新人教版高中生物选修1-2.1_微生物的实验室培养(共53张PPT).ppt

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1、课题1微生物的实验室培养,专题2微生物的培养与应用,1、说明有关培养基的基础知识，概述无菌操作技术包括的主要内容（重点）。2、能制备培养基，并进行微生物的分离和培养。（难点）,课题背景,19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发现导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们意识到保持培养物纯净的重要性。防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。,到目前为止，几十项诺贝尔生理学和医学

2、奖，化学奖都与微生物学有关,微生物的类群,原生生物(如草履虫、衣藻等),原核生物(细菌、蓝藻等),真菌(如酵母菌、霉菌等),病毒,微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物。,无细胞结构,原核细胞,微生物:,结构简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.,1、提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件2、确保其它微生物无法混入,实验室培养微生物条件,培养基,无菌技术,1.基本成分：,思考：微生物“吃”什么？,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨

3、等,自养微生物,异养微生物,氮源,无机氮源：,有机氮源：,NH4、NO3-,牛肉膏、蛋白胨、尿素等,注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源,一、培养基,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,培养基的营养构成:碳源、氮源、水、无机盐特殊营养物质,牛肉膏又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。,蛋白胨是肉类等蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。它可以作为微生物培养

4、基的主要原料，一般来说，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、肉类）、植物蛋白（豆类）、微生物蛋白（酵母）等三种。能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。,无机盐,Ca、K、Mg为大量元素，以无机盐阳离子形式被吸收，配培养基要加磷酸盐、硫酸盐。Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培养中有0.1PPM就可以了，自来水原料中已够用，不需另加。,水,是细胞中生化反应的良好介质；营养物质和代谢产物都必须溶解在水里，才能被吸收或排出体（细胞）外。水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温度骤然上升。维持细胞的膨压（控制细胞形态）。,2.特殊营养物质：,维生素、氨基

5、酸、碱基等,（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）,3.pH、氧气、渗透压等的需求：,例如:生长因子(即微生物生长繁殖所必需的，而自身不能合成（或合成能力有限）的化合物。如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶),按化学成分不同分：天然培养基/合成培养基,4.培养基的种类,4.培养基的种类,固体培养基,液体培养基,有无凝固剂琼脂,按物理状态不同划分:,是（1.5%-2.5%）,是（0.2%-0.7%,否,分离、计数、鉴定等,观察微生物的运动、保存菌种等,扩大培养、工业生产,琼脂：一种从红藻中提取的多糖。在980C以上熔化，在440C以下凝固，在常规培养条件下呈固态。,固体培养基：观察菌落、鉴定、分离和计数划

6、线法、稀释涂布分离法,半固体培养基：,无动力有动力(弥散),观察微生物运动、保存菌种,液体培养基,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,鉴别培养基:,在培养基中加入某种指示剂或化学药品。用以菌种的鉴别。,4.培养基的种类,按用途不同划分:,在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。,鉴别培养基,伊红和美蓝培养基,大肠杆菌,伊红和美蓝培养基,菌落呈深紫色，并带有金属光泽,代谢产物,例：,选择培养基:,在培养基中加入（缺少）某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长

7、。用以菌种的分离。,4.培养基的种类,鉴别培养基:,在培养基中加入某种指示剂或化学药品。用以菌种的鉴别。,按用途不同划分:,例：大肠杆菌,伊红和美蓝培养基,菌落呈深紫色，并带有金属光泽,代谢产物,利用拓印法选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌。,选择培养基,怎样选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌?,加入青霉素的培养基：,加入高浓度食盐的培养基：,不加氮源的无氮培养基：,不加含碳有机物的无碳培养基：,分离出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌),分离出金黄色葡萄球菌（高浓度食盐能杀死多种微生物）,分离出固氮菌（非固氮菌因缺少氮源被淘汰）,分离出自养型微生物（异养微生物因缺少有机物被淘汰）,以下

8、选择培养基可以分离的微生物？,牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。,分析营养构成？,1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方,碳源、氮源、磷酸盐和维生素,氢元素、氧元素,无机盐,碳源、氮源和维生素,凝固剂,2.无菌范围：,实验操作空间消毒,操作者的手、衣着消毒,实验用具灭菌,实验操作过程:酒精灯火焰旁操作,超净工作台,二、无菌技术,泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,防止外来杂菌的污染,1.无菌的意义：,二、无菌技术,消毒：用温和的化学或物理方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢、孢子）的过程。,3.无菌的方法：,灭菌：以强烈的理化因素杀死物体内外

9、所有微生物（包括芽孢、孢子），达到完全无菌的过程。,泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,消毒与灭菌,(1)消毒的方法：,煮沸消毒法：,100煮沸5-6min,巴氏消毒法：,(低温消毒法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法,现在常常被广义地用于定义需要杀死各种病原菌的热处理方法),70-75下煮30min或80下煮15min,化学药剂消毒法：,用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源,紫外线消毒：,对实验室空气消毒,灼烧灭菌：微生物学实验室的接种环、接种针、试管口等的灭菌,(2

10、)灭菌的方法：,干热灭菌：160-170下加热1-2h。,适用于玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)和金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌。,(2)灭菌的方法：,高压蒸汽灭菌：100kPa、121下维持15-30min.,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。,(2)灭菌的方法：,较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）,强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）,煮沸消毒法,日常生活,100煮沸56min,巴氏消毒法,不耐高温的液体,7075煮30min或80煮15min,化学药

