薄层色谱法ppt课件.ppt

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1、1薄层色谱法薄层色谱法2色谱法色谱法3（一）概述（一）概述（二）固定相和展开剂固定相和展开剂薄层色谱法薄层色谱法（thin layer chromatography; TLC)（三）薄层色谱法的基本技术（三）薄层色谱法的基本技术（四）薄层色谱法的应用（四）薄层色谱法的应用4薄层色谱法薄层色谱法（thin layer chromatography; TLC)（一）概述1.背景 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代

2、中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。5薄层色谱法薄层色谱法（TLC)2.方法原理(图示) 薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。 6薄层色谱法薄层色谱法（TLC)7薄层色谱法薄层色谱法（TLC)比移值RfRf1acRf2bc溶剂前沿起始线cba8薄层色谱法薄层色谱法（TLC)比移值比移值(Rf)lRf = 0 表明该组分不被展开剂所溶解，仍停表明该组分不被展

3、开剂所溶解，仍停留在原点。留在原点。lRf = 1表明该组分不被固定相吸附，而随流表明该组分不被固定相吸附，而随流动相同速度移动。动相同速度移动。lRf的合适范围为的合适范围为 :0.2Rf 0.89薄层色谱法薄层色谱法（TLC)3. 特点 l（1）设备简单，操作方便。l（2）快速，展开的时间短。 l（3）适于分析小量样品(一般几到几十微克)，也适于大量样品的分离（可以分离出几毫克甚至几十毫克组分）。 10薄层色谱法薄层色谱法（TLC)（二）固定相和展开剂固定相和展开剂 . .固定相选择固定相选择v柱色谱中所用的吸附剂柱色谱中所用的吸附剂v要求吸附剂的粒度更小。商品吸附剂区分要求吸附剂的粒度更

4、小。商品吸附剂区分为为色谱级（用于柱色谱）色谱级（用于柱色谱）和和薄层色谱级薄层色谱级（用于薄层色谱）。（用于薄层色谱）。 11薄层色谱法薄层色谱法（TLC). .常用的固定相常用的固定相l（1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离。l（2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离 。l（3）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离。l（4）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质。 12薄层色谱法薄层色谱法（TLC).展开剂选择：薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，一般薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，一般根据根据“相似相溶相似相溶”的原理。的原

5、理。当当一种一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用择用混合溶剂混合溶剂作为展开剂。作为展开剂。 13薄层色谱法薄层色谱法（TLC)（三）薄层色谱法的基本技术三）薄层色谱法的基本技术14薄层色谱法薄层色谱法（TLC)制板（以硅胶板为例）制板（以硅胶板为例） 选择合适的玻璃板，依次用水和乙醇洗选择合适的玻璃板，依次用水和乙醇洗净，晾干。取适量薄层色谱用的硅胶，加净，晾干。取适量薄层色谱用的硅胶，加适量蒸馏水调成糊。调制时慢慢搅拌，勿适量蒸馏水调成糊。调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。将硅胶倒在玻璃板上，摇动使产生气泡。将硅胶倒在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱

6、内，在摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在105-115oC左右烘干左右烘干40-50分钟。冷却后使用。分钟。冷却后使用。15薄层色谱法薄层色谱法（TLC) 点样点样 将试样用最少量展开剂溶解，用毛细将试样用最少量展开剂溶解，用毛细管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量过多过多。 16点样方法：点样方法：注：动作要轻，注：动作要轻， 毛细管或点样器不能混用，毛细管或点样器不能混用， 斑点大小适当，可多次点样。斑点大小适当，

7、可多次点样。平头平头50ul50ul微量点样器微量点样器全自动点样仪全自动点样仪点样基线：距底边点样基线：距底边2.0cm2.0cm样点直径：样点直径：2-4mm2-4mm点间距离：点间距离：1.5-2.0cm1.5-2.0cm17薄层色谱法薄层色谱法（TLC)l 展开展开 吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖展开瓶中。展开剂要接触到吸附剂下沿，展开瓶中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。但切勿接触到样点。l 盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定时盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定时间（由试验确定适当的展开高度），取出间（由试验确定适当的展开高度），取出

8、薄层板，标记展开剂的前沿线薄层板，标记展开剂的前沿线。18l展开方式：上行展开展开方式：上行展开 过程：预饱和（滤纸贴于展开槽内侧）、展开、标记过程：预饱和（滤纸贴于展开槽内侧）、展开、标记溶剂前沿溶剂前沿薄层色谱法（薄层色谱法（TLC)19薄层色谱法薄层色谱法（TLC)l展开方式：下行展开展开方式：下行展开20l展开方式展开方式多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以以75 为最佳。展开距离一般为为最佳。展开距离一般为10-15cm。多次展开多次展开一次展开未达满意分离时，可一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可将薄层板干燥后再

