利用SCE技术对细胞周期分析方法的研究毕业论文.doc

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1、华中科技大学文华学院 毕 业 设 计（论文）题目（中文）：利用SCE技术对细胞周期分析方法的研究Using the technology of SCE analysis methods of the cell cycle学 生 姓 名： 学号：060109011103 学 部 （系）： 信息科学与技术学部 专 业 班 级： 06生物技术1班 指 导 教 师： 目 录摘要1关键词1Abstract2Key words21. 选题背景11.1 课题来源11.2 国内外的相关研究11.3 目的和意义11.4 课题设计指导思想52. 方案论证72.1方案的设计原理72.2 方案论证73. 材料与方法1

2、33.1 材料与仪器133.2 实验步骤134. 结果与讨论164.1 实验结果164.2 结果分析174.3 结果讨论185. 结论与心得205.1 结论205.2 心得20致谢23附录24附1 实验药品24 附2 实验仪器24参考文献25摘要本文以BrdU-Giemsa技术检测研究了正常细胞和肿瘤细胞的细胞动力学参数和姐妹染色单体交换频率（SCE）频率。姐妹染色单体交换（ sister chromatid exchange）既SCE技术， 是70年代以来迅速发展起来并被人们普遍接受的一种筛检化学诱变物短期实验方法。SCE表示在染色体复制过程中DNA链的等位点发生了交换，标志染色体在DNA水

3、平上存在不稳定性损伤，它能够灵敏的反应DNA受损的情况，并为多种致癌物或诱变物所诱发。许多实验室将该方法作为一种重要的常规手段，运用此种方法可对各种可疑的化学物质的致癌或诱变能力进行测定，检测DNA的损伤程度。关键词：姐妹染色单体交换 细胞周期动力学 SCE频率 细胞代谢活力Abstract： Based on BrdU - Giemsa technology is studied and the normal cell detection of cell tumor cell kinetics parameters and sister chromatids switching freque

4、ncy (SCE) frequency. Sister chromatids exchange (SCE) sister chromatid exchange technology is developed rapidly since the 1970s and is widely accepted a screening chemical mutagenesis content short-term experimental methods. SCE said in chromosome chain of DNA duplicate process such sites, chromosom

5、es happened in exchange of DNA level on stability, it is sensitive to the damage DNA damage, response and for many carcinogens or mutagenesis induced objects. Many laboratory, this method is as an important means of using this method, the routine of various suspicious of chemical carcinogenic or mut

6、ation ability measured, detection of DNA damage.Key words: sister chromatid exchange The cell cycle SCE frequency Cell metabolism1选题背景1.1 课题来源：导师自拟1.2 国内外相关研究：姐妹染色单体互换分析技术是年代以来迅速发展起来并被人们普遍接受的一种筛检化学诱变物短期实验方法。尽管人们对于互换产生的机制和过程尚未十分明了,但是,可以肯定,它能够灵敏地反映受损的情况,并为多种致癌物或诱变物所诱发。当化学诱变物或化学致癌物的浓度不能产生染色体畸变或大大低于产生染色

7、体畸变的浓度时,仍可诱发大量 。这些观点得到大量实验结果的支持和拥护。迄今,世界上许多实验室仍将该方法作为一种重要的常规手段,对各种可疑的化学物质的致癌和/或诱变能力进行评价。之前国内就有人运用此技术对精神分裂症患者外周血淋巴细胞姐妹染色单体交换及其增殖周期进行了初步分析。1.3 目的: 1）掌握体外培养细胞的方法及步骤。2）学习SCE标本的制备技术及其观察方法。3）利用SCE方法的判定细胞周期。4） 检测肿瘤患者的DNA损伤程度、了解其淋巴细胞增殖周期是否与健康人相同。意义：越来越多的资料显示肿瘤是一类细胞周期性疾病，从而使细胞周期分析在细胞生物学、肿瘤生物学领域显得格外重要。对于细胞增殖的

