流式细胞仪.doc

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1、精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除流式细胞仪主要技术指标1、流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测10005000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2、流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子，两个细胞间的荧光差5%即可区分。3、前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2m0.5m。4、流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。5、流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度1000个/秒，分选细胞纯

2、度可达99%以上。流式细胞仪原理流式细胞术（FCM）就是对在高速流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。一、 流式细胞术的概念流式细胞术(FCM)就是对在高速流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分析技术。二、 流式细胞仪的工作原理

3、待测细胞被制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在清洁气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，鞘液的作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包括下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数1. 前向角散射(FSC)：前向角散

4、射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。2. 侧向角散射(SSC)：侧向角散射又称90散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。3. 荧光强度(FL)：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们能通常所说的阳性细胞，也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，也就是可以把强阳性细胞和

5、弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源(488nm)，可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源(488nm、633nm和325nm)，可测出6个FL 。四、 流式细胞术的应用1、 细胞DNA含量检测：细胞固定后用PI染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，并通过专用的DNA分析软件，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。2、 肿瘤诊断：DNA异倍体的出现是癌变的一个重要标志，细胞的增殖能力的大小也可反映肿瘤的生物学持征。因此，临床上可利用流式细胞仪进行细胞周期分析

6、和DNA倍性分析，辅助肿瘤诊断，包括监测癌前病变、肿瘤的早期诊断、交界性肿瘤诊断和肿瘤细胞学诊断等各方面。肿瘤预后估计：异倍体肿瘤恶性度、复发率、转移率和死亡率都较二倍体肿瘤高。已有文献报道，在乳腺、结肠、直肠、前列腺和膀胱肿瘤中，异倍体和较高的S期百分比都是不良预后的标志。同样的，在肺癌、头颈部肿瘤、卵巢癌、肾癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和白血病中，亦有类似发现。因此在病理组织学分级、临床分析等指标基础上，用流式细胞仪检测肿瘤DNA倍体能更客观地预测预后。凋亡：由于凋亡细胞核酸内切酶活化，DNA降解，细胞DNA减少，因而可在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是凋亡峰。检测凋亡，可进行抗肿瘤药

7、物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究。3、 细胞表型分析细胞表型的分析得益于单克隆抗体的产生及发展，现在CD系统已有247种之多。细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用流式细胞仪可对其进行检测分析，可分析出荧光细胞的含量，也可分析出这种阳性细胞的CD分子的相对含量标记的方法一般用直标法，也可用间标法。荧光探针多为FITC、PE、PE-CY5、PerCP、CY5、APC等。淋巴细胞分类：CD3（T细胞，CD4、CD8）、CD19（B细胞）、CD16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。造血干/祖细胞计数：造血干/

8、祖细胞存在于骨髓和外周血中，形态与淋巴细胞相似，用普通形态学方法难以识别。由于造血干/祖细胞表面可表达CD34和CD45抗原且具有很高的核酸含量，因而用CD34和CD45单克隆抗体和核酸染料进行三色荧光标记，FCM多参数分析血液、骨髓和浓缩白细胞悬液中造血干/祖细胞的数量，对临床血液病、恶性肿瘤、基因异常等疾病的造血干/祖细胞移植治疗有十分重要的意义。白血病的免疫分型：流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数一般在10000500

9、00细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。4、 细胞系的鉴定新建细胞系：新建立的细胞，进行系列的表型分析，以确定此细胞系的表型。已有细胞系的表型分析：对于已知细胞系，由于多次传代和培养条件的改变，细胞遗传信息可能会发生突变，对其进行表型分析，以检测该细胞系是否有变异。5、 血小板功能分析与血小板病诊断原理 血小板是由骨髓巨核细胞产生的无核细胞，正常静止状态呈两面微凸的圆盘状，平均直径23m。活化的血小板呈不规则形状，表面有大量星状突起，彼此间常发生粘附、聚集。血小板膜上有丰富的糖蛋

