外源性纤维素酶对草鱼生长性能及肠道菌群的影响.docx

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1、华中农业大学本科毕业论文外文翻译外源性纤维素酶对草鱼生长性能及肠道菌群的影响原文来源：Zhou Y, Yuan X, Liang X F, et al. Enhancement of growth and intestinal flora in grass carp: The effect of exogenous cellulaseJ. Aquaculture, 2013, 416: 1-7.摘要：植物蛋白已经被确定为在水产养殖上具有最大潜力的能够替代鱼粉的食物蛋白来源。然而，植物成分里含有大量的纤维素，鱼类利用糖类物质的能力有限。纤维素作为一种糖类物质不能很好地被鱼类利用。我们这个实验用浮

2、萍饲养草鱼来研究外源性纤维素对草鱼生长的影响。2个月的饲养试验显示：纤维素能促进草鱼的生长。另外，纤维素还能增强草鱼各种消化酶活性，例如纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶，但是脂肪酶活性没有增加。同时，PCR-DGGE分析表明：饲喂纤维素的鱼肠道菌群的种类和密度都有变化，实验组和对照组样品的DGGE条带通过聚类分析表现出很小的相似性，有些条带是对照组特有的而有些条带只有实验组才有。16SrRNA测序表明变形菌门和厚壁菌门是两个优势菌群，而确定的有助于消化的细菌包括杆菌和鞘氨醇单胞菌。之前的研究和本实验建议:内源性的消化酶并不足以消化吸收纤维素，所以纤维素酶可以作为一种水产饲料添加剂。关键词：草鱼 浮萍

3、纤维素酶 生长性能 肠道菌群 消化酶1.前言由于全球日益增加的鱼粉需求量、价格以及全球供应波动，人们急于寻求一种其它的水产饲料蛋白质来源(NewandWijkstrm, 2002)。人们将很多注意力放到了植物蛋白上，但是蛋白的利用率受到必需氨基酸和矿物质的限制以及某些抗营养因子，尤其是糖类物质(Vielma et al., 2003)。鱼类和哺乳动物比起来，它们不能有效地消化糖类物质作为一种能量来源纤维素是以葡萄糖残疾以-1,4糖苷键连接而成的高聚物，是植物细胞壁的主要组成分，同时也是自然界最主要的糖类种类(Preza and Samain, 2010)。它是由高度结晶与非结晶的微纤维矩阵镶嵌

4、的复合形式构成，因此不易被水解酶水解。要消化纤维素而作为一种能量来源就需要一种酶能够裂解-1,4糖苷键从而释放葡萄糖单位(Barret al., 1996)。纤维素分解细菌和真菌形成了一种能够将含有不可溶纤维质的基质向可溶性糖类转化的复杂体系(Tomme et al., 1995)。纤维素酶存在于多种无脊椎动物中(Martin, 1983;Zinkler and Gotze, 1987)。但是，几乎没有高等动物能够有效使用这种资源(Goodenough and Goodenough,1993)。关于水解酶的基础应用研究展示了它们在各行各业包括食品、动物饲料、酿造和酿酒，农业，生物质精炼，造纸，

5、纺织，洗衣房的水解酶研究(Karmakarand Ray, 2011)。最几年，纤维素被用来作为一种提高畜禽生长性能和养分利用率的重要措施(Titi and Tabbaa, 2004)。然而鱼体内对于纤维素的适当的识别信息，表征，以及酶是稀缺的(Gao et al., 2006;Yu et al., 2001)。由于鱼粉越来越不足，纤维素已经成为评价植物营养价值的重要因素。草鱼(Ctenopharyngodon idella)，一种典型的草食性鱼类，以水草为食，能同时利用动物、植物因素，它的消化机制相当复杂(DeSilva, 2003; FAO, 2004)。 Das and Tripathi

6、 (1991)以不同天然食物和人工饲料饲喂草鱼研究了草鱼的消化酶。吞下浮萍后纤维素酶活性是最高的。在本实验中，纤维素酶被添加到饲料中以研究酶对草鱼生长性能和肠道菌群的影响。其结果可以为饲料添加剂提供非常有用的信息。作为一种典型的草食性鱼类，草鱼对于纤维素的应用信息也可以为其它鱼类提供一些参考。2.材料和方法2.1鱼和实验条件草鱼从广东淡水鱼场（中国广东花都区）获得。浮萍(L. minor Linn.）被收集起来倒掉多余水分然后保存在-200C。后面的营养成分分析用AOAC（2000）的标准程序。鱼养在1000L的池塘里，保持每天12小时光照，12小时黑暗，水温保持在23-250C，水保持过滤与