9、次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。重复多次，直到混合物分离为止。分步展开分步展开混合物性质差别较大时，一种混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。次展开不同距离。薄层色谱法薄层色谱法（TLC)21l展开方式展开方式连续展开连续展开使到达薄层上缘的溶剂不断蒸使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连续展开以增加展开距离。发，连续展开以增加展开距离。二维展开二维展开在两个垂直的方向上进行展开。在两个垂直的方向上进行展开。原点12薄层色谱法薄层色谱法（TLC)22色谱槽需密闭良好，防止边缘效应色谱槽需密闭良好，防止

10、边缘效应薄层色谱法薄层色谱法（TLC) 展开展开:注意事项注意事项23 展开时的注意事项n边缘效应边缘效应：用混合溶剂展开时，同一：用混合溶剂展开时，同一组分的斑点在薄层中部比在边缘移动组分的斑点在薄层中部比在边缘移动速度要慢的现象。速度要慢的现象。24n产生原因：产生原因：展开槽未被展开剂饱和。尤其是展开槽未被展开剂饱和。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，开剂中极性溶剂的比例增大，R Rf f相对增大。相对增大。同一物质在同一薄层板上出现中间部

11、分的同一物质在同一薄层板上出现中间部分的R Rf f值比边缘的值比边缘的R Rf f值小，即边缘效应。值小，即边缘效应。 展开时的注意事项25预吸附中预吸附中展开中展开中n消除办法消除办法：若在展开前先将展开槽与薄层：若在展开前先将展开槽与薄层板用展开剂蒸气饱和后再展开，边缘效应板用展开剂蒸气饱和后再展开，边缘效应可消失。采用双槽层析缸进行预吸附。可消失。采用双槽层析缸进行预吸附。 展开时的注意事项26薄层色谱法薄层色谱法（TLC)l显色，计算显色，计算Rf值值 选择合适的显色方法显色。量出展开剂选择合适的显色方法显色。量出展开剂和各组分的移动距离，计算各组分的比移和各组分的移动距离，计算各组

12、分的比移值。值。 紫外光显色紫外光显色：不破坏组分结构不破坏组分结构 碘蒸气法碘蒸气法：碘是一种简便、灵敏非破坏性和可：碘是一种简便、灵敏非破坏性和可逆的通用显色剂。逆的通用显色剂。 化学显色化学显色：不可逆的化学反应。：不可逆的化学反应。 如：氨基酸如：氨基酸 + 茚三酮茚三酮 = 蓝紫色化合物蓝紫色化合物27紫外灯观察紫外灯观察喷显色剂观察喷显色剂观察薄层色谱法（薄层色谱法（TLC)28薄层色谱法薄层色谱法（TLC)（5）定性分析：）定性分析：Rf标标准准品品溶剂前沿溶剂前沿起始线起始线cba29l 展开后，薄层分离所得斑点中化合物可进一步定量，展开后，薄层分离所得斑点中化合物可进一步定量

13、，其测定方法可分为两大类：其测定方法可分为两大类：l一类为洗脱测定法，将所需测定的斑点中的组分用一类为洗脱测定法，将所需测定的斑点中的组分用适当溶剂洗脱，再选用适当方法定量；适当溶剂洗脱，再选用适当方法定量；l另一类为直接测定法，色谱分离后，直接用肉眼观另一类为直接测定法，色谱分离后，直接用肉眼观察比较或用仪器扫描斑点而测定其含量。察比较或用仪器扫描斑点而测定其含量。 薄层色谱法薄层色谱法（TLC)（5）定量分析）定量分析30定量分析：洗脱测定法定量分析：洗脱测定法 1 斑点的定位斑点的定位2 斑点的洗脱斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附剂吸下，然后用洗脱用吸集器将斑点位置的吸附剂吸下，然后

14、用洗脱溶剂洗脱。溶剂洗脱。3 测定测定(1)紫外分光光度法：洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大紫外分光光度法：洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大吸收波长处测定。同时把样品斑点相应位置薄层吸附剂同样吸收波长处测定。同时把样品斑点相应位置薄层吸附剂同样取下做空白对照。取下做空白对照。(2)比色法：选择灵敏度高、专属性好的比色反应测定化合物含比色法：选择灵敏度高、专属性好的比色反应测定化合物含量，是比较常用的方法。量，是比较常用的方法。(3)其它方法：极谱、库仑滴定、荧光测定等。其它方法：极谱、库仑滴定、荧光测定等。 薄层色谱法薄层色谱法（TLC)31定量分析：直接测定法定量分析：直接测定法1

