HPLC法测定复方甲硝唑含漱液中甲硝唑、呋喃西林含量药学毕业论文(设计)四篇.doc

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1、HPLC法测定复方甲硝唑含漱液中甲硝唑、呋喃西林含量 摘 要目的 建立同时测定复方甲硝唑漱口液中甲硝唑、呋喃西林含量的高效液相色谱法。方法 采用Lichrospher C18(5 m, 4.6250 mm) 色谱柱，乙腈-水(20:80)为流动相(1%磷酸，三乙胺调pH 3.8)，检测波长为263 nm，流速为1.0 mLmin-1，柱温为35 。 结果 甲硝唑和呋喃西林的线性范围分别为 6031407 gmL-1 (=0.9999)， 9.60321.34 gmL-1 (=0.9987)。回收率分别为100.8%(RSD=0.41%2.50%)，99.5%(RSD=0.20%4.16%)；日

2、内RSD为0.17%0.20%和0.76%2.31%，n=5；日间RSD为0.10%0.43%和0.13%0.20%，n=4。结论 HPLC法可用于复方甲硝唑漱口液的含量测定，方法准确、灵敏，专属性强。 关键词： 高效液相色谱法；甲硝唑；呋喃西林；漱口液Determination of Metronidazole and Furacilin with HPLC Method ABSTRACT: Objective: To establish a HPLC method for simultaneous determination of metronidazole and furacilin i

3、n its Collut. Methods: A Lichrospher C18(5 m,4.6250 mm) column was used, the mobile phase was acetonirile-water(20:80) containing 1% phosphonic acid, which was adjusted to pH3.8 by TEA. The detection wavelength was 263nm and the flow number was 1 mLmin-1.The column temperature was kept at 35. Result

4、s: The linear ranges of metrondazole and furacilin were 6031407 gmL-1(=0.99993) and 9.60321.34 gmL-1(=0.99872), respectively. The recoveries were 100.8% (RSD: 0.41%2.50%) and 99.5% (RSD: 0.20%4.16%), respectively. The RSD of inter-day of two were 0.17%0.20% and 0.76%2.31%, n=5.The RSD of inter-day o

5、f two constituents were 0.10%0.43% and 0.13% 0.20%. Conclusion: The method is accurate, sensitive for compound metrondazole collut.KEY WORDS: HPLC, Metronidazole, Furacilin, Collut复方甲硝唑含漱液为瑞金医院自制制剂，主要是由甲硝唑、呋喃西林、醋酸氯己定（醋酸洗必泰）及辅料甘油、薄荷、甜蜜素等组成。临床用于治疗牙龈出血、牙周肿痛、口腔溃疡及溢脓口臭等口腔疾病。本文建立了反相高效液相色谱法同时分离和测定甲硝唑和呋喃西林的

6、含量，方法准确、简便、灵敏，适用于制剂的质量控制。1. 仪器与试药1.1 仪器Waters 高效液相色谱仪，包括510型CM, TCM，Empower 色谱管理软件（美国Waters公司）；BS224S型电子分析天平（sartorius公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore）； CQ50型超声波清洗器（上海超声波仪器厂）；DELTA-320pH计（梅特勒-托力多仪器上海有限公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海医大仪器厂）；TXL-16型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.2 试剂甲硝唑(武汉武药制药有限公司，批号：C04-10611216)、呋喃西林(厦门东风药业有限公司

7、)的对照品（中国药品生物制品检定所，批号：20051027）；甲醇（色谱纯，TEDIA）；其它试剂均为分析纯。复方甲硝唑含漱液2批（批号： 20070808，20070821），不含药物的空白溶液由我院制剂室制备。2. 方法与结果2.1 色谱条件与系统适应性 色谱柱 Lichrospher C18(5m, 4.6250mm), 流动相为乙腈 : 水(含1%磷酸，用三乙胺调至pH 3.8) = (20:80)，检测波长263nm，流速1 mLmin-1，柱温：35 。在此色谱条件下，甲硝唑、呋喃西林能够完全分离，色谱峰形良好，保留时间分别为4.902min及8.490min，制剂中辅料对二种成分