10、白受体，是血小板发挥功能的分子基础。静止与活化血小板膜粘蛋白分子的种类、含量、结构、功能等显著不同，一些血小板糖蛋白的分子缺陷常导致血小板止血功能的异常，某些糖蛋白分子在血小板膜上高表达又是血小板被活化的特异性分子标志。当血小板表面结合有自身抗体时常导致血小板减少。血小板的上述变化，通过用荧光素标记的单克隆抗体结合流式细胞术，可以敏感、特异、快速的诊断血小板病。6、 FCM的应用，概括成一句话就是：凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞

11、术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进，流式细胞仪的研制、革新，到今天的众多应用领域的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、电子工程学、液体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和物理学等学科知识综合运用的结晶。而现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、临床医学、药物学等众多研究领域的应用将会越来越广泛。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学奖

12、。 1984 德国人G. J. F. Kohler、阿根廷人C. Milstein3和丹麦科学家N. K. Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。 它是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交， 获得既能产生抗体， 又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体的技术。其原理是: B淋巴细胞能够产生抗体， 但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代， 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。当动物体受抗原刺激后可产生抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇

13、，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。(1)单克隆抗体的基本概念 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种

14、抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。(2)单克隆抗体技术的基本原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。五、流式

15、样品的制备中应注意的几个问题（一）荧光素和抗体的选择1. 荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的荧光素，常用的荧光素有： 测细胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD 测细胞蛋白、抗体或抗原：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5、PerCP-CY5.5。 测细胞膜电位：Rho-123 测钙离子：Fluo-3。2. 抗体的选择一定要选择商业化的流式用克隆抗体，此类抗体在制备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。（二）样品的准备评价一个样品制备的优劣

16、，可有三个评价指标，即： 细胞的密度，不能低于1106/ml； 非特异荧光，不超过1%； 细胞碎片和聚集体，不能出现肉眼可见的团块。流式细胞仪对一个样品提供的结果是还可信，虽然与仪器操作者的水平有很大关系，但在很大程度上取决于样品制备的优劣。细胞密度太低，影响测试速度并造成测试参数调整的困难，尤其是在做DNA分析时，由于细胞太少，势必要提高样品的流速，人为地增大了G0/G1期的CV值，影响了结果的可靠性；非特异荧光强，则造成样品结果的假阳性；聚集体增多，尤其是肉眼可见的细胞聚集体，可造成流式细胞仪进样针的阻塞，影响仪器的性能，碎片可干扰测试结果，造成结果分析的困难。流式样品制备过程中常见的问题

17、及解决对策常见问题原因解决对策细胞密度低制备过程中细胞损失增加离心时间，吸弃上清非特异荧光强抗体不纯，死亡细胞多选择纯度高的单克隆抗体，用同型对照抗体或双标记排除非特异荧光碎片多细胞死亡、机械损伤在细胞生长状态良好时测试、避免反复吹打细胞聚集消化不完全、酒精固定造成的细胞粘连彻底消化，在用酒精固定细胞时加入终浓度为1.5-3%的小牛血清荧光弱灵敏度不够，抗体加入量不饱和，反应时间短改用生物素-亲和素，增加抗体用量，延长反应时间测不出亚二倍体峰凋亡测试方法选择不当改用原位末端标记或Annexin-V和PI双标记法（三）样品对照细胞的荧光有自发荧光、非特异荧光和特异荧光，并且流式细胞术提供的阳性细

18、胞百分比和荧光强度都是相对阴性细胞而言的，所以在样品制备中样品对照的设置至关重要。： 在测DNA时，要设正常细胞对照，即不做任何干预的细胞对照；在检测细胞膜CD分子和细胞内蛋白或细胞因子时，要设同型抗体对照，如果是双标记或三标记检测，还要设单标记的阳性对照。六、流式样品的制备1. 细胞DNA分析用本法可测定细胞周期、细胞倍体和凋亡，在样品制备中存在的问题主要是细胞的聚集和碎片，建议在固定细胞时加入1.5-3%小牛血清。 培养的细胞系、体液中分离的有核细胞或分离的组织细胞约1106/ml，离心沉淀后用0.3ml含5%-10%小牛血清的PBS悬浮，移入1.5ml EP管中，加入0.7ml无水乙醇，