8、细胞周期分析，就是对细胞内周期性变化的物质进行检测，以达到对细胞增殖进行检测的目的。通过检测肿瘤患者外周血淋巴细胞SCE频率，观察每个细胞动力学指数，分析体外培养肿瘤患者淋巴细胞增殖速度，为探讨肿瘤患者淋巴细胞生物学活性提供一些资料。1.4 课题设计指导思想：中期分裂细胞的染色体由两条姐妹染色单体构成，每条单体含有一条长链。在合成期（S）期时掺入人工核苷类似物（体外实验一般为连续掺入两个细胞周期）,参与DNA合成,形成由核昔类似物取代胸腺嘧啶的链。细胞经两次分裂和DNA半保留复制后,中期细胞的两条姐妹染色单体中,有一条掺入了核苷类似物。此时,DNA链中的核苷类似物并不稳定,给予紫外线照射、加温

9、等处理后发生降解,与染料的亲合能力低于天然胸腺嘧啶,染色后形成着色深浅不 同的两条姐妹染色单体。此种方法称为差别染色，差别染色的成败关键，姐妹染色单体差别 染色成败之关键 很大程度上依赖于掺入是否成功。常用的核苷类似物有 5一溴脱氧脲嘧啶核苷（BrdU）、5一氟脱氧脲嘧啶核苷（FrdU）和5一溴脱氧胞嘧啶核昔(BrdC) 等 卤代核苷类似物,其中 BrdU最为常用。本文就以BrdU-Giemsa技术检测研究了正常细胞和肿瘤细胞的细胞动力学参数和姐妹染色单体交换频率（SCE）频率2 方案论证:1).初级的细胞周期分析方法早些年通过显微镜对细胞的观察发现细胞是通过有丝分裂而进行增殖的从而将细胞周期

10、分为细胞问期和有丝分裂期，在显微镜下可以看到有丝分裂期的细胞染色体凝聚。在两次有丝分裂之间的时间内除可看到细胞体积增大外对细胞内其他变化知之很少，此为从细胞形态上对细胞周期进行分析。通过显微镜进行的细胞周期分析是极为粗略的，直到发现染色体中的DNA里携带有遗传信息才对间期有一定的了解在细胞间期一个很短时间内通过在细胞培养液中掺人同位素标记的棱苷只在有DNA合成的细胞中才有被标记上同位素标记的核苷，从而检测到了染色体的复制 ，由此把间期分为3个期，即G1期(有丝分裂期与DNA复制开始的时间段)，S期(即DNA合成的时间段)，G2期(即S期与M期的时间段) 。但是这两种方法因耗材 、粗槌 、效率低

11、 而无法大规模地进行应用。2)传统的细胞周期分析方法 1969年，Van Dilla第一次在流式细胞仪上显示了DNA含量直方图后利用流式细胞仪进行 DNA含量测定成为细胞周期分析中最为广泛使用的方法。该方法的最大优点为不需对细胞进行同步化。这种DNA含量的细胞周期分析法固然简单，但对于今天的细胞周期研究，却显得过于粗略，因为它只能分辨出处于细胞周期中的3个细胞群体，即 G0/G1 期 、S期 、G2/M期细胞。 随着细胞生物学的发展 ，对细胞周期的分析也提出了更高的要求，Dolbeare F等 于 1983年根据BrdUrd为胸腺嘧啶脱氧核苷的类似物，发明了BrdUrD与DNA 同步分析细胞增

12、殖周期的方法 BrdUrd掺之前需要将DNA双链打开变成两个单链核酸，这时 BrdUrd 才暴露出来能够被抗 BrdUrd单抗识别，实现了对S期的分析 。 后来，叉相继出现了能对S期进行更为详细分期的 PCNA/DNA流式细胞术 及由表达于 G1、S、G2及M期，但不表达于G0期细胞的 Ki-67抗原发展而来的 Ki-67/DNA多参数流式细胞术分析方法，但作为细胞周期占时最长的GO/G1期 ，无法对其进行更详细的分析,Ki-67/DNA多参数流式细胞术生物学基础不明，限制其进一步发展Darzynkiewk等率先采用A O(吖啶橙)法进行细胞周期分析，A O既能结合DNA，又能结合RNA，因此