8、测定均不产生干扰。在此色谱条件下测定的色谱图见图1。mAU25020015050100075301min89246+A921078min3456+mAU2502001501000508.49024.9021B2501509731028.4044.8621min86+542050100200mAUCA. 空白溶液 B. 对照品 C. 样品 1.甲硝唑 2.呋喃西林图1 . 复方甲硝唑含漱液的HPLC色谱图2.2 标准溶液配制 精密称取呋喃西林3.2 mg，置于约4 mL的EP管中，精密加入3 mL甲醇，超声2 min使其溶解，配制成含呋喃西林1067 gmL-1的标准贮备液；精密称取甲硝唑对照品

9、20.1 mg，置于10 mL的尖底离心管中，精密加入流动相5 mL，振摇使溶解,配置成含甲硝唑4020 gmL-1的标准贮备液。2.3 标准曲线 精密量取含呋喃西林1067 gmL-1的标准贮备液300 L，置于约4 ml的EP管中,加入蒸馏水2700 L，摇匀，稀释成含呋喃西林106.7 gmL-1的标准贮备液;精密量取不同量的甲硝唑、呋喃西林标准贮备液,并用蒸馏水稀释成不同浓度的标准溶液,具体操作如下表:表1 具体操作甲硝唑加入量(L)呋喃西林加入量(L)蒸馏水加入量(L)总体积(L)浓度(gmL-1)甲硝唑呋喃西林A1509076010006039.603B20011069010008

10、0411.737C2501406101000100514.938D3001805201000120619.206E3502004501000140721.34将配置好的标准溶液混旋,各取5 L 进样测定，以浓度（C）对色谱峰面积(A)进行线性回归，结果表明，甲硝唑浓度在6031407 gmL-1，呋喃西林浓度在9.60321.34 gmL-1范围内，浓度与色谱峰面积呈良好线性关系，回归方程为分别为：（1）甲硝唑： A = 2.00537726C-10.955335（r = 0.99993）；（2）呋喃西林：A = 10.556592C-3.1793638（r = 0.99872）。2.4 回收

11、率试验精密量取不同量的标准贮备液，置于1.5 mLEP管中，分别加入蒸馏水稀释，混匀，配置成低(QCL)、中(QCM)、高(QCH)三个浓度,每个浓度各配置6份,具体操作如下表:表2 具体操作甲硝唑加入量(L)呋喃西林加入量(L)蒸馏水加入量(L)总体积(L)浓度(gmL-1)甲硝唑呋喃西林QCL7040290400703.510.67QCM10056244400100514.938QCH130761944001306.520.273精密5 L 进样测定，以测得量与加入量的比值计算回收率，结果见表3。表3 回收率测定结果（n=6）成分加入量(mgmL-1)测得量(mgmL-1)回收率 (%)平

12、均回收率 (%)RSD(%)甲硝唑703.5707.83100.6100.80.4110051012.34100.70.421306.51320.86101.12.50呋喃西林10.6710.5498.899.54.1614.9414.95100.00.2020.2720.2299.70.532.5 精密度试验按照表2的操作方法，分别配制QCL、QCM、QCH各5份，且分别在日内（一日重复5次）和日间（4日之内）进行HPLC分析，结果见表4 。表4 甲硝唑呋喃西林含量测定精密度试验结果组分浓度（gmL-1）日内（n=5）日间（n=4）RSD (%)RSD (%)甲硝唑703.50.200.10

13、10050.170.431306.50.200.12呋喃西林10.672.310.1314.9380.880.1320.2730.760.202.6 样品测定 将样品作为供试品溶液，以标准溶液C（含甲硝唑1005gmL-1，含呋喃西林14.938gmL-1）作为对照品溶液，精密吸取供试品溶液与对照品溶液各5L 进样测定峰面积，以外标法计算样品中甲硝唑和呋喃西林标示量，2批样品测定结果见表5。表5 样品测定结果(n=5)批号样品组分含量（gmL-1）组分标示量 (%)RSD(%)20070808甲硝唑960.3996.040.59呋喃西林14.8598.991.0120070821甲硝唑956.