19、置-20固定细胞24小时以上（用本法制备的细胞可在-20保存一周甚至更长的时间）。 3000rpm离心细胞30秒，吸弃上清，用1ml PBS重悬细胞，再离心洗涤细胞一次，吸弃上清，沉淀细胞用100l 1mg/ml RNase A悬浮，37 30min 以消化RNA，再加入400l 1g/ml PI，置暗处10min后上机检测。 结果分析：流式报告中可给出G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比、凋亡百分比和细胞倍体2. 细胞表面CD分子检测（以小鼠脾细胞CD4、CD8为例） 小鼠脾脏用注射器芯轻轻研磨，过200目滤网，将细胞滤于含5%小牛血清的PBS中，吸取0.1ml （约1106）置离心管中

20、，加入CD4及CD8抗体（加入量参照供应商的推荐量，一般抗体的加入量为1g/1106/0.1ml），室温30min。 加入B-D公司生产的细胞裂解液2ml室温裂解RBC 15min，用PBS洗涤细胞两次，吸弃上清，沉淀用0.5ml PBS悬浮，上机检测；也可用4%多聚甲醛固定，4避光可保存至少24小时。流式报告中可给出阳性细胞的百分比和荧光强度。注意两点：建议使用BD公司的RBC裂解液。离心后上清一定要吸，不能倒，离心速度控制在1500rpm左右。3. 细胞内细胞因子测定用流式细胞仪测定的细胞纳细胞因子是当前流式细胞术中一种较新的技术。在免疫反应中，细胞因子担当了重要的角色。几乎所有的细胞因子

21、均可由各种不同类型的细胞在体外产生。但利用生物测定技术、酶标法或PCR技术不能回答某一特定的细胞因子在体内究竟是由哪种细胞产生的，即使将细胞分离制备出来，由于存在污染其它细胞的可能性，结果仍然缺乏可靠性。理想的测定技术应使细胞因子的检测能在可区分其表型的单细胞中进行，胞内细胞因子染色和流式细胞术则可满足这些要求。即流式细胞术可同时回答某种细胞因子是来源于哪种细胞表型阳性的细胞。样品制备：体外刺激诱导细胞使其产生细胞因子；刺激同时加入Monensin（莫能菌素）以中断内细胞因子的运输，使新合成的细胞因子聚积在高尔基体。固定细胞；加入打孔剂使在细胞膜上造成许多小孔（打孔），从而使大分子的细胞因子抗

22、体能透过膜；荧光标记。常用打孔剂有Saponin、Trition-X 100。4. 胞浆内蛋白的测定收集细胞（如果是含有红细胞的有核细胞，则用裂解液去除红细胞），用含510%的牛血清PBS悬浮，终尝试为70%的乙醇固定，固定后洗去酒精，沉淀细胞用0.2% Triton-x 100破膜15min，加入一抗（一定要加饱和量）室温30分钟，离心洗涤两次，洗去未结合的一抗，再加入二抗，室温30min，洗涤两次，重悬于0.5ml PBS中上机测试。要设不加一抗的阴性对照。也可以不必固定。用这种方法可测周期蛋白、凋亡蛋白、基因表达产物等。5. 细胞膜电位测定Rho-123是线粒体的特异性染料，细胞被染料染

23、色后，可测出细胞的荧光强度，其荧光强度的强弱与细胞膜电位的高低有关，可间接反映出细胞的功能。其方法如下：取1106细胞用PBS洗一次，再用1ml PBS悬浮，加入2.5mM Rho-123 2l，使其终浓度为5M，室温作用30min，作用毕，用PBS洗细胞二次，0.5ml PBS重悬细胞，上机测试。由于凋亡和死亡细胞线粒体受损，荧光较弱，而功能正常的细胞荧光较强。在流式报告中的直方图中可出现两个峰或一个峰。Rho-123的另一个用途是用于研究肿瘤细胞的耐药。6. 细胞内钙离子测定以RPMI1640培养基配成浓度大约为1106/ml的细胞悬液，每ml细胞悬液中加入终尝试为1-5mol/ml Fl

