第三章-基因工程载体ppt课件.ppt

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1、DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具 基因的剪刀（分子手术刀）基因的剪刀（分子手术刀） 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 基因的针线（分子缝合针）基因的针线（分子缝合针） DNA连接酶连接酶 基因的运输工具（分子运输车）基因的运输工具（分子运输车） 载体载体第三章基因工程载体第三章基因工程载体第一节克隆载体第一节克隆载体 第二节表达载体第二节表达载体 第三节其它特殊用途载体第三节其它特殊用途载体本章重点掌握的内容1. 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、粒、-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。互补、插入失活、人工染色体载体的概念。

2、2. 克隆载体应具备的条件。克隆载体应具备的条件。 3. 质粒的基本性质。质粒的基本性质。 4. 标记基因的分类及其作用。标记基因的分类及其作用。 5. 原核表达载体的表达元件，有哪几种表达方式。原核表达载体的表达元件，有哪几种表达方式。 基因工程流程图基因工程流程图 遗传物质遗传物质 + + 载体载体 重组的重组的DNADNA分子分子 引入细胞或生物体内引入细胞或生物体内 复制与表达复制与表达 稳定地遗传给下代稳定地遗传给下代 1）独立的一个基因或）独立的一个基因或DNA片段，片段，不能自我复制，一般不可以进入受不能自我复制，一般不可以进入受体细胞的；体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，

3、也不）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。容易在受体细胞内维持。 基因工程基因工程载体（载体（vector）：）：能够把能够把外源外源DNA片段带入受体细胞并进行片段带入受体细胞并进行稳定遗传的稳定遗传的DNA或或RNA分子。分子。 载体的概念载体的概念Recombinant vectorTransformation of bacterial host cellCell propagation载体的功能载体的功能载体的功能载体的功能 u运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞 u为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力 u为外源基因的扩增或

4、表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体的要求载体的要求A A、复制起点：能在受体中复制；、复制起点：能在受体中复制；B B、筛选标记；、筛选标记；C C、限制性内切酶切割位点；、限制性内切酶切割位点；D D、外源基因的表达：启动子。、外源基因的表达：启动子。E E、载体的大小：原则上要求载体越小越好；、载体的大小：原则上要求载体越小越好；F F、适当的拷贝数；、适当的拷贝数；G G、载体的安全性：质粒不能随便转移、载体的安全性：质粒不能随便转移; ;载体的分类载体的分类按功能分类按功能分类 克隆载体克隆一个基因或克隆载体克隆一个基因或DNA片断片断 表达载体用于一个基因的

5、蛋白表达表达载体用于一个基因的蛋白表达 整合载体把一个基因插入到染色体组中整合载体把一个基因插入到染色体组中 按来源分类按来源分类 质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 柯斯质粒载体柯斯质粒载体 人工染色体载体人工染色体载体 第一节第一节 克隆载体克隆载体质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体噬菌体噬菌体-质粒杂合载体质粒杂合载体人工染色体人工染色体一、质粒载体一、质粒载体1.质粒的概念质粒的概念 质粒（质粒（plasmid)是一种存在于细菌或是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型真菌染色体外的小型环状环状双链双链DNA 分分子，可子，可自我复制和表达自我复制和表达。 并不是寄主生长所必需的，但

6、可以赋并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力的能力（带有抗性基因等）（带有抗性基因等） 。 分子量在分子量在1-200kb之间之间 。大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒一、一、 质粒载体质粒载体2.质粒的空间构型质粒的空间构型 共价闭合环状共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA，cccDNA) 呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil） 一、一、 质粒载体质粒载体 开环开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。 线形线形D

7、NA （ linear ，LDNA）一、一、 质粒载体质粒载体同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： SC DNA最快、最快、L DNA次之、次之、OC DNA最慢。最慢。 SC OC L 3. 质粒的基本特性质粒的基本特性 质粒的自主复制性质粒的自主复制性 质粒的不相容性质粒的不相容性 质粒的可转移性质粒的可转移性 携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记一、一、 质粒载体质粒载体一、一、 质粒载体质粒载体a. 质粒的自主复制性质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。复制系统进行自主复制。