11、剂,生物活体、水源等,擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源,紫外线,房间、仪器设备,紫外线照射30min,灼烧灭菌,接种工具、接种时用的试管口或瓶口等,直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧,干热灭菌,耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等,物品放入干热灭菌箱,160170加热12h,高压蒸汽灭菌,培养基、培养皿等,生产和实验室常用,高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121,1530min,3.无菌的方法：,消毒与灭菌,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细

12、菌用的培养基与培养皿。（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管。（3）实验操作者的双手。,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,旁栏思考,灭菌,灭菌,消毒,3.使用后的培养基丢弃前应怎样处理？,使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。,微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存,三、实验操作,大肠杆菌的纯化培养,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌,例如：,1.计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.称量：,3.溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,

13、牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、NaCl,琼脂、搅拌,补水定容,4.调pH、分装、封口：,5.灭菌：,6.倒平板：,加棉塞、包牛皮纸、橡皮筋勒紧,培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,计算称量溶化调节pH灭菌倒平板无菌检查,计算称量溶化调节pH灭菌倒平板无菌检查,1,2,3,4,2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。,3.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约1020mL)倒入培养皿，左手立即盖上皿盖。,4.等待平板冷却凝固（约需510min）。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。,1.将培养皿放在火焰旁的桌面上，右

14、手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。,倒平板注意事项：温度：50左右操作：在酒精灯火焰附近冷凝后平板倒置,防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,7.无菌检查：,37的恒温箱中培养12h24h，无杂菌污染才可用来接种.,培养基灭菌后，需冷却到什么时候，才能用来倒平板？,约50,为什么这样操作？,为什么平板需倒置？,1.培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。,2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与

15、皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。,答：将所倒平板放入37的恒温箱中培养12h24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。,3.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？,单个细胞,单个菌落,从混杂的微生物群体中获得只含某一种微生物的过程。,何为分离纯化？,如何纯化？,什么是菌落？,微生物群,分散或稀释,（二）纯化大肠杆菌,原理：,在培养基上，将细菌分散或稀释成单个细胞，使其长成单个菌落。,单个或少数菌体,2.特征：,大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。,3.功能：,1.定义：,菌落

16、,鉴定菌种的重要依据（微生物的菌落特征因种而异）,固体培养基上,大量繁殖,子细胞群体,单个细胞,单个菌落,从混杂的微生物群体中获得只含某一种微生物的过程。,何为分离纯化？,如何纯化？,平板划线法,如何分散成单个细胞？,稀释涂布平板法,微生物群,分散或稀释,（二）纯化大肠杆菌,原理：,接种方法（纯化方法）,在培养基上，将细菌分散或稀释成单个细胞，使其长成单个菌落。,分区划线法,连续划线法,（1）概念与原理：,聚集的菌群,连续划线,稀释分散,单个细胞,单个菌落,生长繁殖,1、平板划线法,(2)“平板划线”实验操作,1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。,2、在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞,3

17、、将试管口通过火焰,.4、将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液,.5、将试管通过火焰，并塞上棉塞,.6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。,7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。,8、将平板倒置放入培养箱中培养。,划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）,1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,第

18、1区划线,接种环灭菌,第2区划线,接种环灭菌,第3区划线,接种环灭菌,接种环灭菌,分区划线法,1,2,3,4,5,接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.划线首尾不能相接每次划线前接种环进行灭菌划线后,培养皿倒置培养,平板划线法注意事项:,（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者,杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞,杀死接种环上原有微生物,问题讨论,（2）在灼烧接种环之后，为什么要

19、等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,（3）在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,问题讨论,3个划线平板,1个不划线平板,（重复实验）,（空白对照）,（3）培养,放入37恒温箱中培养12h24h,系列稀释操作：,涂布平板操作：,(1)概念与原理：,聚集的微生物,单个细胞,菌液梯度稀释,单个菌落,涂布平板,(2)操作：,生长繁殖,2、稀释涂布平板法,涂布器,系列梯度稀释操作,9mL无菌

20、水,9mL无菌水,9mL无菌水,9mL无菌水,9mL无菌水,9mL无菌水,注意：移液管需要经过灭菌；试管口和移液管离火焰12cm处。,1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按101106顺序编号。,2、用移液管吸取1ml菌液，注入101倍稀释的试管中。使菌液与水充分混匀。依次类推，直至完成最后一支试管的稀释。,注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰12cm处。,微量移液器,系列梯度稀释操作,101,102,103,104,105,106,涂布平板操作：,1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中,滴,2、取少量稀释液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面,灼,3、将沾有少量酒精的涂

21、布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。,试,涂,4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀,各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照,各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照,放入37恒温箱中培养12h24h,（3）培养,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未

22、达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,搁置斜面,1.临时保藏：,接种到试管固体斜面培养基上，培养长成菌落，4冰箱保存。（菌种易被污染、变异）,2.长期保存：,（1ml甘油（灭菌）1ml菌液）,五、课题延伸（菌种的保藏）,采用甘油管藏法，-20保存,微生物的特点1.个体微小，结构简单-在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。2.繁殖快-生长繁殖快，在实验室培养条件下细

23、菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。3.代谢类型多，活性强。4.分布广泛-有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。5.数量多-在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。6.易变异-相对于高等生物而言，较容易发生变异。在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。微生物种内的遗传多样性非常丰富。所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。,资料袋,【典例解析】,例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有

24、较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,答案：D,例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前,答案：

25、B,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是A正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,（1）右表培养基可培养的微生物类型是。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入.,自养型微生物,含碳有机物,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：,（4）表中营养成分共有类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是。（6）右表中各成分重量确定的原则是。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是。,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养。,固氮微生物,