24、uo-3/AM，充分混匀，室温避光作用60min。以HEPES缓冲的Hank平衡盐溶液（含10mmol/L HEPES, Ph7.4）洗三次，重悬于0.5ml同样的溶液，上游式细胞仪检测。报告中可给出样品的荧光强度。再根据荧光强度计算出细胞内钙离子的浓度。细胞内钙离子浓度计算公式：Ca2+=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Kd为所用染料与Ca2+的解离常数；Kd(Fluo-3): 400nmol/L，Fmax为细胞内Ca2+饱和时所测得的荧光强度，Fmin为Fluo-3未与Ca2+结合时所测得的荧光强度，F为样品的荧光强度。七、常用荧光探针组合1. 细胞表型分析 双色分析：FITC与PE

25、三色分析：双色分析+PE-CY5或PerCP-CY5.5四色分析：三色分析+APC或CY52. 胞内蛋白与周期分析蛋白标记FITC，DNA标记PI3. 凋亡与坏死分析凋亡用Annexin V-FITC，坏死用PI，或细胞标志物用FITC，凋亡用Annexin V-PE，坏死用7-AAD八、如何看流式报告流式报告的图一般分为四种，即散点图、真方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。几个概念：%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。Mean：平均荧光强度，也被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。Geo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一

26、般用该值。FCM主要厂家有BD和Coulter，国内用的最多的是BD公司的，按荧光参数不同，价位也不同，还有很多选配部件，细胞分选等，都很贵。流式细胞仪主要用于细胞的分离分析。利用不同细胞的光学性质不同，将细胞进行区别，利用静电场作用力将细胞分离。 比如，流式细胞仪可定量测定某一细胞中的DNA、RNA或者某一特定蛋白（比如荧光标记的蛋白抗原）的含量。对于无光谱特性的物质，可以采用特异染色的方式将细胞的该成分染色，从而使需测定物质具有了光学特性，从而特异识别携带该物质的细胞，达到分析分离的目的。BD：FACSCanto流式细胞仪光学系统设计特点：488nm，20mw固态激光器和633nm，17m

27、w氦氖激光器；采用专利技术的光路设计扩展了可检测的荧光信号（6色荧光参数，2个散色光）；高灵敏度，更适合检测弱表达或含量极低的指标液流系统设计特点：采用独立的液流车，提供仪器运行所需的所有液体环境，节省了时间；与软件配合，使得液流的控制高度自动化，易于操作；全新设计的样本进样系统使得样本滞留量小于0.1%,更适合微量样本的检测数字化电子系统：消除了电子死时间，无需进行时间延迟校准，因此系统可以处理更快的样本流动速度（120ul/min)及采样速度（10000events/sed)简化了荧光补偿的设定，实现了自动补偿和采样后补偿的可能。FACSCalibur特点台式机型，FDA认证，偏重于临床，

28、并兼顾科研的需要；固定校准，软件控制，操作方便；可安装两根激光器（488nm氩离子激光及红色半导体激光），同时检测4个荧光参数；独特的双激光立体激发系统，减少了荧光之间的补偿，提高了仪器检测的灵敏度；分析速度最快的临床型机器：10000个细胞/秒；唯一具有分选功能的临床型机器，可轻易实现无菌分选；BD专利的脉冲处理系统，清晰地识别粘联细胞，最大限度地减少假阳性的出现；多种为临床常规项目专门设计的全自动软件，提高了检测效率，减少了干预人为，增加了结果的可信度；仪器为模块式设计，具有广阔的升级空间；BD可根据客户的实际需要，提供完善的选配件系统南京大学大型贵重仪器设备对外开放信息表院（系）实验室名

29、称：南京大学分子医学研究所 所在学科：生物化学仪器名称流式细胞仪仪器编号20016782型号FACSCA2BUR规格110V单价666744.42元进口单价79000美元厂家美国Becton Dickinson出厂日期2000.11附件编号附件数量附件名称附件型号规格技术指标激发波长488nm；染料发射波长530、585、650nm。功能特色经荧光色素染色的细胞或其它生物微粒，经过光电元件对其散射光及荧光测量，可对其进行准确、快速的多参量分析。应用成果知名用户可用机时日程表预先联系确定。收费参考校内收费40元/管校外收费仪器地点南大蒙民伟楼22层仪器负责人郑慧联系地址南大蒙民伟楼22层邮政编码