8、 质粒质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为拷贝数少，为1-5个个)和和松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达拷贝数多，可达10-200个拷个拷贝贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 质粒质粒 复制子复制子 拷贝数拷贝数 pBR322 及其衍

9、生质粒及其衍生质粒 pMB1 1520 pUC 系列质粒及其衍生质粒系列质粒及其衍生质粒 突变的突变的 pMB1 500700 pSC101 及其衍生质粒及其衍生质粒pSC101 5 ColE1ColE11520一、质粒载体一、质粒载体b. 质粒的不相容性质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性又称质粒的不亲和性) 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群不相容群，一般具有相，一般具有相同的复制子。同的复制子。 以大肠杆菌的质粒为例：

10、以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 一、一、 质粒载体质粒载体c. 质粒的可转移性质粒的可转移性 接合型质粒接合型质粒(含含tra基因基因) 能在天然条件下自发地从一个细胞转移能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随到另一个细胞（接合作用）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先

11、不存在该质粒的受体菌中。其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程不符合基因工程的安全要求的安全要求 非接合型质粒非接合型质粒(不含不含tra基因基因) 不能在天然条件下独立地发生接合不能在天然条件下独立地发生接合作用。作用。 用于构建克隆载体的质粒一般是用于构建克隆载体的质粒一般是非接合型质粒非接合型质粒 。 一、一、 质粒载体质粒载体Tra protein from conjugative plasmidbom siteMob genemob mRNAMob proteinopen recipient cellhelper plasmid部分质粒虽不含部分质粒虽不含tra基因，

12、但含基因，但含bom位点，当宿主细胞内同时存在位点，当宿主细胞内同时存在含含mob基因的辅助质粒时基因的辅助质粒时，mob基因的产物可打开非接合质粒的基因的产物可打开非接合质粒的bom位点位点(oriT位点位点)，借助接合质粒，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用迁移作用(mobilization)。质粒的可转移性质粒的可转移性一、一、 质粒载体质粒载体d. 携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记 野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基上往往携带一个或多个遗传标记基 因

13、，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如：因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 标记基因的作用标记基因的作用 1.指示外源指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子分子是否插入载体分子形成了重组子 2.指示外源指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞一、一、 质粒载体质粒载体标记基因的种类标记基因的种类 1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，C

14、mr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr 2. 营养缺陷标记基因（可直接用于选择转化子）营养缺陷标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这这类基因在酵母转化中使用最频繁，如类基因在酵母转化中使用最频繁，如LEU2，HIS4等。等。 3. 生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如 LacZ 4. 报告基因报告基因 氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶

15、基因（cat）、荧光素酶基因（）、荧光素酶基因（luc）、）、-葡萄糖苷葡萄糖苷酸酶基因（酸酶基因（gus）一、一、 质粒载体质粒载体常用的遗传标记基因常用的遗传标记基因 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ和和lacZ） -半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：白质可分为两部分：链和链和链。前者负责四聚体装配，后者具链。前者负责四聚体装配，后者具-半乳半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用互补

16、作用。 荧光素酶基因荧光素酶基因 荧光素酶是由萤火虫产生的可催化荧光素氧化的酶，并产生荧光。荧光素酶是由萤火虫产生的可催化荧光素氧化的酶，并产生荧光。 一、一、 质粒载体质粒载体-互补互补(-complementation) 蓝白斑筛选蓝白斑筛选一、一、 质粒载体质粒载体互补显色反应互补显色反应蓝白斑筛选蓝白斑筛选 pBR322plasmid作者或实验室名称作者或实验室名称F.Bolivar, R.L.Rodriguez质粒的编号质粒的编号一、一、 质粒载体质粒载体4. 质粒载体的命名质粒载体的命名一、一、 质粒载体质粒载体5.质粒载体构建质粒载体构建 天然存在的野生型质粒由于天然存在的野生型

