫外线照射、电离辐射、化学诱变剂、病毒化学诱变剂、病毒DNA的整合、的整合、DNA重组等。重组等。DNA损伤会引起生物突变，甚至导致死亡。在损伤会引起生物突变，甚至导致死亡。在一定的条件下，生物机体能使其一定的条件下，生物机体能使其DNA的损伤得的损伤得到修复。这种修复是生物在长期进化过程中获得到修复。这种修复是生物在长期进化过程中获得的一种保护功能。的一种保护功能。DNA损伤修复的

44、种类 目前已经知道，细胞对目前已经知道，细胞对DNA损伤的修复系损伤的修复系统有统有5种：种： 错配修复（错配修复（mismatch repair） 直接修复（直接修复（direct repair） 切除修复（切除修复（excision repair） 重组修复（重组修复（recombination repair） 易错修复（易错修复（error-prone repair）（一）错配修复 DNA在复制过程中发生错配，如果新合成的链在复制过程中发生错配，如果新合成的链被校正，基因编码的信息可得到恢复；但是如果模被校正，基因编码的信息可得到恢复；但是如果模板链被校正，突变就被固定。细胞错配修复系统

45、能板链被校正，突变就被固定。细胞错配修复系统能够区分够区分“旧链旧链”和和“新链新链”。Dam甲基化酶可使甲基化酶可使DNA的的GATC序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位甲基化。复制后位甲基化。复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列，序列，错配修复系统一旦发现错配碱基，即将未甲基化的错配修复系统一旦发现错配碱基，即将未甲基化的新链切除，并以甲基化的旧链为模板进行修复合成。新链切除，并以甲基化的旧链为模板进行修复合成。错配修复 在大肠杆菌中，在大肠杆菌中，Mut S二聚体识别并结合到二聚体识别并结合到DNA的错配碱基部位，的错配碱基部位，Mut L与

46、与Mut S结合，二者组结合，二者组成的复合物可沿着成的复合物可沿着DNA双链向两个方向移动，双链向两个方向移动，DNA由此形成突环。复合物的移动需要水解由此形成突环。复合物的移动需要水解ATP提供能提供能量。当遇到量。当遇到GATC序列时，序列时，Mut H核酸内切酶结合到核酸内切酶结合到Mut SL上，并在未甲基化的新链上，并在未甲基化的新链GATC的的5端切断。端切断。错配修复 如果切开处位于错配碱基的如果切开处位于错配碱基的3侧，由核酸外切侧，由核酸外切酶酶或核酸外切酶或核酸外切酶沿沿35方向切除核酸链，如果方向切除核酸链，如果切开处位于错配碱基的切开处位于错配碱基的5侧，则由核酸外切

47、酶侧，则由核酸外切酶或或Rec J沿沿53方向切除核酸链。在此切除过程中，方向切除核酸链。在此切除过程中，解旋酶和解旋酶和SSB帮助链的解开。切除的链可长达帮助链的解开。切除的链可长达1000个核苷酸以上，直到将错配碱基切除。新的个核苷酸以上，直到将错配碱基切除。新的DNA链链由由DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶合成并连接。连接酶合成并连接。DNA的甲基化replicationFor a short period following replication, the template strand is methylated and the new strand is not.Hemimet

48、hylated DNAMethylated DNADam methylases错配修复(寻找切割位点)Mut SMut L错配修复(寻找切割位点)Mut HMut H cleaves the unmodified strand错配修复（切除和合成）Mut SMut LMut HMutL- -MutSDNA helicase exonuclease or RecJ nucleaseDNA polymerase SSBMutL- -MutSDNA helicase exonuclease or exonuclease DNA polymerase SSB（二）直接修复 紫外线照射可以紫外线照射可以

49、使使DNA分子中同一条链上相分子中同一条链上相邻的两个胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体。其它嘧邻的两个胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体。其它嘧啶碱基之间也能形成类似的二聚体，但数量较少。啶碱基之间也能形成类似的二聚体，但数量较少。嘧啶二聚体的形成，影响了嘧啶二聚体的形成，影响了DNA的双螺旋结构，的双螺旋结构，使其复制和转录功能均受到阻碍。使其复制和转录功能均受到阻碍。嘧啶二聚体的结构嘧啶二聚体的光复活直接解开嘧啶二聚体直接解开嘧啶二聚体O6-甲基鸟嘌呤的修复 O6-甲基化的鸟嘌呤在甲基化的鸟嘌呤在O6-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶作用下，可将甲基转移到酶甲基转移酶作用下，可将甲基转移到酶自身的

50、半胱氨酸残基上。甲基转移酶因此而自身的半胱氨酸残基上。甲基转移酶因此而失活，但却成为其自身基因和另一些修复酶失活，但却成为其自身基因和另一些修复酶基因转录的活化物，促进它们表达。基因转录的活化物，促进它们表达。（三）切除修复 切除切除修复就是在一系列酶的作用下，将修复就是在一系列酶的作用下，将DNA分分子中受损伤的部分切掉，然后以完整链为模板，合子中受损伤的部分切掉，然后以完整链为模板，合成出切掉的部分，使成出切掉的部分，使DNA恢复正常的过程。恢复正常的过程。 一些糖苷酶能够识别错误的碱基，将这些碱基一些糖苷酶能够识别错误的碱基，将这些碱基水 解 ， 使 得 这 些 部 位 无 碱 基 （水