14、3695.640.20呋喃西林14.6397.561.203. 讨论复方甲硝唑含漱液中主要由醋酸洗必泰、甲硝唑及呋喃西林三种成分组成，且三种成分均有紫外吸收，因而采用分光光度法测定，三组分可能互相干扰，而且呋喃西林含量远低于甲硝唑，干扰难于消除。因而我们在国内首次建立了一种高效液相色谱法对主要成分进行分离、测定。在实验过程中发现醋酸洗必泰没有出峰，可能是由于所配制流动相或所选波长不适用所致，因此只对甲硝唑、呋喃西林做了含量测定。呋喃西林在紫外波长263nm有最大吸收，且呋喃西林含量较低，因而选择263nm作为检测波长。研究中我们曾经试验多种流动相，发现水相和乙腈比例为80 : 20时，各成分能

15、够得到良好的分离。另外，我们还尝试用不同的溶剂（流动相、甲醇、水）作为稀释剂，发现用水作稀释剂时干扰最小。呋喃西林见光易分解，因而含漱液应避光保存，试验中也应尽量注意避光并加快操作，以免影响结果。本研究建立的HPLC法，专属性高，线性良好，回收率、精密度均符合要求，含量测定结果表明，二者的含量均符合要求。具有分离好、干扰少，准确可靠、操作方便的特点。本研究中，甲硝唑及呋喃西林含量均在标示量的90 110之间，故可以确定复方甲硝唑含漱液中此两种成分含量占标示量范围90 110为控制范围。此外，该方法操作简便，完全可以满足制剂室快检的要求。参考文献致 谢附件三：药理学论文样本本 科 生 毕 业 论

16、 文论文题目：学 校：徐州医学院院 部：药学院专 业：学 号：姓 名：指导教师：实习单位：论文工作时间： 年 月 至 年 月 银杏叶提取物、卡托普利和缬沙坦抑制糖尿病肾病大鼠肾纤维化的机制探索及其比较 摘 要目的：研究银杏叶提取物、卡托普利和缬沙坦对糖尿病肾病大鼠肾纤维化的防治作用及其机制，并比较它们对DN作用的异同，从而为联合用药提供理论基础。方法：SD大鼠一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg诱导糖尿病模型。成模的糖尿病肾病大鼠分为4组：糖尿病肾病组、GBE治疗组 (100 mgkg-1)、卡托普利治疗组 (10 mgkg-1) 和缬沙坦治疗组 (15 mgkg-1)。正常对照组及糖尿病肾

17、病组给予1% 羧甲基纤维素灌胃治疗。治疗12周后收集标本。电镜观察肾小球基底膜厚度；放射免疫法测定肾皮质层粘蛋白和型胶原含量；免疫组化法测定MMP2、TIMP2和CTGF蛋白表达；RT-PCR法测定肾皮质TGF-1mRNA的表达。结果：GBE、卡托普利和缬沙坦均能显著改善DN大鼠肾小球基底膜增厚现象，降低肾皮质中层粘蛋白和型胶原的含量。三种药物一方面通过抑制直接促进ECM合成的TGF -1和CTGF的表达而抑制ECM的积聚，另一方面通过其分解平衡系统MMP2/TIMP2而使ECM表达减少。并且发现GBE改善基底膜增厚的作用较卡托普利和缬沙坦弱，而抑制肾皮质层粘蛋白和型胶原的作用较强。结论：GB

18、E、卡托普利和缬沙坦均可抑制ECM的大量表达，并且GBE抑制基底膜增厚的作用较两药弱，而抑制肾皮质ECM的表达较两药强，这对于我们临床联合用药具有非常重要的意义。关键词 银杏叶提取物 卡托普利 缬沙坦 糖尿病肾病 肾纤维化 联合用药Exploration and Comparison of the effects of extract of Ginkgo biloba, captopril and valsartan on the kidney fibrosis of diabetic nephropathy rats ABSTRACT: Objective: To observe the p