17、质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。生型质粒为基础进行人工构建。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101 8.8 kb 拷贝数拷贝数 5 四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因 Tcr ColE1 6.5 kb 拷贝数拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RS

18、F2124 ColE1衍生质粒衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因 Ampr A、删除不必要的、删除不必要的DNA区域区域: 尽量缩小质粒的分子量，以提尽量缩小质粒的分子量，以提高外源高外源DNA片段的装载量。片段的装载量。B、减少限制性酶切点、减少限制性酶切点: 缺失突变，限制性酶、核酸外切酶缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。和连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。C、加入易于识别的选择标记：、加入易于识别的选择标记：通过质粒之间的重组，可以通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。使质粒带有合适的选择性

19、标记。D、安全性能改造：、安全性能改造：质粒载体不能在细菌之间随便转移。质粒载体不能在细菌之间随便转移。E、改造或加入基因表达的调控序列：、改造或加入基因表达的调控序列：启动子。启动子。质粒的改造质粒的改造一、一、 质粒载体质粒载体6.常用质粒载体常用质粒载体 pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)复制起点复制起点 遗传标记基因遗传标记基因克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点在一个基因位点中插在一个基因位点中插入外源入外源DNA片段，片段，从而使

20、该基因活性丧从而使该基因活性丧失的现象叫失的现象叫插入失活。插入失活。 TC r（1） pBR322一、一、 质粒载体质粒载体 含有含有pBR322完整的完整的Ampr基因和复基因和复制起始点。制起始点。 含有大肠杆菌含有大肠杆菌 -半乳糖酶基因半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码的启动子及其编码 -肽链的肽链的DNA序列，即序列，即lacZ基因。基因。 在在lacZ基因中靠近基因中靠近5端的一段有端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的区段，但并不破坏该基因的功能。功能。 （2） pUC系列质粒载体系列质粒载体 在在pBR322的基础上改造而成。属的基础上改造而成。属正选择载体正选择载体

21、(转化载体后，阳转化载体后，阳性克隆在有选择压力的培养基上能正常生长性克隆在有选择压力的培养基上能正常生长)，其组成如下：，其组成如下：无质粒的无质粒的受体菌受体菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养质粒质粒pUCpUC转化的受转化的受体菌体菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养pUC+pUC+

22、外源外源DNADNA插入的质粒转插入的质粒转化的受体菌化的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 - -半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养?无菌斑无菌斑生长生长有蓝色有蓝色菌斑生菌斑生长长有白色有白色菌斑生菌斑生长长一、一、 质粒载体质粒载体（3）穿梭质粒载体）穿梭质粒载体(shuttle vector) ：人工构建的、具有人工构建的、具有两种不同复制起点两种不同复制起点和选择标记、可以在和选择标记、可以在两两种不同的寄主细胞种不同的寄主细胞中存活和

23、复制的质粒载体。中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记MCS一、质粒载体一、质粒载体TA克隆载体克隆载体PCR产物克隆载体产物克隆载体 用用Taq酶的酶的PCR产物产物3端加上了一个端加上了一个A。根据这一特点研。根据这一特点研制出一种线性质粒，其制出一种线性质粒，其5端突出的端突出的T，可与，可与Taq酶的酶的PCR产产物间连接，即物间连接，即TA克隆。克隆

24、。 构建方法：构建方法： 如：如：pMD18-T，pGEM-T载体的线性化载体的线性化载体末端补平载体末端补平载体末端加载体末端加T二、噬菌体载体二、噬菌体载体噬菌体（噬菌体（Bacteriophage）它）它本身是一种核蛋白，核心是一段本身是一种核蛋白，核心是一段DNA(线性线性)，结构上有一个蛋白，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的以把噬菌体的DNA注入细菌内。注入细菌内。二、噬菌体载体二、噬菌体载体 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁率高特异性地侵染宿主细