13、可对细胞中的 DNA和RNA同时进行分析，从而实现了对 G0、G1、S、G2 以及 M 期的分析，但由于A O法不易掌握、同时试剂的高酸性容易造成流式细胞仪样品管堵塞 ，限制了A O法的应用和发展 。 3) 细胞周期蛋白的发现、分类以及在各个细胞周期中的表达情况近年来，肿瘤研究中最具突破性的进展是确立了调控细胞周期进程的分子机制。这一机制涉及：细胞周期蛋白（cyclin）,细胞周期蛋白依赖的蛋白激酶家族(CDKs)以及 CDKs抑制蛋白(CKIs)3种类型分子细胞周期蛋白分别在细胞周期的不同时期程序性合成和降解，同时作为调节亚基对CDK活性进行调节 ，CDK的活性还受磷酸化状态的影响。CKI能

14、结台 CDK - cyclin复合物井抑制其活性， CKI失活的异常，使细胞无限增殖。Tim Hunt最早在发育的海胆(sea urchin)和蚌卵(darn eggs)中证实这种蛋白质在分裂间期可以合成cyclins ，而在每次的有丝分裂期又非常快速而神奇地降解。最明显的两种蛋白质 MrS 58000和 62000呈周期性合成和降解，它们被称为 A-型和 B- 型cyclins。后又相继发现了cyclin D、E等细细胞周期蛋白。至今已发现了AI 多种细胞周期蛋白。cyclin家族的水平呈细胞周期依赖性改变，其家族中所有成员都带有约100个氨基酸序列明显相同的区域 ，这个区域被称为cycli

15、n盒。cyclin B1 与CDKI(以前称为EDC2)结合并激活形成有丝分裂促进因子( maturation promoting factor，MPF)，该激酶的激活是细胞进入 M期所必需的。cyclin B1在细胞退出S期时逐渐增加,有 丝分裂时达到最高峰 ，当细胞进入有丝分裂后期时被降解。cyclin A可 与 CDC2或 CDK2结合并激活该激酶，这两种激酶的激活使细胞进入S 期和G2 期。cyclin A在 S 期的中期开始合成，G2期末到达最高峰并于有丝分裂前被迅速降解。cyclin E相应的激酶为CDK2，cyclin E与之结合是细胞进入S期必需的。cyclin E在 G1中期

16、开始合成，在细胞进入S期时达到最大，并于细胞通过S期时逐渐被降解。cyclin D有组织特异性，cyclin D1在纤维母细胞中有较高的表达但在淋巴细胞中只表达cyclin D2、D3。而 cyclin D1为阴性。cyclin D1在有丝分裂原的刺激下的G0期细胞表达达最高峰，当细胞进入对数生长期后降解，cyclin D的主要作用是结合并激活CDK4,该复合物磷酸化视网膜母细胞瘤肿瘤抑制基因蛋白(retinoblastoma tumor suppress geneprotein,pRb)，pRb的磷酸化释放E2F因子，该因子的释放促进DNA的合成，使细胞进入S期。过去的细胞周期分析需对细胞进

17、行同步化，目前认为对细胞进行同步化后 导致了细胞的不平衡生长，并不能代表细胞增殖的真正情况。由于免疫学的进步， 单克隆抗体的产生，Gong J等率先用流式细胞仪同时对DNA及 cyclin进行标记的新一代细胞周期分析方法,真正显示了细胞增殖的情况。cyclin B1、A、E和D的时相性表达与细胞周期的主要分期有关。双变量cyclin对细胞DNA含量(正常人增生淋巴细胞的cyclin B1、A、E和成纤维母细胞的cyclin D1 )和cyclin B1 来说虽然在早、中S期有小量表达，但是主要表达于晚 G1期细胞，G2/M期含量最高。cyclin A于 S期渐进性增加 ，G1/M期达高峰，大多

