人教版高中选修一生物 2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(共28张PPT).ppt

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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与记数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,1、了解尿素尿素是一种由C、H、O、N组成的有机化合物，分子式为CO(NH2)2，它是动物体内蛋白质代谢的产物，在肝脏中合成后，随尿液排出。,课题背景,尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的某些细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、尿素的利用,主要目的：（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。,课题目的,科学实

2、例：寻找耐高温的DNA聚合酶,说明：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。,一、筛选菌株,耐高温的酶,耐高温生物体,耐高温环境（热泉、火山口）,寻找,寻找,2、方法：,实验室如何筛选菌种,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,1、原理：,使用选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他

3、种类微生物生长的培养基。,根据原理，培养基应如何配制，才能将分解尿素的细菌分离出来？,利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、培养基选择分解尿素的微生物的原理,6、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素

4、细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定体积样品中微生物的数量。,二、统计菌株数目,不能区分死菌与活菌,缺点,2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,2.稀释涂布平板法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释

5、液中的一个活菌。,稀释涂布平板法得到的菌落,每克样品中的菌株数=（CV)MC:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。,两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可

6、能出现了错误。,资料分析：,注意事项一般选择菌落数在30-300的平板进行计数为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。统计的菌落数往往比活菌实际数目低。,因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落,1图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程,（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_，每克土壤样品中的细菌数量为_个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较_。,稀释涂布平板法,1.75x108,少,1、为

7、什么土壤中的细菌能分解尿素，实验室中筛选微生物的原理。2、实验室中筛选分解尿素的细菌的培养基称为什么培养基？该培养基最重要的特点是什么？3、统计菌落数目的方法有哪两种？缺点分别是什么？,听写内容：,三、设置对照,1、目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。,6、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,在做本课题实验时，A同学从对应106稀释的培养基中筛选出150个菌落，其他同学在同样的稀释度下筛选出

8、50个菌落其他同学认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，不同的原因是自己所用的土壤样品与其他同学不同，但由于自己在实验时未设置对照，因此也拿不出能令人信服的证据。请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。,资料分析：,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明是土样不同引起；如果结果不同，则

9、证明A同学的操作有误。,土样不同,操作有误导致培养基被污染,二.实验设计.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品的稀释,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原

10、因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,微生物的培养与观察,利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？,思考：,不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。,课题延伸：鉴定菌株,原理：产脲酶的细菌将尿素分解成氨，培养基PH会升高，通过检测培养基PH变化来判断该化学反应是否发生。,方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养该细菌，如果PH升高，指示剂变红，可以初步鉴定该种菌能分解尿素。,