25、胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。定的条件下上述两种状态还会相互转化。 能被开发成为基因工程的有用载体的原因：能被开发成为基因工程的有用载体的原因： 1.高效率的感染性高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；能使外源基因高效导入受体细胞； 2.自主复制繁殖性自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效能使外源基因在受体细胞中高效扩增。扩增。 噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期1.溶菌周期：溶菌周期：烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage) 感染细菌后立即在菌体内复制和感染细菌

26、后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。大量子代噬菌体。2. 溶源周期：溶源周期：温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage) 感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到整合到 细菌的染色体细菌的染色体DNA中，成为它的一个中，成为它的一个组成部分。形成这一过程称为溶源化组成部分。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。二、噬菌体载体二、噬菌体载体二、噬菌体载体二、噬菌体载体1. 噬菌体载体：噬菌体载体： 双链双链DNA温和噬菌体温和

27、噬菌体 DNA大小约为大小约为50kb 粘性末端：粘性末端：12bp的互补单链的互补单链 当当噬菌体进入寄主细胞内后噬菌体进入寄主细胞内后, , 其粘性末端能通过碱基互其粘性末端能通过碱基互补作用补作用, , 形成环状形成环状DNADNA分子。粘性末端形成的双链区域称为分子。粘性末端形成的双链区域称为coscos位点位点, , 它是它是包装蛋白的识别位点包装蛋白的识别位点, , 噬菌体的包装与噬菌体的包装与DNADNA特性和其它序列无关特性和其它序列无关, , 但对包装的但对包装的DNADNA大小有要求大小有要求, , 包装范围包装范围大约在大约在36kb-51kb36kb-51kb。 二、噬

28、菌体载体二、噬菌体载体噬菌体作为构建载体材料的依据：噬菌体作为构建载体材料的依据：噬菌体是一种温和噬菌体；能承载比较大的外源噬菌体是一种温和噬菌体；能承载比较大的外源DNA片片段；在段；在噬菌体分子上有许多限制性核酸酶识别位点，便噬菌体分子上有许多限制性核酸酶识别位点，便于多种于多种DNA酶切片段的克隆。酶切片段的克隆。构建构建噬菌体克隆载体的基本策略：噬菌体克隆载体的基本策略：切去部分非必须的区域；切去部分非必须的区域；抹去多余的限制性内切酶切割位点；抹去多余的限制性内切酶切割位点；插入可供选择的标记基因；插入可供选择的标记基因；建立体外包装系统。建立体外包装系统。二、噬菌体载体二、噬菌体载

29、体噬菌体载体的类型噬菌体载体的类型 （1）插入型载体）插入型载体 ：具有单一的酶切位点具有单一的酶切位点, ,可供外源可供外源DNADNA的插的插入。如：入。如：gt10gt10，gt11 gt11 ，ZAPZAP载体。载体。 载体长度载体长度37kb插入位点插入位点体外包装体外包装0-14kb（3751kb）插入片段插入片段体外包装体外包装二、噬菌体载体二、噬菌体载体（2）替换型载体：）替换型载体：有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间的的DNADNA片段，可被外源片段，可被外源DNADNA片段置换。片段置换。如：如： EMBL3， EMBL4二、噬菌体载体

30、二、噬菌体载体-DNA作为载体的特点作为载体的特点 u-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌肠杆菌 u-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装，远远大于质粒的装载量载量构建基因组文库构建基因组文库u-DNA载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适片段，但不适合表达外源基因合表达外源基因 二、噬菌体载体二、噬菌体载体2. M13噬菌体载体：噬菌体载体： 是一种含单链是一种含单链DNA（ssDNA）分子的）分子的丝状噬菌体。丝状噬菌体。 这类载体这类载体主要用来获得大量的单链主要用来获得大量的单链