19、reventive and therapeutic effects and the mechanisms of GBE, captopril and valsartan on the early stage of diabetic nephropathy ( DN ) rats, and to compare the differences among them to establish the combination of medication. Methods: Diabetes mellitus models were induced by STZ on rats and the dev

20、eloped DN rats were divided into 4 groups: DN rats with 1% CMC solution treated (DN group); DN rats with 100mg/kg of GBE treated (GBE group), DN rats with 10 mg/kg of captopril treated (CAP group) and DN rats with 15 mg/kg of valsartan (VAL group). Rats of normal group (NS group) and DN group were w

21、ere treated with 1% CMC solution. After 12-weeks treatment, samples were collected. The ultratructural morphology and thickness of GBM were observed under transmission electron microscope; Collagen and laminin in kidney cortex were detected by redioimmunity; CTGF, MMP2 and TIMP2 proteins were measur

22、ed by immunohistochemistry; the relative quantities of TGF-1 mRNA in kidney cortex were determined by a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: GBE, captopril and valsartan markedly reduce the thickness of GBM, decrease the expression of laminin and collagen significantly.

23、 On one hand, they could inhibit the expression of TGF-1 and CTGF which induced ECM directly; on the other hand, they could ameliorate the disequilibrium of MMP2 and TIMP2. Furthermore, we also found that GBE had the weaker effects on reducing the thickness of GBM than captopril and valsartan, and h

24、ad the stronger effects on suppressing the ECM of kidney cortex than the two drugs. Conclusion: GBE, captopril and valsartan can all suppress the accumulation of ECM. Moreover, GBE has the weaker effects on decreasing the thickness of GBM than captopril and valsartan, and has the stronger effects on

25、 suppressing the ECM of kidney cortex than the two drugs, which means vitally to postpone kidney fibrosis of DN on the combination of medication. KEY WORDS: extracts of ginkgo biloba, captopril, valsartan, diabetic nephropathy, kidney fibrosis, combination of medication糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN

26、)是终末期肾衰的主要原因之一，严重影响患者的生活质量和生存率，其病理特征为细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成增多，肾小球基底膜（glomerular base membrane, GBM）的增厚，最终引起肾纤维化。目前对DN的发病机制的研究还未完全明了，但大量的研究表明，转化生长因子-1（transforming growth factor-beta, TGF-1）在DN发病机制中起着至关重要的作用，其下游因子结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）直接促进了ECM的大量表达1, 2, 3 ，而ECM的积

27、聚与基质金属蛋白酶（metalloproteinase, MMP）及其抑制剂结缔组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMP）的表达失衡也密切相关4。因此探讨它们在DN中的变化对于防治DN肾纤维化具有至关重要的意义。银杏叶提取物（extract of ginkgo biloba, GBE）是采用现代提取技术从银杏叶中提取的活性成分，具有多种与DN防治有关的药理作用 5, 6。目前业已证实血管紧张素转换酶抑制剂（Angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEI）和血管紧张素受体拮抗剂（A

28、ngiotensin receptor antagonist, AT2RA）有确切的肾保护作用 7, 8 ，但其具体机制尚未明确。本实验观察GBE、卡托普利和缬沙坦对引起DN大鼠肾纤维化的相关因子如TGF-1、CTGF、MMP2、TIMP2、ECM等指标的影响，探索它们保护肾脏的可能机制，并将GBE对DN的作用与卡托普利和缬沙坦进行比较，从而为防治DN肾纤维化的联合用药提供理论依据。1 材料1.1 实验动物健康雄性SD大鼠（体重150190 g）由徐州医学实验动物中心提供，批号：No. SYXK 2001-0050。实验前测大鼠血糖均正常。1.2 药物及试剂GBE（Lot No 040029）

29、由徐州邳州富伟技术有限公司赠与（其有效成分包括占GBE总量24%的黄酮苷类和占GBE总量6%的萜类），链脲佐菌素（STZ, Lot No P7993b，美国Sigma 公司），缬沙坦（Lot No 050523，杭州默沙东公司），卡托普利（Lot No 050050，常州制药有限公司），层粘蛋白试剂盒和型胶原试剂盒（Lot No 200506）由上海海研医学研究所生物技术中心提供。总RNA提取试剂盒（Lot No 182207）及RT-PCR试剂盒（Lot No 199676）均购自美国Promega公司。2 方法2.1 糖尿病肾病大鼠模型的建立大鼠空腹24 h后一次性腹腔内注射STZ 60