15、目测法 样品经色谱分离后，直接观察所得斑点的大小和颜色的深浅，并与标准品在相同条件下展开所得到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较，而近似地判断样品中所测成分的含量。2 仪器测定法薄层色谱法薄层色谱法（TLC)32判断依据：判断依据：R Rf f值值查找资料：影响Rf值的因素 吸附剂种类、活度、颗粒大小；展开剂纯度和极性；薄层厚度；点样量；展开方式、温湿度；展开槽中的预饱和状态等。对照品比较法：常用。1 1、定性鉴别、定性鉴别（四）薄层色谱法的应用范围（四）薄层色谱法的应用范围薄层色谱法薄层色谱法（TLC)33对照品比较法：杂质对照品制成一定浓度的溶液杂质对照品制成一定浓度的溶液样品制成一定浓

16、度溶液样品制成一定浓度溶液按相同的点样量点样按相同的点样量点样展开后观察斑点颜色深浅和大小展开后观察斑点颜色深浅和大小2、杂质检查（杂质限量检查）、杂质检查（杂质限量检查）薄层色谱法薄层色谱法（TLC)（四）薄层色谱法的应用范围（四）薄层色谱法的应用范围34如异烟肼中游离肼的检查： 肼是一种诱变剂和致癌物质，中国药典对异烟肼原料和注射用异烟肼中游离肼的检查均采用薄层色谱法。 检查方法取本品，加水制成每1ml中含50mg的溶液，作为供试品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg（相当于游离肼50g）的溶液，作为对照溶液。吸取供试液10l 与对照溶液2l，分别点于同一硅胶薄层板（用羧甲基纤

17、维素钠溶液制备）上，以异丙醇丙酮（3:2）为展开剂，展开后，晾干，喷以乙醇制对二甲氨基苯甲醛试液，15min后检视，在供试品主斑点前方与硫酸肼斑点相应的位置上，不得显黄色斑点。 薄层色谱法薄层色谱法（TLC)：例子：例子对照品比较法：35薄层色谱法薄层色谱法（TLC)（四）薄层色谱法的应用范围（四）薄层色谱法的应用范围对照品比较法异烟肼中游离肼的检查：观察在供试品溶液主斑点前方与对照品溶液主斑点相应位置，是否显示鲜黄色斑点。可知异烟肼片中游离肼的含量是否低于药典规定的限量。2、杂质检查（杂质限量检查）、杂质检查（杂质限量检查）36自身稀释对比法（杂质结构不明或无杂质对照品）主成分溶液稀释制成一

18、定浓度的溶液主成分溶液稀释制成一定浓度的溶液样品制成一定浓度溶液样品制成一定浓度溶液按相同的点样量点样按相同的点样量点样展开后观察斑点颜色深浅和大小展开后观察斑点颜色深浅和大小薄层色谱法薄层色谱法（TLC)（四）薄层色谱法的应用范围（四）薄层色谱法的应用范围2、杂质检查（杂质限量检查）、杂质检查（杂质限量检查）37如地西泮中有关物质的检查： 取本品的细粉适量（约相当于地西泮200mg），加丙酮5ml,振摇，使地西泮溶解，滤过，取滤液作为供试品溶液；精密量取适量，加丙酮稀释成每1ml中含地西泮0.20mg的溶液，作为对照溶液。点样展开后，供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。

19、 薄层色谱法薄层色谱法（TLC)：例子：例子自身稀释对比法（杂质结构不明或无杂质对照品）38目视比较法目视比较法对照品制成不同浓度的系列溶液对照品制成不同浓度的系列溶液样品制成定量溶液样品制成定量溶液按相同的点样量点样按相同的点样量点样展开后观察斑点颜色深浅和大小展开后观察斑点颜色深浅和大小注：本法适用于近似含量的测定，误差注：本法适用于近似含量的测定，误差10%10%3、含量测定、含量测定薄层色谱法薄层色谱法（TLC)（四）薄层色谱法的应用范围（四）薄层色谱法的应用范围39仪器测定法仪器测定法 （1）吸收测定法）吸收测定法 展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光度的变化，得展开

20、后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光度的变化，得到扫描曲线。到扫描曲线。 利用样品扫描曲线上峰高或面积与标准品相比较，可得出样品含量。利用样品扫描曲线上峰高或面积与标准品相比较，可得出样品含量。 （2）荧光测定法）荧光测定法 化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可测量其荧光强度化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可测量其荧光强度而进行定量。而进行定量。 用用薄层扫描仪薄层扫描仪（TLC Scanner）扫描定量，）扫描定量，该方法已成为薄层定量的主要方法。该方法已成为薄层定量的主要方法。薄层色谱法薄层色谱法（TLC)40薄层扫描仪对色谱斑点进行扫描薄层扫描仪