31、DNA片段片段，主要用来测定，主要用来测定DNA序列序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链变研究、异源双链DNA的分析等。的分析等。二、噬菌体载体二、噬菌体载体 M13噬菌体的特点噬菌体的特点 感染感染E.coli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型后，在宿主细胞内会形成双链的复制型DNA （ replication form DNA, RF-DNA）。可以像质粒）。可以像质粒DNA那那样在体外进行纯化和操作。样在体外进行纯化和操作。 无论是双链的无论是双链的RF-DNA还是单链还是单链ssDNA都能转染都能转染E.coli细胞。细胞。不需繁琐的体外包

32、装，可直接转染宿主。不需繁琐的体外包装，可直接转染宿主。 单纯以噬菌体为基础构建的载体单纯以噬菌体为基础构建的载体: : 装载量大，装载量大， 转染效率高转染效率高, , 操作较难，操作较难， DNADNA不稳定。不稳定。 单纯以质粒为基础构建的载体单纯以质粒为基础构建的载体: : 有天然的抗性选择标记，有天然的抗性选择标记， 操作容易（易于分离和转化），操作容易（易于分离和转化）， 较稳定较稳定, , 装载量小，装载量小， 转化效率较低；转化效率较低； 三、噬菌体三、噬菌体- -质粒杂合载体质粒杂合载体 (一一)黏粒载体黏粒载体 (cosmid) 也称柯斯质粒载体、粘粒。这是一类用于克隆大片

33、段也称柯斯质粒载体、粘粒。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由的载体，它是由噬菌体的噬菌体的cos（cohesive）末端）末端及及质质粒（粒（plasmid）重组而成的载体。重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及制起点、克隆位点、选择性标记以及噬菌体用于包装的噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质导入受体

34、细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒粒DNA的形式存在于细胞内。的形式存在于细胞内。 三、噬菌体三、噬菌体- -质粒杂合载体质粒杂合载体黏粒载体的基本特点黏粒载体的基本特点 具有具有噬菌体的特性噬菌体的特性(体外包装，高效感染等体外包装，高效感染等)； 具有质粒载体的特性具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等易于克隆操作、选择及高拷贝等)； 具有较高容量（具有较高容量（45 kb）的克隆能力；）的克隆能力； 具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。 不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬

35、 菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑 。 主要用于构建基因组文库主要用于构建基因组文库C2XB(6.6 kb)COSCOSSm B HCEAmpr COSpJB8(5.4 kb)PE B ECHSm A三、噬菌体三、噬菌体- -质粒杂合载体质粒杂合载体常用黏粒载体结构图常用黏粒载体结构图 三、噬菌体三、噬菌体- -质粒杂合载体质粒杂合载体(二二) 噬菌粒载体噬菌粒载体 由由质粒质粒载体和载体和单链噬菌体载体单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。结合而成的新型的载体系列。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，

36、方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。生单链的子代噬菌体。常用的噬菌粒载体：常用的噬菌粒载体：pUC118和和pUC119 ，pBluescript噬菌粒载噬菌粒载体体 三、噬菌体三、噬菌体- -质粒杂合载体质粒杂合载体四、人工染色体及其应用四、人工染色体及其应用 人类、动物、植物的全基因组序列人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的的DNA片段片段，

37、 此时柯斯质粒此时柯斯质粒(45kb)和噬菌和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区复制区、分配区分配区、稳定区稳定区与与质粒组装质粒组装在在一起，即可构成染色体载体。当大片段一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，便形成重组人造染色体， 它能像天然染它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传遗传。 或称为自主复制序列(ARS)四、人工染色体及其应用四、人工染色体

38、及其应用 人工染色体载体（人工染色体载体（artificial chromosome vector）:利用染利用染色体的复制元件来驱动外源色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。片段复制的载体。 实际上是一种实际上是一种“穿梭穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体备的第一受体(大肠杆菌大肠杆菌)源质粒复制起始位点源质粒复制起始位点(ori)，还含，还含有第二受体有第二受体(如酵母菌如酵母菌)染色体染色体DNA着丝点、端粒和复制起着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 与其他的克隆与其他的克隆