30、mg/kg（临用前以pH4.5的0.1 mmol/L 枸橼酸缓冲液配制），正常对照组（NS组，n=13）仅给等量的该缓冲液。各组禁食72 h后尾静脉采血，测其血糖13.88mmol/L，则糖尿病模型建立成功。将造模成功的SD大鼠随机分为4组：糖尿病肾病组（DN组，n=13）、GBE治疗组（GBE组，n=14）、卡托普利治疗组（CAP组，n=11）和缬沙坦治疗组（VAL组，n=13）。模型建立成功一周后，NS组和DN组每日给与1%羧甲基纤维素灌胃治疗，GBE组、CAP组、VAL组每日分别以100 mg/kg的GBE、卡托普利10 mg/kg、缬沙坦15 mg/kg灌胃治疗。实验期间各组大鼠均自由

31、饮水、进食，12周后宰杀大鼠。左肾肾皮质以甲醛固定，进行免疫组织化学测定。右肾取1mm1mm肾皮质以2.5%戊二醛固定作GBM电镜观察，剩余肾皮质置于-80冰箱保存。2.2 GBM厚度的测定 随机抽取每组三个样本用1锇酸后固定，双蒸水漂洗、醋酸铀快速染色。脱水、浸透、包埋、聚合及切片。电镜（ 6000倍）下观察GBM。每个样本取5个不同视野观察GBM，用图像分析系统（Leica Qwin Standard V2.6; Leica Microsystems, Welzlar, Germany）分析其平均厚度。2.3 肾皮质ECM的检测9 将低温保存的肾皮质标本吸干水分后制备均浆，加含0.15 m

32、ol/L NaCl, 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4的匀浆液5 ml，于冰水浴研成匀浆，离心2000 rpm 10 min，取上清液制成组织匀浆。加提取液1 ml（提取液为 HAc 0.5 mol/L 胃蛋白酶 1 g/L）, 4抽提18 h，取上清液。以放射免疫法测定型胶原和层粘蛋白含量，具体操作参照试剂盒。2.4 免疫组化测定 采用PV两步法。大鼠肾脏经甲醛固定后，梯度乙醇脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片。石蜡切片作MMP2、TIMP2、CTGF（购自博士德公司）免疫组织化学染色。MMP2、TIMP2、CTGF一抗为兔抗鼠抗体, 工作滴度均为150, 二抗为羊抗兔IGg-

33、辣根过氧化物酶（北京中杉生物技术有限公司）。DAB显色，40倍显微镜下观察显色。每张切片选取10个视野进行灰度分析, 以其平均灰度值作为其MMP2、TIMP2、CTGF的表达量。2.5 RT-PCR测定肾皮质TGF-1基因表达及其半定量分析 取50mg 肾皮质进行总RNA提取。采用Promega公司的逆转录聚合酶链反应（RT PCR）一步法进行TGF-1及内参照-actin的基因扩增。TGF-1上、下游引物分别为：5-CCCGCATCCCAGGACCTCTCT-3和 5-CGGGGGACTGGCGAGCCTTAG-3，扩增长度为512 bp；-actin上、下游引物分别为： 5-GCTGCGT

34、GTGGCCCCTGAG-3 和5-ACGCAGGATGGCATGAGGGA-3，扩增长度为252 bp。反应总体系为50 l。扩增条件为：95 预变性5 min，然后94 51min，57 退火50 sec，72 延伸1 min，共40 个循环，最后72 延伸7 min。将TGF-1与-actin的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。置于凝胶图象分析系统进行吸光度分析，用TGF-1与-actin吸光度的比值表示目的基因TGF-1 mRNA的相对表达量。2.6 统计学处理数据以 s表示，采用SPSS10.0 统计软件, 两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P0.05认为有统计学意

