蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件.ppt

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1、我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物中南大学湘雅医学院中南大学湘雅医学院 精神卫生精神卫生12011201班班 吴所谓吴所谓 方方 圆圆 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 蛋白质组（蛋白质组（ProteomeProteome）：）： 在一种细胞内存在的全部蛋白质。 蛋白质组研究中主要应用的技术包括：蛋白质组研究中主要应用的技术包括： 双向电泳(2-DE)、 新型质谱(MS)技术、 数据库设置与

2、检索系统等。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物原理Theory 实验操作Method 应用Application 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物+pH 3pH 7.5pH 10第一向：等等电电聚聚焦焦我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物chargesize第二向：SDS-SDS-PAGEPA

3、GE电电泳泳+pH 3pH 7.5pH10我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 样品制备（样品制备（Sample preparationSample preparation） 固相预制胶条的水化（固相预制胶条的水化（IPG strip rehydrationIPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（第一向等电聚焦（IEFIEF） 胶条的平衡（胶条的平衡（IPG strip equilibrationIPG strip equilibration） 第二向第二向SDS-PAGE

4、SDS-PAGE电泳（电泳（SDS-PAGE electrophresisSDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（凝胶的染色及检测（Detection/StainingDetection/Staining） PDQuestPDQuest软件分析（软件分析（Software analysisSoftware analysis） 质谱鉴定（质谱鉴定（Protein identificationProtein identification） 双向电泳实验流程 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错

5、：表里边有一个活的生物样品制备基本原则： 使所有待分析的蛋白样品全部处于使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态溶解状态，制，制备方法应具有备方法应具有可重现性可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。保证待研究蛋白的可检测性。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放

6、在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物可溶性样品可溶性样品 固体组织样品固体组织样品 细胞细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物双向电泳样品的溶解 是成功进行双向电泳的最关键因素之一是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标

7、：溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液；破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰必须允许可能干扰2-DE2-DE分离的盐、脂类、多糖和分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。保证样品在电泳过程中保持溶解状态。 溶解的手段：溶解的手段： 离液剂、去垢剂、还原剂、离液剂、去垢剂、还原剂、两性载体电解质两性载体电解质 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活

8、的生物More Data with Narrow Range IEFpH 3-10pH 3- 6pH 5- 8pH 7-10 Broad Range Separations我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物聚焦时间的优化 要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。 聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在

9、IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物两维间的平衡 等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于80保存数月。 但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物二维SDS-PAGE 同普通SDS-PAGE类似。 但一

10、般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物操作Method 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 样品制备（样品制备（Sample preparationSample preparation） 固相预制胶条的水化（固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration

11、IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（第一向等电聚焦（IEFIEF） 胶条的平衡（胶条的平衡（IPG strip equilibrationIPG strip equilibration） 第二向第二向SDS-PAGESDS-PAGE电泳（电泳（SDS-PAGE electrophresisSDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（凝胶的染色及检测（Detection/StainingDetection/Staining） PDQuestPDQuest软件分析（软件分析（Software analysisSoftware analysis） 质

12、谱鉴定（质谱鉴定（Protein identificationProtein identification） 双向电泳实验流程 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物最高电压最高电压10,000 V10,000 V1010 2525 C C 温度控制温度控制7, 11, 17, 18, 7, 11, 17, 18, 和和 24 cm 24 cm的聚的聚焦盘，可以各放焦盘，可以各放1212根胶条根胶条可以储存可以储存1010个程序，每个程序有个程序，每个程序有1010步步程序可进行时时编辑程序可进行

13、时时编辑可供选配的打印机可供选配的打印机我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物等电聚焦的等电聚焦的操作操作我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有

14、一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物等电聚焦程序的设置7cm7cm胶条胶条水化水化1212小时（小时（1717）被动水化被动水化S1S1250V250V慢速慢速3030分钟分钟除盐除盐S2S21000V1000V快速快速6060分钟分钟除盐除盐S3S34000V4000V线性线性3 3小时小时升压升压S4S44000V4000V快速快速24,0002

15、4,000伏小时伏小时聚焦聚焦28,00028,000伏小时伏小时S5S5500V500V快速快速任意时间任意时间保持保持l l 选择所放置的胶条数。选择所放置的胶条数。l l 设置每根胶条的极限电流。（设置每根胶条的极限电流。（30-5030-50 A/A/根）根）l l 设置等电聚焦时的温度。（设置等电聚焦时的温度。（1717）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物配制SDS-PAGE凝胶l 配制配制12%12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电泳专用梳子；或在上部留泳专

16、用梳子；或在上部留0.5cm0.5cm的空间，的空间，用用MilliQMilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。聚合聚合3030分钟。分钟。l 待凝胶凝固后，拔去梳子，用待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQMilliQ水冲水冲洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正丁醇，用丁醇，用MilliQMilliQ水冲洗，备用。水冲洗，备用。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物胶条的平衡l冰箱中取出的胶条，于室温放置冰箱中取出的胶条，于室温放置

17、1010分钟。分钟。l配制胶条平衡缓冲液配制胶条平衡缓冲液 I I 。l吸去胶条上的矿物油及多余的样品。吸去胶条上的矿物油及多余的样品。l第一次平衡。振荡第一次平衡。振荡1515分钟。分钟。l 配制胶条平衡缓冲液配制胶条平衡缓冲液 II II 。l第二次平衡第二次平衡 ，振荡，振荡1515分钟。分钟。l吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。l琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1 1电泳缓冲液。电泳缓冲液。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有

18、一个活的生物胶条的转移胶条的转移我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑

19、恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物SDS-PAGE电泳l 在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。泳槽中。l 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（低电流（5mA/gel/7cm5mA/gel/7cm），待样品在完全走出），待样品在完全走出IPGIPG胶条，胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm15-20mA/gel/7cm），），待溴酚蓝指示

20、剂达到底部边缘时即可停止电泳。待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。l 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。以作记号（戴手套，防止污染胶面）。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 考马斯亮兰染色考马斯亮兰染色 Bio-Safe染色染色凝胶染色 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 水洗水洗3次，次，5m

21、in/次。次。 Bio-Safe染色染色1小小时。时。 水洗水洗30min.Bio-Safe染色法 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物图像扫描及图像扫描及软件分析软件分析我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Molecular mass (kD) Isoelectric point 1 10 0 201 120 100 56 38 30 20 7 Fig1 上下图分别为正常大鼠和失神经大鼠腓肠肌蛋

22、白双向电泳图谱，右图为左图方框内的局部放大图。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物应用Application 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中挥着重要作用，可双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中挥着重要作用，可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。

23、病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。 目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白质，寻找

24、用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶，质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶，以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。随着蛋白质组学相关技术以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。随着蛋白质组学相关技术的发展，如液相，蛋白质芯片结合技术的的发展，如液相，蛋白质芯片结合技术的应用，蛋白质组学必将得到进一步的发展，并在疾病的发病机制、诊应用，蛋白质组学必将得到进一步的发展，并在疾病的发病机制、诊断和治疗方面发挥重要的作用。蛋白质组双向电泳技术为人类疾病，断和治疗方面发挥重要的作用。蛋白质组双向电泳技术为人类疾病，特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景，必将特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景，必将造福于人类。造福于人类。 谢Thanks