18、数 G1期细胞的cyclin A要么阴性，要么极低水平表达。cyclin E的表达可总结为以下几点：在 G1-S转换时水平最高；通过S期时持续下降，G2+M期细胞为阴性；在G1-S 转换时cyclin E的表达有一个明显的阈值，在散点图或计数图上细胞群具有连续性，细胞需积累cyclin E达一定的阈值方可进入S期。在增生的淋巴细胞观察到的cyclin B1、A、E 表达的类似情况在正常成纤维母细胞和几种肿瘤细胞中也已观察到了。在正常的成纤维母细胞的对数生长期，cyclin D1的出现仅限于 G0/G1期 ，许多S 、G2/M期cyclin D1为阴性，仅极少数相当于G2/M期 DNA含量的细胞

19、有cyclin D1的表达，这可能是成对的G1期细胞，在 U2-OS肉瘤细胞和C82杂交瘤细胞系中的cyclin D2表达类似于成纤维母细胞的cyclin D1的表达，另外在对数生长期用分裂原刺激人淋巴细胞cyclin D3的表达也差不多，基本上在 G0/G1 期表达，大多S、G2/M期细胞为阴性。cyclin D1仅在早G1期为阳性，G2/M期为阴性，可能是由于分裂后细胞不能立即继承这些蛋白质。但它是在早G1期台成，进入S期前降解。需要指出的是，细胞在对数生长期所受的任何影响如亚融合状态、加入含血清的新鲜培养基、细胞生长抑制物(抗肿瘤药物)均可明显改变cyclin表达，包括其绝对水平及在细胞

20、周期中表达位置均可能改变。正常静止细胞(G0)如外周血非刺激性淋巴细胞cyclin B1、A、D2、D3、E为阴性，起码不能用流式细胞术测得。受刺激后可使 D2、D3然后是 E、A、B1表达。D3在加入分裂原后可提前4h表达。故此淋巴细胞中的D2和D3，纤维母细胞中的D2、D1可能是早期激活抗原作为G0到G1期转换的标志。由于D型cyclin 在细胞周期中的特殊作用，故其表达用于细胞受刺激的标志较用其他指标(如增加细胞RNA含量或改变染色体结构)更优。 由于D型cyclin在G1期的表达是短暂的正常情况下进入S期的，细胞cyclin D1为阴性，这种cyclin D1蛋白质的缺乏本身不能认为是

21、细胞于G0期的状态，但它的存在是细胞已退出G0期的阳性标志。基于cyclin 在正常细胞及肿瘤细胞中的时相特异性已基本明了，因此，根据cyclin及 DNA双参数的流式细胞术分析方法，可对传统的细胞周期重薪分 期，这样可对细胞周期中的各期细胞进行分选，同时进行更为详细的分析为肿瘤的分期及化疗提供更为客观有效的评价指标。4) 展望 细胞周期机制的核心为CDKs调控机制 ，细胞周期蛋白为其重要组成部分。 因此，发展双cyclin，甚至三cyclin等三参数，甚至四参数的多参数流式细胞 仪的细胞周期分析方法，可为肿瘤提供全新的研究方法，可良好地评价肿瘤的增殖状况、恶性程度，甚至对肿瘤细胞进行详细的分

22、期，并可据此肿瘤细胞进行分选，从而对不同特征的肿瘤细胞进行更为详细的分析。3 材料与方法3.1器材与仪器：材料：健康人外周淋巴血液器材：超净工作台、酒精灯、5m1无菌注射器、5号针头、10ml培养瓶、橡皮塞、75酒精棉球、水平式离心机、定时钟、试管架、量筒、10ml刻度离心管、冰玻片，毛细滴管、恒温水浴箱、恒温培养箱、托盘天平、光学显微镜,恒温电热板，紫外灯照射装置试剂：RPMI1640、小牛血清、肝素(500U/ml)、秋水仙素(5g/ml)、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸为31，现用现配）、0.075mol.L-1KCI低渗液、Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、5NaHC