30、联系电话359379613分机联系传真电子邮件开放类型院系内部 校内校外图片：型号： BD FACSAria 厂家： 美国 BD公司 现安装地点：微生物所大型仪器中心状态 良好 对外服务 使用时间：周一至周五操作：由工作人员操作 申请服务方式：预约所内收费标准：分析样品10元/支；分选样品 200元/小时；所外收费标准：分析样品20元/支；分选样品 400元/小时。仪器专家；刘振英工程师 仪器使用联系人：刘振英电话：62574716 邮箱：liuzy仪器功能、特点及应用：(A)功能： 流式细胞分选仪是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度

31、，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选。流式细胞仪主要用于单细胞群体的研究，多数细胞成分如蛋白质、RNA、DNA、膜质、离子（H+、Na+、K+和Ca2+）均可用荧光染料标记，因此，流式细胞仪可用于对这些成分的分析，还可用于细胞表面和细胞内的蛋白质活动及功能的研究，以及活细胞中荧光复合蛋白的研究。(B)特点： 流式细胞仪具有三个特征：(1)高速（分析速度高达70,000100,000个细胞/秒）。(2)同时分析单个细胞的多个参数。(3)细胞分选（

32、可达7000个细胞/秒和99%的纯度）。这些特殊功能目前还没有别的替代技术。(C)应用： 细胞膜：流动性、膜电位、膜通透性。 细胞内离子浓度：H+、Na+、K+和Ca2+。 细胞周期：全周期分析、S期分析、M期分析。 细胞表面蛋白质分析：免疫细胞分型、其它表面蛋白分析。 细胞功能：如凋亡、抗药性。 基因表达：内源及外源基因表达。 细胞分选：分选速度可达7000个细胞/秒。 细胞克隆。2. 软件模拟使用以及在线测定： CellQuest：获取及分析数据的通用软件； Modfit：细胞周期分析软件； Clone Cyt Plus：将特定数目的细胞置入特定multiwell tray孔中或特定sli

33、de位置；3. 技术参数信息： 三激光（488nm、633nm、407nm）、八色荧光、多参数分析（可同时检测总共15个独立的细胞参数）、高速分选、高通量筛选。 激光流动成像细胞仪ImageStream 100厂 家： 美国ABP公司代理商： 深圳达科为生物技术有限公司货 号： 索取资料咨询价格 应 用application高通量细胞工作站：涵盖分子生物学，细胞生物学，免疫学，干细胞研究等各个领域的细胞水平研究。通过高速流动下的细胞图像实时捕获实现细胞图像的高通量流式分析。 特 点characteristic总体要求：动态捕捉流动状态下的每一个细胞的荧光图像和光、暗视野图像。分析能力可达到18

34、,000个细胞/分钟，每个细胞可生成200个参数。通过专用软件对一批细胞实现标记荧光和细胞形态学的精细分析。适用于各种以细胞为研究对象的生物学统计分析。 具体要求： 一、 光学与成像系统特征： 1 激光器： 1） 成像主激光器：固体激光器，功率为：200mW；激发光波长为：488nm。该激光器比常规流式细胞仪采用的气体激光器的功率大15倍，从而使被检测细胞的荧光信号放大数十倍。是实现细胞荧光成像的硬件基础。 2） 附助激光器：固体激光器，功率为：15mW；激发光波长为：785nm。该激光器为红外激光器，实现非干扰成像条件下的细胞实时测速和实时聚焦。 2 CCD芯片：采用特制平行通道六CCD芯片

35、。每个通道特制CCD均采用线性分拆和叠加技术。从而实现软件上的时间延迟成像技术。成像模式为：从细胞开始经过流通池即按线性分拆CCD芯片跟踪进行分线性照相，直至细胞通过流通池截至。通过计算机时间延迟叠加技术重构出完整细胞的荧光图像。 3 CCD通道：具有6个平行的通道（Channel），可以记录最多6种细胞图像（明、暗视野图像和4种不同波长的细胞荧光图像；或者为暗视野图像和五种不同波长的细胞荧光图像）。 4 6个通道的谱带为： 通道1：400470nm；用于细胞暗视野成像 通道2：470500nm；用于细胞明视野成像/或者荧光成像 通道3：500560nm；用于细胞明视野成像/或者荧光成像，可用