39、载体相比，人工染色体克隆载体的特点是载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达能容纳长达1000kb-3000kb的外源的外源DNA片段片段。 四、人工染色体及其应用四、人工染色体及其应用 (一一)酵母人工染色体酵母人工染色体 酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母是一类酵母穿梭载体穿梭载体。 YAC具有具有自主复制序列、克自主复制序列、克隆位点隆位点以及可在细菌和酵母菌中以及可在细菌和酵母菌中选择的选择的标记基因标记基因。可以接受。可以接受350-400kb的外源的外源DNA片段。片段。四、人工染色体及其应用四、人工染色体

40、及其应用 (二二)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC) 细菌人工染色体通常是在大肠细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子杆菌性因子F质粒的基础上构建质粒的基础上构建的，其装载量范围在的，其装载量范围在50 - 300 kb之间。之间。 主要适用于构建大片段基因组主要适用于构建大片段基因组文库文库 第二节第二节 表达载体表达载体第二节第二节 表达载体表达载体u 克隆载体（克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克）：主要是对目的基因克隆，建立隆，建立DNA文库和文库和cDNA文库，其上有复制子即文库，其上有复制子即

41、可；可；u 表达载体（表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；更要有强启动子； u 表达载体的类型表达载体的类型 质粒表达载体质粒表达载体 病毒表达载体病毒表达载体 大片段表达载体大片段表达载体u 分类：分类：根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体；达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体；根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达

42、载体和真核细胞表达载体；真核细胞表达载体；第二节第二节 表达载体表达载体（一）原核表达载体（一）原核表达载体真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件：真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件： 具有具有复制起点复制起点，载体能够独立复制，载体能够独立复制 。 应具有灵活的克隆位点和方便的应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记筛选标记，以利于外源基因的克，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。隆鉴定和筛选。 应具有很强的应具有很强的启动子启动子，能为大肠杆菌，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。聚合酶所识别。 应具有应具有阻遏子阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。，使启动子受到控制，

43、只有当诱导时才能进行转录。应具有很强的应具有很强的终止子终止子，只转录克隆的基因，所产生的，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为较为稳定。稳定。所产生的所产生的mRNA必须具有必须具有翻译的起始信号翻译的起始信号AUG和和SD序列序列，以便转，以便转录后顺利翻译。录后顺利翻译。一、质粒表达载体一、质粒表达载体一、质粒表达载体一、质粒表达载体启动子启动子诱导条件诱导条件乳糖操纵子乳糖操纵子 （ lac）IPTG色氨酸启动子（色氨酸启动子（ trp ）Trp-Lac和和trp杂合启动子（杂合启动子（ tac）IPTGT7噬菌体启动子噬菌体启动子(高特异性高特异性)T7噬菌体噬菌体 RNA聚合酶聚

44、合酶 l l噬菌体早期启动子（噬菌体早期启动子（1PL）高温（高温（45） IPTG：异丙基硫代-D-半乳糖苷最佳启动子具备的条件：最佳启动子具备的条件： a.a.强启动子强启动子 b.b.诱导型的（热或化学诱导）诱导型的（热或化学诱导）一、质粒表达载体一、质粒表达载体表达形式表达形式单一型表达：单一基因的编码区，表达完整单一单一型表达：单一基因的编码区，表达完整单一蛋白。蛋白。融合型表达：多个基因的编码区的串联体，表达融合型表达：多个基因的编码区的串联体，表达出融合蛋白出融合蛋白(fusion protein)。 融合标签蛋白：有利于蛋白纯化和检测；融合标签蛋白：有利于蛋白纯化和检测； 融合