23、O3。2mg/ml Brdu溶液，无菌生理盐水；2XSSC溶液：Nacl 17.54g 柠檬酸钠8.82g 加水至1000ml。3.2 实验步骤：一、采血与接种用一次性5ml注射器取500U/ml的肝素0.2-0.3ml湿润针筒后，然后将多余的肝素排除。常规消毒被检者肘部皮肤，从肘部静脉采血2ml。转动针筒以混匀肝素；随后在超净工作台中将血液滴入盛有5ml培养液（4ml RPMI l640、lml小牛血清，0.2ml PHA，用5的NaHCO3调pH至7.07.4）的培养瓶内，每瓶0.30.5ml（7号针头约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。二、培养 体外细胞培养（人外周血淋巴细胞培养）（

24、一）冻存1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。2、1000rpm离心10min，弃上清液。用Hanks液清洗1-2次。3、淀用配制好的Hanks液+20% 胎牛血清+10%甘油或DSMO的细胞冻 存液稀释，计数，调整至5106/ml左右。4、 将悬液分至冻存管中，每管1 ml。5、 将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、 贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。7、 按下列顺序降温：室温4（20min）冰箱冷冻室（30min）低温冰箱（30 1h）气态氮（30min）液氮。注意：冷冻操作和添加液氮时要注意戴保护眼镜和手套，以免液

25、氮伤人，切勿用裸手直接接触液氮，以免冻伤。液氮定期检查，在液氮挥发1/2时要及时补充，绝对不能挥发干净，一般30L的液氮能用11.5月。留在液氮罐外的系线要做好标记并做到沿着罐口顺序摆放。（二）复苏1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装三分之二37的温水。2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻 存物在1min之内融化。3、用酒精棉球消毒冻存管表面，打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中并立即加入5倍以上的Hanks液。4、1000rpm离心10min，弃去上清液。5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10min，弃上清液。6、 加适当培养基调整细胞浓度5105后将

26、细胞转移至培养瓶中，37、5%二氧化碳、饱和湿度下培养24小时后，加入Brdu，使Brdu的最终浓度为10-15ug/ml，摇匀后立即放回37温箱避光培养48小时。 （Brdu染色原理：5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy-urdine, BrdU）在DNA的复制过程中，掺入新合成的链并占有胸腺嘧啶（thymidine, T）的位置。根据DNA的半保留复制规律，哺乳动物或人的细胞在BrdU的培养液中经历了两个周期后，它的两条姊妹染色单体的DNA双链在化学组成上有了差别。当染色体的DNA链的两条多核苷酸链都被BrdU所替Giemsa染色显示浅色，如果染色体的DNA链中仅有一条多核苷酸链

27、被BrdU所替换，Giemsa染色显示深色。）7、在终止培养前2h，将5g/ml的秋水仙素12滴（5号针头）加入培养瓶内（终浓度为0.05g/ml），轻轻摇匀放回温箱内，继续培养2h。三、染色体标本的制备（胰蛋白酶法）1. 收获细胞 用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入10ml刻度离心管内，平衡后放入离心机内，离心810min（1000r/min），弃上清液。2. 低渗处理 加8ml预温（370C）的0.075mol.L-1KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，放在37恒温水浴锅中，静置1520min，使白细胞膨胀，染色体分散（精确的低渗时间应自行摸索）。3.固定（1）预固定：低渗处理完

28、成后，加入现配制固定液1ml，吹打均匀。1000 r/min离心810min，弃去上清液。（2）固定：沿离心管壁加入新配固定液8ml打匀， 1000 r/min再离心810min，弃去上清液。（3）再固定：再加入新配固定液8ml，打匀（静置30min），1000 r/min离心810min，弃去上清液。4. 制片 视细胞多少，加入适量新配固定液制成细胞悬液，将细胞悬液2-3滴，滴到清洁的冰玻片上，在酒精灯火焰上来回过几下（勿全烤干），空气中晾干。5. 染色 晾干的标本用Giemsa染液（Giemsa原液pH6.8磷酸缓冲液为19）染色810min、自来水冲洗、晾干后镜检。四、镜检将制备好的染色