35、义。3. 结果3.1 大鼠GBM厚度及肾皮质ECM 电镜下观察GBM，可见DN组GBM呈不同程度的增厚，同一小球内GBM厚度差异明显。脏层上皮细胞部分足突融合、增宽。而GBE组、CAP组、VAL组均有相应的改善（Fig 1）。用图像分析系统统计GBM的平均厚度，并将测定的肾皮质型胶原和层粘蛋白结果进行统计，发现：DN组大鼠的GBM厚度及型胶原和层粘蛋白比正常组显著增多（P0.01），GBE组、CAP组及VAL组的GBM的厚度、型胶原和层粘蛋白水平比DN组显著降低（P0.01或 P0.05），提示三种药物均可显著改善DN大鼠GBM增厚及肾皮质ECM大量堆积的病理改变（Tab 1）。进一步研究发现

36、GBE改善GBM增厚的能力较卡托普利弱（P0.05）；而对于层粘蛋白和型胶原积聚的改善作用较卡托普利和缬沙坦强(P0.05)。而卡托普利、缬沙坦对GBE厚度、型胶原和层粘蛋白的作用的影响无显著性异。NS 组 DN 组 GBE组CAP组 VAL组图1 肾小球基底膜的电镜图片（放大倍数6000倍）Fig 1 The transmission electron micrographs of the GBM (original magnifications 6,000)表1 GBE、卡托普利、缬沙坦对型胶原和层粘蛋白以及基底膜厚度的影响Tab 1 Effects of GBE, captopril a

37、nd Valsartan on the thickness of GBM and quantity of Collagen and laminin ( s)组别样本数（n）GBM厚度（nm）型胶原（g/g）层粘蛋白（g/g）NS13125.8 12.80.306 0.0320.347 0.052DN13267.5 30.0*0.550 0.087*0.745 0.161*GBE14171.4 16.7#0.433 0.047#0.475 0.061#CAP11155.6 15.9# 0.477 0.053# 0.525 0.039# VAL13157.3 17.07#0.463 0.043#

38、0.532 0.047# Compared with NS group, *P0.01; Compared with DN group, #P0.05, #P0.01; Compared with GBE group, P0.053.2 大鼠肾皮质MMP2、TIMP、CTGF的表达 经免疫组化染色后，MMP2、TIMP2、CTGF在肾小球中染色呈棕褐色（Fig 2, 3, 4）。灰度分析发现，DN组CTGF和TIMP2的表达较正常组显著增高，而MMP2较正常组明显降低（P0.01）。同时发现GBE抑制CTGF的作用较卡托普利和缬沙坦弱（P0.05或P0.01）。GBE对MMP2表达的增强作用较

39、卡托普利强，有显著性差异（P0.05）；较缬沙坦也强，但无显著性意义。而CAP组和VAL组的三个指标无显著性差异（Tab 2）。 表2 GBE、卡托普利、缬沙坦对肾皮质MMP2, TIMP2 及 CTGF表达的影响 Tab 2 Effects of GBE, captopril and Valsartan on the expressions in the kidney cortex ( s)组别样本数（n）MMP2TIMP2CTGFNS1327.9 4.7720.0 4.0914.9 3.42DN1315.5 5.47*38.0 5.32*34.2 6.74*GBE1424.7 4.38#2

40、9.9 3.61 #27.1 5.40#CAP1118.7 4.32# 26.2 4.48#21.4 4.32# VAL1321.8 3.60#27.9 3.88#21.03.82# Compared with NS group, *P0.01; Compared with DN group, #P0.05, #P0.01; Compared with GBE group, P0.05, P0.053.3 各组大鼠肾皮质TGF-1的基因表达 从大鼠肾皮质提取的总RNA进行TGF-1 mRNA的RT-PCR扩增，将其产物在1.0 %的琼脂糖凝胶中电泳，可分得分离清晰的条带（Fig 5A）。用TG