45、多个目标蛋白：则类似于直接表达了一个多融合多个目标蛋白：则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。偶连两个或多个相关基因的表达。一、质粒表达载体一、质粒表达载体表达形式表达形式组成型表达：在组成型启动子（如：组成型表达：在组成型启动子（如：T7噬菌体噬菌体启动子）的驱动下即可源源不断的表达外源基因。启动子）的驱动下即可源源不断的表达外源基因。 适合对宿主细胞无毒的蛋白表达。适合对宿主细胞无毒的蛋白表达。诱导型表达：在诱导型启动子和特定环境信号刺诱导型表达：在诱导型启动子和特定环境信号刺激下，外源基因

46、的表达开放或增强。激下，外源基因的表达开放或增强。 适合有毒蛋白表达，无毒蛋白表达也可。适合有毒蛋白表达，无毒蛋白表达也可。 一、质粒表达载体一、质粒表达载体表达融合蛋白的表达载体表达融合蛋白的表达载体 6 6 HisHis（组氨酸）标签表达载体：（组氨酸）标签表达载体：pETpET系列，可系列，可在目标蛋白的在目标蛋白的N-N-端或端或C-C-端加上端加上6 6个组氨酸的标签，个组氨酸的标签，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白。能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白。 GST (glutahione S-transferase, GST (glutahione S-transferase

47、, 谷胱苷肽谷胱苷肽S-S-转移酶转移酶) )表达载体：表达载体：pGEXpGEX系列，融合蛋白纯化出系列，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。一、质粒表达载体一、质粒表达载体一、质粒表达载体一、质粒表达载体 (二二)酵母表达载体酵母表达载体真核表达的首选系统真核表达的首选系统 原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异，原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异， 真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。 酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中繁殖，酵母表达载体是一

48、种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中繁殖，又能在酵母中复制、表达。又能在酵母中复制、表达。 Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记MCS一、质粒表达载体一、质粒表达载体 (三三) Ti质粒表达载体质粒表达载体 Ti质粒（质粒（tumor inducing plasmid)是根癌农杆菌中可引是根癌农杆菌中可引发植物产生瘤状物的质粒，发植物产生瘤状物的质粒，是环状双链是环状双链DNA。 一、质粒表达载体一、质粒表达载体 (三三)Ti质粒表达载体质粒表达载体 T-DNA区：侵染植物时，从区：侵染植物时，从Ti质粒上被切割，转移到植物细

49、质粒上被切割，转移到植物细胞中，带有与肿瘤形成有关的胞中，带有与肿瘤形成有关的基因基因 毒性区（毒性区（vir区）：激活区）：激活T-DNA的转移的转移 接合转移区（接合转移区（Con区）：存在与区）：存在与细菌间进行接合有关的基因细菌间进行接合有关的基因 tra 复制起始区（复制起始区（Ori区）：区）： 保证保证Ti质粒进行自我复制质粒进行自我复制Con区区一、质粒表达载体一、质粒表达载体 (三三)Ti质粒表达载体质粒表达载体 目前己开发出两类转化体系目前己开发出两类转化体系: 一元载体系统一元载体系统(整合载体系统整合载体系统)：由一个含目的基因的中间表达载体与：由一个含目的基因的中间表

50、达载体与改造后的受体改造后的受体(Ti质粒质粒)通过同源重组形成的可穿梭的复合型载体。但通过同源重组形成的可穿梭的复合型载体。但这类方法构建困难，整合体形成这类方法构建困难，整合体形成 率低，一般不常用。率低，一般不常用。 双元载体系统：它由两个分别含有双元载体系统：它由两个分别含有T-DNA和和Vir区的相容性突变区的相容性突变Ti 质质粒，即粒，即:微型质粒微型质粒(mini一一plasmid)和辅助和辅助Ti质粒质粒(helper Ti plastnid)构构成。成。 双元载体系统与一元载体系统相比，构建的操作过程比较简单，无双元载体系统与一元载体系统相比，构建的操作过程比较简单，无共整