29、体玻片放置到显微镜下，先用低倍镜找到分散良好的分裂相，然后后换高倍镜、油镜、认真观察。五、分化染色1 将未染色的标本正面朝上，罩于60水浴锅金属板表面，滴加2XSSC溶液，使玻片表面被一层溶液覆盖。2 打开15-20瓦的紫外线灯，在距离约5厘米处垂直照射10分钟。3 用细流水洗去2XSSC溶液，1：10 Giemsa磷酸缓冲液染色10分钟，细流水冲洗，干燥后即成SCE标本。六、观察与计数先在低倍镜下寻找中期分裂相，然后转油镜观察。若发现该分裂相的每条染色体都出现SCD 说明它在Brdu 加入后经过两个细胞周期，再仔细观察哪些染色体有姐妹染色体姐妹染色单体有片段交换，即SCE。计数时，若染色体臂

30、的一端出现交换计一次，着丝粒处发生交换（应排除染色体在此发生扭曲）计一次，若染色体的中间出现交换则计两次。每份标本至少计数25个分裂相，再计算SCE频率。附：注意事项1PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。浓度一般用200300g/ml，每毫升培养液加0.20.3ml，浓度过高可能会导致红细胞凝集。 2秋水仙素浓度与处理时间，一般最终浓度以0.05g/ml为宜，处理时间为2小时。如果浓度太低，处理时间太短，则分裂相少；浓度太高，处理时间太长，则分裂相虽多，但因染色体缩得太短而形态特征模糊。3培养温度应严格控制

31、在37+0.5。4双蒸水pH值应在6-7之间。5低渗一步极为重要，关系到染色体分散的好坏，因此低渗液的浓度与低渗的时间应掌握好。6离心速度不宜过高，速度太高细胞团不易打散，反之，分裂相易丢失。7固定液应临用时新鲜配制，固定时一定要彻底吹匀，若吹打不够则细胞在玻片上成堆，反之则细胞易碎，以至染色体数目不完整。8培养液的pH值应掌握在7.07.2左右，偏酸细胞发育不良，偏碱则细胞出现轻度固缩。9玻璃器皿要十分干净、无酸，所用试剂以分析纯的为好。10无菌操作过程应保持高度无菌概念，严防细菌和病毒污染。11在外周血培养过程中，PHA对淋巴细胞的刺激效应个体差异较大，同样方法和条件，分裂相多少及分散情况

32、可各不相同。4结果与讨论4.1 实验结果:采集图片：健康人M1:健康人M2:健康人M3:健康人M4:健康人M5:肿瘤患者M1:肿瘤患者M2:肿瘤患者M3:肿瘤患者M4:肿瘤患者M5:4.2实验数据与结果分析：表1正常男性淋巴细胞周期/肿瘤患者淋巴细胞周期（M1M2M3）比率和PRI 结果分析：从表1可以看出肿瘤组中M2期细胞的百分数低于正常组，而第三周期的细胞所占的百分数高于正常组，说明肿瘤患者的淋巴细胞增殖周期交正常人短。 4.3 结果讨论：SCE表示在染色体复制过程中DNA链的等位点发生了交换，标志染色体在DNA水平上存在不稳定性和损伤，如果某一个体的SCE有明显增高，说明染色体收到环境中

33、一定因素的影响，或者是受到遗传缺陷的内在制约因素所致。本研究结果显示，肿瘤患者SCE明显高于正常组，说明其染色体不稳定。在正常情况下，人类外周血中淋巴细胞不再分裂， 几乎都处于G0期。但当加入植物血凝素(PHA) 后，在这种有丝分裂原作用下，能使原来处于G0期的小淋巴细胞转化成大的能够进行有丝分裂的大淋巴细胞。由于Brdu在DNA复制中可被作为核苷酸前体掺入到新合成的DNA中，取代胸腺嘧啶核苷，细胞在含有Brdu的培养基中经历 2个周期后，中期染色体两条单体的DNA双链在化学组成上就有了差别，利用此方法可明显地区分培养细胞的分裂周期。 5 结论与心得 1 结论：本文结果表明：在同等条件下， 体