41、F-1/-actin的吸光度比值表示TGF-1 mRNA的相对含量（Fig 5B）。结果发现DN 组TGF-1 mRNA较正常组明显升高（P0.01），而经过GBE、卡托普利、缬沙坦治疗后，其表达较DN组显著降低（P0.01或 P0.05）。4. 讨论DN是糖尿病常见的慢性并发症，是致残率和致死率较高的一个临床难题。目前认为其发病是由高血糖为始动因素所引起的血流动力学、代谢异常及细胞因子表达异常等多方面因素综合作用的结果。其病理改变是以大量的ECM堆积、GBM异常增厚、肾脏肥大为特征的肾纤维化性疾病，最终导致肾功能衰竭。因此，寻求延缓DN肾纤维化进程的药物已成为目前全世界研究的热点。正常的肾小

42、球ECM从形态上分为GBM与系膜基质。型胶原、层粘蛋白是ECM 的主要成分。目前，TGF -1是公认的可引起多种疾病纤维化的细胞因子，是引起ECM大量表达的主要因子10。糖尿病状态下，TGF -1表达大量增高。我们在细胞水平上也发现高糖可促使肾小球系膜细胞TGF-1表达增高11。因此有学者提出阻断TGF -1可能不失为延缓纤维化的一个良策。但是研究发现，短期阻断TGF-1的活性能抑制细胞外基质的增加和减轻肾脏纤维化，而TGF-1是一种多功能的细胞因子，除了致纤维化作用外，尚有抗增殖、抗炎等重要功能，长期抑制TGF-1的活性将对机体产生不利影响10，12，为此人们不得不继续寻找其更加特异的作用途

43、径，而结缔组织生长因子（CTGF）被认为是TGF-1的下游效应分子，可通过Smads信号直接参与纤维化过程13。TGF -1不仅导致了CTGF的表达增高，进而直接促使ECM的大量表达，更重要的是它引起了ECM合成/分解系统的失衡，即TIMP的表达增多和MMP的减少14。这其中研究最多的是MMP2/TIMP2。本实验中发现DN模型组肾皮质TGF -1比正常对照组表达明显增高，同时伴随着 CTGF和型胶原、层粘蛋白的表达增高及GBM的增厚。而ECM的平衡系统中TIMP2表达增高，MMP2表达降低。表明DN大鼠ECM的表达增高与其直接促进因子TGF -1和其下游因子CTGF的增高密切相关，同时与其分

44、解酶MMP2的表达减少及抑制分解的酶TIMP2的表达增强也密不可分，也就是说DN情况下存在MMP/TIMP的表达失衡。这与同行学者的研究结果一致15, 16。高血糖情况下，肾脏局部肾素- 血管紧张素系统（RAS）活性增高，血管紧张素 (Ang ) 合成增加，Ang既可直接导致肾脏血流动力学异常，还可作为重要的细胞因子作用于肾脏刺激TGF-1、ROS和ECM的表达17。目前，血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)是公认的对糖尿病肾病具有保护作用的临床一线药物7, 8。GBE具有多种与DN防治有关的药理作用，如改善血流动力学状态、抑制血小板聚集、抗氧化、舒张血管平滑肌等

45、5、6。本实验以卡托普利和缬沙坦及天然药物GBE为目标药物，发现它们可显著地降低TGF -1和CTGF水平，即对ECM合成的直接促进因子有抑制作用；同时我们也发现它们可显著降低TIMP2，增加MMP2的表达，从而最终减少型胶原、层粘蛋白的表达，抑制GBM的增厚。也就是说，三种药物一方面通过抑制直接促进ECM合成的TGF-1和CTGF的表达而抑制ECM的积聚，另一方面通过其分解平衡系统MMP2/TIMP2而使ECM表达减少。我们还发现，在本实验中，GBE对型胶原、层粘蛋白的抑制作用比卡托普利强，而对GBM增厚的抑制作用较卡托普利弱（P0.05或P0.01），与缬沙坦相比，GBE组GBM增厚、型胶原、层粘蛋白的堆积也相对较弱。这提示我们在临床应用中，可将GBE和卡托普利或缬沙坦（尤其是卡托普利）联合使用，对于我们延缓DN肾纤维化将有十分重要的意义。探索其机制，发现GBE对ECM的分解酶MM