21、对色谱斑点进行扫描 用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化从而达到定量的目的。 41吸收测定法的分类吸收测定法的分类 根据对光测定方式的不同，可分为两种：透射法反射法 透射法扫描 反射法扫描 L 光源；MC 单色器；P 薄层板；S 斑点； PD 光电检测器42薄层色谱法在各个学科中的应用l食品和营养食品和营养 l药物和药物代谢药物和药物代谢 l化学和化工化学和化工 医学和临床医学和临床 毒物分析和法医化学毒物分析和法医化学农药农药 43 取本品水蜜丸取本品水蜜丸6g6g，研碎，或取小蜜丸或大蜜丸，研碎，或取小

22、蜜丸或大蜜丸9g9g，切碎，切碎，加硅藻土加硅藻土4g4g，研匀。加乙醚，研匀。加乙醚40ml40ml，低温回流，低温回流1 1小时，滤过，滤液小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮挥去乙醚，残渣加丙酮1ml1ml使溶解，作为供试品溶液。另取使溶解，作为供试品溶液。另取丹皮丹皮酚酚对照品，加丙酮制成每对照品，加丙酮制成每1ml1ml含含1mg1mg的溶液，作为对照品溶液。照的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法薄层色谱法( (附录附录 B) B)试验，吸取上述两种溶液各试验，吸取上述两种溶液各10l,10l,分别点分别点于同一硅胶薄层板上，以环己烷醋酸乙酯于同一硅胶薄层板上，以环己烷醋酸乙酯(3:

23、1) (3:1) 为展开剂，为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性 5 5三氯化铁乙醇溶液，加热三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点。显相同的蓝褐色斑点。 （20052005年版年版中国药典中国药典一部一部 401401页）页）一、六味地黄丸中丹皮酚的薄层鉴别一、六味地黄丸中丹皮酚的薄层鉴别薄层色谱法薄层色谱法（TLC)应用实例应用实例441.丹皮酚；25.六味地黄丸六味地黄丸中牡丹皮的薄层图谱六味地黄丸中牡丹皮的薄层图谱45二、醋酸可的松中其

24、他甾体的检查二、醋酸可的松中其他甾体的检查 取本品，加氯仿-甲醇(91) 制成每1ml 中含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量醋酸可的松，加氯仿-甲醇(91) 稀释成每1ml 中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(38560152) 为展开剂，展开后，晾干，在105 干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品溶液如显杂质斑点，不得多于3 个，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。薄层色谱法薄层色谱法（TLC)应用实例应用实例46三、硫酸长春碱中杂质的限量检查三

25、、硫酸长春碱中杂质的限量检查中国药典(2005年版)规定硫酸长春碱中其他生物碱的检查方法如下：取本品，加甲醇制成10mg/ml溶液作为供试溶液。精密吸取适量加甲醇制成0.02mg/ml溶液作为对照液。取上述两溶液各5l点于同一硅胶GF254薄板上，展开，检识；供试溶液中的杂质斑点不得超过两个，且颜色不得深于对照溶液主斑点的颜色。薄层色谱法薄层色谱法（TLC)应用实例应用实例47A.会使点样里的组份分不开B.可能会淹没所划出来的细线,从而溶解所 点的样C.展开剂会挥发出来D.展开剂与硅胶G发生反应1. 展开剂如果过多，会有何后果？展开剂如果过多，会有何后果？( )B 小测验小测验482.在液相合

26、成实验中在液相合成实验中,需要快速得知反应物料里面需要快速得知反应物料里面是否有新物种时是否有新物种时,采用哪种方法较快捷方便采用哪种方法较快捷方便?或如或如何判定两瓶试剂是否为同一种物质？何判定两瓶试剂是否为同一种物质？( )A.气相色谱B.液相色谱C.薄层色谱D.柱色谱C491.1.在薄层层析中常用的吸附剂有哪些？在薄层层析中常用的吸附剂有哪些？2.2.为什么从文献上查得的为什么从文献上查得的R Rf f值只能供参考，不值只能供参考，不能作为定性分析的依据？为了鉴定试样中的各能作为定性分析的依据？为了鉴定试样中的各组分，应该如何办？组分，应该如何办？3.3.在薄层层析中，对于无色试样应该用怎样的方在薄层层析中，对于无色试样应该用怎样的方法将各组分的斑点显示出来？法将各组分的斑点显示出来？4.4.掌握薄层色谱法的原理。掌握薄层色谱法的原理。 课后习题课后习题