7、流动。每天早上10点向鱼投喂切碎的浮萍直到饱食。每天清除粪便以及残饵。将鱼置于这样的条件下适应2周。表1是饲料的干物质营养成分近似组成。在适应完2周后，这些鱼（99.63.2g）被分成两组，实验组饲喂切碎的浮萍、小麦粉和纤维素酶的混合饲料，对照组饲喂浮萍和等量的小麦粉。每组分3个1000L水池，每个水池30尾鱼。如此饲喂2个月。酶是利用来自木霉属longibrachiatum(SIGMAC9748, USA)的真菌纤维素酶。酶特征显示其包含大于或等于1.0单位mg-1的纤维素酶活性。1单位相当于酶在PH5.0，370C条件下1h从纤维素中施放1umol葡萄糖。纤维素酶以3g kg-1浮萍的量添

8、加（足以完全消化浮萍中的纤维素）与小麦粉混合。浮萍和小麦粉的比例为10:1，饲喂前所有组分均混匀。保温时间大概30min并没有确切的定义。混匀后，饲料用一台手动碎肉机做成直径3mm大的小球。每日上午9点和下午4点各喂食一次，每次喂食不少于30min，日投食量为鱼体重的3-4%。每2周测定一次体重，日投食量随体重改变。投食后30min手机残儿和粪便，烘干计算摄食率。饲养期间，循环水保持在3L min-1水温保持在23-250C，溶解氧保持在7.50mg L-1总氨氮低于0.10mg L-1，PH保持在7.4-7.8。2.2 取样和生物分析在饲养中期（30天）时测定鱼的体长和体重，饲养结束时（60

9、天），经过24h饥饿处理，然后用50mg L-1MS-222麻醉。每条鱼单独测量体长体重。每个池塘随机挑选6条鱼，肠道切开，其中3条鱼的肠道用来测定消化酶活性，其它3条鱼的肠道用来进行肠道微生物群落分析。增重率（WGR）以以下公式计算：WGR (%) = (Wf Wi) / Wi 100，Wf是末重，Wi是初始体重。特定增长率（SGR）用以下公式：SGR (%) = (lnWf lnWi) / days 100。长度和重量用来计算肥满度：condition factor (%) = 100 W / L3,W为鱼体重（g），L为鱼体长（cm）。2.3酶活性测定将肠道取下来称重，然后在冰上匀浆。将

10、匀浆液于40C 5000r 离心15min，然后去掉上层的脂质层。取上清液，分成几个小部分，然后保存在-200C以供测定消化酶活性。肠道提取物的蛋白质含量用BCA方法计算。纤维素酶活性按照Zhang et al. (2009)提供的方法计算，用羧甲基纤维素钠作为基质。反应物包含2ml组织匀浆上清液、2ml基质，混合物置于370C反应30min。葡萄糖的减少用消极水杨酸测定，然后在540nm波长测定吸光度。吸光度绘制成葡萄糖0.1-2.0mg L-1标准曲线。酶活性按照葡萄糖释放和酶稀释的线性关系为基础进行计算。纤维素酶活性表示为每分钟每mg蛋白质释放出多少ug的葡萄糖。淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活

11、性测定用试剂盒（中国南京建成生物工程研究所），按照生产商的说明进行测定。一个淀粉酶活性单位表示成每30min水解10.0mg淀粉。蛋白酶活性表示成酶活动需要造成0.003个光密度变化。一单位脂肪酶活性表示为每分钟能水解多少m mol基质。酶活性表示成比活度（U protein-1）。2.4 DNA提取和PCR扩增整个肠道在无菌条件下切除、收集，然后轻轻地挤出内容物。为了避免个体差异带来的影响，我们从每个池塘取3条鱼，将样品混合到一起用(Sugita et al., 1991)的方法分析肠道微生物的多样性。全基因组DNA用超净TM粪便DNA工具包（MOBIO, USA）按照说明书进行提取。所有D