36、的荧光染料：FITC,GFP,RHODAMINE,Cy2,等 通道4：560595nm；用于细胞明视野成像/或者荧光成像，可用的荧光染料：PE,PI,CellTrackerOrange,等 通道5：595660nm；用于细胞明视野成像/或者荧光成像，可用的荧光染料：PE-TexasRed,7-AAD,等 通道6：660730nm；用于细胞明视野成像/或者荧光成像，可用的荧光染料：PerCp,PE-Cy5,DRAQ-5,等 5 CCD芯片的数据精密性：10bits/像素。 6 CCD芯片硬件像素直径：0.5um。 7 荧光检出的灵敏度：小于1000MESF。 8 流通池主物镜参数：4.5mmFL

37、（焦距）/0.75NA（孔距）。 9 系统光学放大倍率：36倍。 二、液流系统特征： 10 液流管道：采用高精度注射器式液流方式。 11 样品自动加载、排空、冲洗。 12 采用标准流式管技术进行样品处理 13 样品核心流可自定义体积和流速：样品核心流直径：140um；样品核心流速：1,00010,000um/s。 14 上样要求：上样最小体积：35uL；上样细胞浓度：106107cells/mL 15 整个液体流通管道按标准程序自动冲洗和消毒。 三、辅助系统特征： 16 流速控制：采用ILF（红外激光频率控制）技术，自动进行液体流速的实时测定和反馈控制。测速精确度：0.1um/s，反馈控制时间

38、0.05s。流速实时精确测定是实现高速流动状态下的细胞跟踪成像的关键技术。 17 样品核心流自动跟踪：采用ILA（红外激光振幅控制）技术，实时对样品核心流进行追踪和反馈控制。核心流追踪范围：/-20um；反馈控制时间：0.05s。对样品核心流的自动追踪是实现三维细胞定位的关键技术。 18 自动聚焦：通过流速控制和样品核心流自动追踪的反馈控制，实现成像系统对流动细胞进行自动聚焦，保证细胞图像的精确度、清晰度。 19 具备自我诊断和校准功能：仪器对光学通路、液流系统、辅助系统等各主要部件实现实时在线自我诊断和报告，并按照标准程序进行自动校准。 20控制电脑：分为在线和离线两台电脑主机。 四、分析软

39、件功能： 20 分析图像和参数：每一个细胞产生6种图像（明、暗视野图像和4种细胞荧光图图像）；并具有200个基本图像参数（包括多种形态学测量参数和荧光强度测量参数）。 21 图像数据库：每一个样品的分析都生成该样品中所有细胞的图像数据库，可任意调用图像数据库对该样品细胞群进行各种分析。 22 分析图：根据细胞参数，可以任意选择产生散点统计分析图或者频率分布图。 23 分析图和数据库的对应：图像数据库与分析图建立互动的一一对应关系。 1） 散点分析图上的每一个点对应一个可随时调用观察的细胞图像。 2） 标记任意一个细胞图像可直接在散点分析图中显示对应数据点坐标 3） 在散点分析图和频率分布图上任

40、意定义的细胞亚群都直观的在图像数据库中进行树状分群。 4） 不同样品间的分析方法可以互相比较，互相调用。 5） 建立标准样品分析方法可以进行大批量样品的统一分析。从而实现大批量样品的统计学分析。 24 设门分析：通过直接观察图像可以人工辅助精确设定散点分析图上的各细胞亚群的设门分析。 25 图像组合与单个细胞观察：可以按用户自定义，任意组合不同通道细胞光学图像和荧光图像。可以单独显示每个通道或者组合通道的单个细胞图像进行观察。 26 多通道交叉荧光增强功能：对于微弱荧光信号可以通过明视野细胞图像辅助设定遮罩，特定加强遮罩下细胞荧光信号。实现对微弱荧光图像的捕捉和分析。 27 荧光补偿：通过单荧