34、外同时培养了肿瘤患者和健康人的淋巴细胞，结果显示肿瘤患者的淋巴细胞增殖周期较健康人短。SCE频率较健康人高。 2 心得：在实验中要严格遵守实验步骤、实验要求，不能大意马虎。对于有温度要求的操作步骤，一定要等到温度达到要求时方可操作，否则会影响反应效果，导致实验失败。俗话说万事开头难，做试验一定要敢做敢问，不要怕做错或者最后做失败了，只要严格按照实验步骤一步一步操作，加上严谨的态度，总会得到预期的结果的。如果做失败了一次，就要反思哪些步骤出现了问题，哪些不当操作影响了实验结果，找出问题所在之后再去重新做一边，操作中就会胸有成竹，也顺手的多。试验中团队合作也是很重要的一环，有时候比较复杂的操作就需

35、要他人的帮助才能顺利完成，如果实验失败了自己想不出来问题所在，也可以向周围同学请教，一个人一条思路，说不定你会从同学那里得到很大的帮助。致谢 几个月的毕业设计让我结识了良师益友，从开始的开题报告到最后的论文写作，李老师都给了我很大的帮助，我不懂的地方，她会很耐心的给我讲，同时帮我收集了很多附录：常用溶液配置(一)1/15mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS)甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液Na2HPO4 9.465g蒸馏水 加至1000ml乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液KH2P04 9.07g蒸馏水 加至1000m1分

36、装在棕色瓶内，于4冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液,见下表:pH 甲液ml 乙液mI pH 甲液ml 乙液mI 5.29 5.59 5.91 6.24 6.47 6.64 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 40.0 97.5 95.0 90.0 80.0 70.0 60.0 6.81 6.98 7.17 7.38 7.73 8.04 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 95.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 5.0(二)10gml秋水仙素 秋水仙素 lOmg生理盐水 100ml装入茶色瓶中，为贮备液，4冰箱中保存。

37、甩时取贮备液1ml加生理盐水9ml即可。(三)Giemsa染液 1贮备液Giemsa粉 1g 纯甘油 66ml 甲醇 66ml 先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油，充分研磨，呈无颗粒的糊状。再将全部甘油加入，放入56温箱中2小时，然后加入甲醇，保存于茶色瓶中。一般两周后使用为好。(四)BrdU溶液(200ug/m1) 用无菌青霉素瓶，在室温下称取1.0mg，在无菌条件下加入灭菌生理盐水9.0ml，溶解，混匀，用黑纸包严，避光置冰箱冰格中保存。最好用时现配。 (十)2SSC溶液用分析天平称取氯化钠17.53克，柠檬酸钠8.82克溶于蒸馏水中，加蒸馏水至1000毫升。参考文献：1 谢雄等译 1

38、981 化学物质致突变性检测法 ,人民卫生 出版社2 黑木登志夫 1981 国外医学 卫生学分册 8：148.3 White et al. 1980 Mut.Res. 69:2834 Madle 1981 Mut.Res. 85:3475 Speit 1982 Mut.Res. 105:2616 Hartwell LHKastan MB Cell cycle comrol and cancer J. Science.19 94.266:182l1828 7 吴昊，王秀琴科学通报 1980；25：239.8 陈勇夫,等中华老年医学杂志1986；144.9 罗立华,等中华老年医学杂志 1986；4：44.10 王毓銮,等山西医药杂志1984；5：26311 金霈，等.肿瘤防治研究 1985；8：132.12 吕宝忠，等.遗传学报 1981；12：1.13 Heerma NA,et al. Cancer Genet Cytogenet 1982;6:323.14 彭光斌，等. 中华内科杂志 1984；23：65.15 Abe S ,et al. Cancer Res 1980；40:1292.