12、NA样品保存在-200C以待使用16SrRNA V3 区用细菌特异性引物8F，（5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3;518R,5-ATTACCGCGTGCTG-3，Baker et al., 2003） 一个GC夹(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)被添加到正向引物的5端以增强DGGE分析的敏感性(Muyzer et al., 1993)。PCR扩增在50uL反应体系中进行，包含2.5ng DNA，5uL 10PCR 缓冲液，.04uM 各引物，200uM各dNTP，1.25 U Ex Taq 酶（TAKARA, Japan）。按以

13、下步骤进行降落式PCR：940C 10min，接着在940C进行1min 30个循环，550C（按每个循环减少10C） 1min，720C 1min，最后在720C进行延长10min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳显影然后用密度扫描仪（AlphaImager,Alpha Innotech, USA）进行分析，根据质量每组选取两个样进行DGGE分析。2.5 DGGE分析PCR产物的DGGE分析用D码突变检测系统（Bio-Rad，USA）根据厂商说明进行。简而言之，将每个几乎等体积40uL的样品装载到8%变形梯度为30-60%的聚丙烯酰胺凝胶。然后在600C 150V电泳7h，然后经过银染拍照。下一步

14、用图像分析软件进行DGGE条带的密度和洄游模式的计算。用version5.0条带扫描软件进行主成分分析。聚类分析用来确定样品微生物群的相似性通过BIOEDIT 7.0，PHYLIP4.0和MEGA5.0软件使用算术平均值的加权对群法进行相似矩阵构建。2.6 克隆和测序DGGE优势条带被切离并用50uL洗脱液（0.5M 醋酸铵，10mM乙酸镁，10mM EDTA(PH8.0),0.1%SDS）然后在370C下平衡3h。经12,000g 离心5min ，取上清液，然后使用乙醇沉淀，再加入Tris-EDTA缓冲液溶解，DNA作为模板按照上述条件进行扩增。PCR产物用超净的PCR提纯试剂盒(MOBIO

15、, USA)纯化，然后使用pMD18-T向量（TAKARA, Japan）克隆到大肠杆菌DH5细胞。重组体被放入加有氨苄青霉素LB的盘子进行蓝-白色彩选择鉴定以及PCR鉴定，每个PCR碎片中的3个阳性克隆用来进行测序。16SrDNA基因序列用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行分析，然后对所有序列进行进化分析，用MEGA 5.0软件以p-distance模型构建系统发育树。系统发育树用1000个重复进行自展分析。2.7 数据分析与统计所有数据以均数标准差（标准误差）经t检验采用SPSS17.0进行统计分析。统计显着性水平为5的测定。3 结果3.1 生长性能表2

16、显示纤维素酶对草鱼增重率和特定增长率有显著性差异（P0.05）。在30天和60天的时候，实验组增重率和特定生长率显著高于对照组（P0.05）。实验组鱼肥满度在30天的时候显著高于对照组（P0.05），在60天的时候有所下降，但无显著性差异（P0.05）。另外，在摄食率上并没有显著性差异（P0.05）。3.2 消化酶活性如表3所示，实验组纤维素酶活性(2.10 0.10 g 葡萄糖 min1 mg蛋白质纤维1)显著高于对照组(1.65 0.02 g 葡萄糖min1 mg 蛋白质纤维1) (P 0.05)。实验组的淀粉酶和蛋白酶活性也有显著性增强(P 0.05)。同时，两个组的脂肪酶活性并没有显著

17、性差异(P 0.05)。3.3 PCR-DGGE分析为了研究纤维素酶对肠道微生物群落的影响，我们选择用PCR-DGGE来分析鱼类肠道微生物总DNA。PCR-DGGE指纹图谱的每个泳道代表每一组鱼3条的混合样品。两个对照组的所有条带是基本相似的（图1）。同时，实验组的两个平行条带有部分不同（图1）。然而，非加权平均法聚类分析和多维标度分析显示实验组的肠道菌群集结成群但不同于集结成群的对照组（图2）。通过聚类分析对照组和实验组的条带只有很小的相似性（77.8%；图2）。有些条带是对照组特有的（条带1,2,917,18,22,23和26）然而有些条带却只存在于实验组中（条带14,15,19,20,2