41、光样品数据对多荧光样品数据的软件自动补偿。 28 自定义分析方式：用户可以自设定新的分析参数和新的分析模板。 五、系统外部特征： 29 电源：90240V,50-60Hz; 30 功率：1000W 31 网络：10/100以太网 32 外部体积：36x24x24英寸流式细胞仪检测项目信息各相关单位：医学实验中心流式细胞仪室经多方筹措经费，购买了部分科研试剂，现对外提供服务。一、检测项目：1 人细胞CD95(Fas/Apo-1)的定性（阳性率）、定量（荧光强度）分析；2 人细胞Bcl-2蛋白的定性（阳性率）、定量（荧光强度）分析；3 人细胞P53的定性（阳性率）、定量（荧光强度）分析；4 人肿瘤

42、细胞耐药蛋白（P-gp, P-170）的定性（阳性率）、定量（荧光强度）分析5 细胞内Caspase-3活性测定；6 细胞内细胞色素c（cyt c）含量测定；7 Annexin /PI染色检测细胞凋亡；8 PI/Rhodamine123染色检测细胞线粒体膜电位；9 细胞内活性氧（ROS）含量测定；10 PI等染色检测分析细胞周期、DNA含量、DNA倍体和细胞凋亡。欢迎自备试剂进行其它项目的流式细胞检测、分析！二、标本要求：1 所有检测项目均要求为单个细胞悬液；样品细胞浓度不小于5105-106/ml，体积0.5ml；2 实体组织必须制备成单个细胞悬液，方可检测；可采用酶消化法和/或机械方法制备

43、，但细胞必须完整。中心具有组织细胞分离机，可代为制备实体组织的单个细胞悬液；3 细胞表达蛋白（包括细胞内和细胞表面）分析，要求必须为活细胞（Fresh cells），陈旧细胞抗原特异性已发生改变，无法分析；4 PI染色分析细胞周期、 DNA含量、DNA倍体和细胞凋亡，标本要求先用PBS洗涤，然后用70冷乙醇固定，分散成单个细胞悬液，须无细胞间的粘连；4保存，但不能超过2个月。贴壁培养细胞酶消化时要求保证细胞膜的完整性；实体组织先制备成单个细胞悬液，然后洗涤、冷乙醇固定。三、收 费：目前本校教师和研究生只需负担成本费用需要进行以上项目或者其它项目检测者，请与医学实验中心办公室葛建国联系、预约。地

44、址：医学校区医学实验中心6楼东侧633室电话：0931-8915391 13919122064中文名称流式细胞分析仪外文名称FLOW CYTOMETER型号规格EPICS ALTRA II生产厂商BECKMAN COULTER仪器国别美国生产日期2003-3-1分类编号03030900仪器价值1768000启用日期2003-3-1设备编号02011205所在学院医学结构生物学研究实验室医学结构生物学研究中心联系人屈雪菊联系电话02762621320E-mailQxj51收费标准20元/小时100元/件1. 主要技术参数 双水冷激光系统，紫外和488nm可见光多参数检测，仪器分辨率CV2%；检测

45、灵敏度0.20.5um；分选速度30006000个/S；分选纯度99.0%。周期分析软件和多参数分析软件。2. 主要功能介绍（应用范围及领域） 流式细胞仪（Flow cytometer）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。根据它的工作原理和结构特点，它有以下主要功能：它不但可以检测单个细胞中的各种生物化学成份，而且还可以定量检测各种液体中的大分子物质，并可用于多参数、多信息的分析。有强大的分选功能。流式细胞术的重要特征是通过高速流动细胞检测出的各种图形来分析与判断细胞的类型、数量、分化、蛋白质表达及信号传导物质等。它主要应用于：免疫学（细胞免疫功能检测，免疫细胞的分类等）、肿瘤学（细胞周期分析、DNA倍体分析、药物疗效监察、预后判断等）、临床血液学（白血病免疫分型、血栓与止血、网织红细胞检测等）、骨髓和器官移植、生物遗传学、细胞内离子测定、线粒体膜电位改变、细胞因子的检测、基础医学研究等等。可以满足医学、生物学各相关学科的研究。上海交通大学大型精密贵重仪器设备情况表农业与生物学院（ NO.5）