18、1,24和25）。3.4 进化分析为了更好的明确草鱼肠道微生物群落，将DGGE优势条带切离用于测序（图1）。所有的16 S r DNA基因序列已被存入基因库核苷酸序列数据库，其编号从KC146687到KC164703。将测得的序列同基因库比对然后将编号列于表4中。细菌的系统发育分布操作分类单位（OTU）基于阈值的相似度是95%如图3所示。变形菌门是优势菌群，其中包括变形菌纲，变形菌纲，变形菌纲。除此之外，其它的运算分类单元则是厚壁菌门。4.讨论尽管草鱼养殖在很大程度上依赖于饲料配方，本次试验根据研究焦点以浮萍作为饲料，具体操作如下。浮萍，作为草鱼的一种天然食品，比其它植物性蛋白具有跟丰富的必需

19、氨基酸而更接近于动物性蛋白(Hasan and Chakrabarti,2009; Hillman and Culley, 1978; Ylmaz et al., 2004)。浮萍生长在具有高浓度的营养元素如K、P等营养盐以及一些色素特别是能让浮萍成为鱼类的优质食物的胡萝卜素的富营养水体中（Kabir et al., 2009）。然而，浮萍同时含有大量鱼类不利于利用的糖类物质，尤其是复合糖包括纤维素。经研究表明，用浮萍饲喂草鱼使得草鱼肠道纤维素酶活性显著高于其它饲喂人工饲料和自然食物的草鱼(Das and Tripathi, 1991)。同时，我们前期的研究表明在草鱼食性转换期饲喂不同食物（浮

20、萍和轮虫）会使得草鱼肠道发展和消化酶活性具有显著性差异（未发表）。这些结果显示：草鱼对食物具有适应性，可以根据不同食物而调节肠道活动。但是，这种调节是受到限制的，草鱼必须依赖外源性的消化酶来帮助其消化吸收(Drew et al., 2005; Wang andLiu, 2006)。因此,本文选取浮萍的来测定外源纤维素酶的这种高纤维饲料对草鱼实用的影响以及为新蛋白的来源的发展提供数据支持。另外，浮萍的的营养成分组成也符合草鱼的生长需求。纤维素酶能促进草鱼生长和显著提高草鱼消化道酶活性。通常情况下，饲料中添加酶能显著性提高对虾(Buchanan et al., 1997)和鲶(Debnath et

21、 al., 2005)的增重率，但是与Yan et al. (2002)饲喂的鲶的结果相矛盾。关于家禽、猪和反刍动物的研究显示纤维素酶可以提高饲料价值和动物性能(Karmakar and Ray,2011; Kuhad et al., 2011; Titi and Tabbaa, 2004)。向团头鲂(Yu et al., 2001)和鲤鱼(Gaoet al., 2006)的高纤维饲料中添加纤维素酶能够提高其饲料利用率。但是向神仙鱼的菜籽饲料中添加不同比例的纤维素酶对其生长性能及饲料利用率并没有显著性影响(Erdogan and Olmez, 2009)。纤维素酶由具有不同最适合温度和PH的不

22、同真菌和细菌分泌。另外，不同的酶对不同事物的水解能力不同。在之前的研究中，纤维素酶从不同的生产商哪里获得，使用的不同剂量，使得很难对其做一个比较性分析。另外，大多数研究并没有明确表明精确的酶活性。但至少在草鱼饲料中添加纤维素酶对于提高草鱼的生长性能以及其饲料价值是有效的。这个影响同时也和草鱼肠道消化酶活性息息相关。草鱼是有胃鱼，消化发生在肠道里，在肠道里各种各样的没参与食物的消化和吸收过程，如淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂酶和碱性磷酸酶（Das and Tripathi, 1991）。以前的研究表明草食性的鱼类肠道消化酶活性比肉食性鱼类消化道活性更强(Bairagi et al., 2002;

23、 Dhage, 1968;Phillips, 1969)。草食性鱼类相对于肉食性鱼类而言，其脂肪酶活性相对要低些(Das and Tripathi, 1991; Opuszynski and Shireman, 1995)。本实验中，实验组草鱼淀粉酶活性和蛋白酶活性显著高于对照组，同样地，实验组纤维素酶活性显著高于对照组而脂肪酶无显著性差异。这个相似的趋势在其他研究中(Li et al., 2005; Lin et al., 2007)也有体现，在他的研究中，随着饲料中添加的酶水平增加的情况下，淀粉酶和蛋白酶活性显著性增加。此外，消化酶活性通常和鱼的生长率有关（Hidalgo et al.,

24、1999）。相似的结果在目前的脆肉鲩研究中也有体现。调节饮食可以调节鱼类肠道菌群结构这个结论已经比较成熟(Burr et al., 2005; He et al.,2013; Navarrete et al.,2009; Ring et al., 2006)。另一方面，肠道菌群对鱼的消化吸收也起到重要作用(Dimitroglou et al., 2011; Merrifield et al., 2010; Ramirezand Dixon, 2003)。本实验中，尽管实验组由于个体差异使得两个平行之间有些差异，非加权组平均法和聚类分析显示实验组肠道菌群聚类在一起而对照组的聚类在一起，两个组又彼

25、此隔离。另外，表1的结果显示纤维素酶显著改变草鱼肠道菌群的种类和密度。之前的研究已经得到了肠道的不同菌群以及他们与营养吸收的关系(Thillaimaharani et al., 2012)。因此，我们推断可能是由于食物中添加了纤维素酶从而引起肠道内消化酶活性改变，进而引起营养物质的改变，从而使得肠道菌群发生变化。同时，胃肠菌群还能影响免疫状态，抗病力，存活率以及饲料利用率(Denev et al., 2009)。因此，外源性的酶能够改变肠道微生物，反过来微生物也能改变肠道消化酶活性以及草鱼的生长性能。鱼类不能分泌纤维素酶，但是在它们胃肠道的菌群可以帮助它们消化植物性食物（Bairagi et

26、al., 2002; Lesel et al., 1986; Lindsayand Harris, 1980; Saha and Ray, 1998）。Saha et al. (2006)和He et al.(2009)从草鱼肠道分离得到能够分泌纤维素酶的细菌。此外，这些实验组样品中还有其独特的运算分类单元(14, 15, 19, 20,21, 24 和 25)。通过16SrRNA测序测得它们为鞘氨醇单胞菌、芽孢杆菌和纤毛菌属。尽管不能确定这些菌能分泌纤维素酶，但是鞘氨醇担保均和芽孢杆菌可以缓和纤维素的量，同时还能分泌淀粉酶和蛋白酶(Ghosh et al., 2002; Haichar et

27、 al., 2007; He et al., 2009; Saha et al.,2006)。由这些结果我们可以推断：实验组肠道菌群的改变，尤其是某些确定菌株包括芽孢杆菌和鞘氨醇单胞菌，可以促进对纤维素的消化。然而，特定细菌在鱼类健康和消化方面扮演的角色仍然不清楚。因此，对于鱼类肠道菌群的进一步研究在水产养殖业上显得尤为重要。草食性动物包括草食性鱼类能够合成纤维素酶，不是靠其本身而是依靠其消化道内的微生物(He et al., 2009; Saha et al., 2006)。然而这些酶对于粗纤维的消化吸收能力是有限的。因此，需要向鱼饲料中添加纤维素酶，尤其是在喂食植物性饲料的时候。此外，杂食性和肉食性的鱼类则需要添加更多的纤维素酶。根据之前的研究以及本实验的研究结果，纤维素酶可以作为一种鱼类饲料添加剂。另外，目前的商业纤维素酶都是酸性的，其PH低于鱼类肠道的PH。因而反应条件，基板的选择，加工方法，应考虑到生产适合鱼类消化系统的生理环境中的纤维素酶和在各种各样的鱼饲料的多酶体系纤维素酶的实际应用。5.结论作为一种典型的草食性鱼类，草鱼被挑选出来用浮萍投喂用来研究外源性纤维素酶对其生长的影响。结果显示，纤维素酶提高了草鱼消化酶活性，改善肠道菌群，以及促进生长。内源性的纤维素酶并不足以完全消化吸收纤维素，所以应该发展纤维素酶作为一种饲料添加剂。11