有机白萝卜表皮附生乳酸菌链霉素抗性分析-生物工程毕业论文.doc

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1、毕 业 论 文题 目:有机白萝卜表皮附生乳酸菌链霉素抗性分析 学院(直属系): 食品与生物工程学院 年级、专业 : 2011 生物工程 学 生 姓 名: 学 号: 指 导 教 师: 完 成 时 间: 2015年5月20日 目 录摘 要1Abstract11 前言11.1 抗生素的定义11.2 抗生素的用途简介11.3 萝卜表皮附生乳酸菌11.4 链霉素11.5 16S rRNA分析技术在乳酸菌分类学的应用11.6 本论文研究的目的及意义12 材料和方法12.1 材料和仪器12.1.1 样品12.1.2 试剂12.1.3 仪器12.1.4 培养基及配制12.2 实验方法12.2.1 乳酸菌的培养

2、12.2.2 乳酸菌的分离纯化12.2.3 乳酸菌总DNA的提取12.2.4 16S rRNA目的基因的PCR扩增及克隆分析12.2.5 最小抑制浓度（MIC）的测定13 结果13.1 乳酸菌的分离13.2 基因组DNA的提取13.3 16S rRNA的PCR扩增片断电泳结果分析13.4 重组子的筛选和鉴定13.5 16S rRNA分析13.6 链霉素抗性分析结果14 结论1总结与体会1致谢词1参考文献1摘 要以市售的有机白萝卜为研究对象，分析其表皮附生的乳酸菌对链霉素的抗药性。分离菌株的16S rRNA和抗药性分析表明：从有机白萝卜表皮分离得到的43株菌分别属于Pediococcus pen

3、tosaceus（44%）、Leuconostoc mesenteroides（16%）、Leuconostoc pseudomesenteroides（5%）、Leuconostoc citreum（16%）、Leuconostoc holzapfelii（14%）和Weissella cibaria（5%）。在分离得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P. pentosaceus中，有5株菌表现出对链霉素的抗药性；L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides对链霉素都表现为敏感；L. citreu

4、m、L. holzapfelii和W. cibaria分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。【关键词】有机白萝卜；乳酸菌；链霉素；抗药性AbstractThe epibiotic lactic acid bacteria (LAB) on the surface of organic radish were investigated by MRS culture, 16S rRNA and antibiotic resistance. 43 isolates in current study were assigned to Pediococcus pentosaceus (44%), Leuc

5、onostoc mesenteroides (16%), Leuconostoc pseudomesenteroides (5%), Leuconostoc citreum (16%), Leuconostoc holzapfelii (14%) and Weissella cibaria (5%). And 8 (18.6%) isolates displayed the resistance of streptomycin. Among the Pediococcus pentosaceus, there were 5 isolates resistances of streptomyci

6、n. For Leuconostoc mesenteroides and Leuconostoc pseudomesenteroides, all of them were sensitive to streptomycin. In the Leuconostoc citreum, only one isolate displayed the resistance of streptomycin; Regarding the Leuconostoc holzapfelii, 1 isolate was resistance; For the Weissella cibaria, 1 isola

7、te was resistance.Keywords: Organic white radish; Lactobacillus; streptomycin; resistance1 前言白萝卜是根菜类的主要蔬菜，属十字花科、萝卜属的一年或二年生草本双子叶植物1。在我国白萝卜栽培历史悠久，是一种药食同源的大众化蔬菜，富含维生素C、芥子油、淀粉酶和粗纤维，具有促进消化，增强食欲，加快胃肠蠕动和止咳化痰的作用，可以治疗或辅助治疗多种疾病，为食疗佳品，被本草纲目称之为“蔬中最有利者”，因此常被作为水果而鲜食1。乳酸菌是蔬菜表面常见的附生微生物，长期以来被普遍认为是安全2。然而，近年来越来越多抗生素抗药

8、性乳酸菌被发现具有一定可转移的抗药性，为乳酸菌的安全敲响了警钟。1.1 抗生素的定义抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌3培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下万种。1.2 抗生素的用途简介抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次氏体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，通常将抗菌素改称为抗生素。抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中

9、产生的一种物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人工合成的。通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种非病毒感染的药物。 但是在临床使用中已经显现了许多副作用。1.3 萝卜表皮附生乳酸菌乳酸菌（lactic acid bacteria）是一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，它属于发酵糖类，其主要产物为乳酸。乳酸菌是一群细菌，它们数量相当庞大，种类异常复杂，到目前为止共发现有200多种，并分成了18个属。其中相当大的一部分都是我们人体所必须并具有重要生理功能的菌，而且人体的肠道中大量存在着这些菌。并且国内外生物学家都认为人类身体的健康程度和生命的长短都与肠道中的乳酸菌有着非常密

10、切的关系。乳酸菌的发酵原理是：乳酸菌进行无氧呼吸，葡萄糖即经过糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸再脱氢产生乳酸。乳酸菌可将酪蛋白被分解成肽和氨基酸，而且乳糖和柠檬酸可生成芳香性物质，从而产生风味。乳酸球菌和乳酸杆菌对蛋白质有较强的分解能力，是高酸生成菌。乳酸菌还有分解脂肪的能力，三丁酸甘油酯易被乳酸菌发酵剂分解。1.4 链霉素链霉素属于抗生素中氨基糖苷类。链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。 1943年美国S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。链霉素是一种从灰

11、链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳定。硫酸链霉素制剂外观为黄色粉末，密度0.38g/L，pH1.53.5，易溶于水，呈微酸性，在中性和酸性条件下稳定，碱性条件下易失效。1.5 16S rRNA分析技术在乳酸菌分类学的应用16S ribosomal RNA是16S rRNA 的全名，它是原核生物的一种核糖体RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。由于其种类少，普遍性存在，分子

12、大小适中，总量一般占细菌rRNA总量的80 %左右，在结构与功能上具有高度的保守性和特异性，基因序列一般包含约50个功能域，基因序列的变化缓慢，所以将16S rRNA 用作分子指标, 这样能实现微量、快速、准确、简便的对乳酸菌进行分类鉴定。16S rRNA中的S是沉降系数，反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标。此沉降系数分为3种：5S、16 S和23 S，他们对应的编码基因（rRNA）的链长为3300、1540、120个核苷酸，细菌蛋白质的合成过程是由它们和核糖体大小亚基组合在一起共同完成的。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S

13、 rRNA 基因片段一般有3 种分析方法: 第一种是，将PCR 产物与16S rRNA 种属特异性的探针杂交，从而获取微生物组成信息。样品与探针也可以直接进行原位杂交检测，这样既能分析它们的空间分布，还能测定微生物的丰度和形态特征。此方法优点是简洁方便， 通常大量应用于快速检测,。缺点是可能出现假阴性或假阳性结果。第二种是在质粒载体上将PCR 产物克隆，然后进行测序。通过将结果与16S rRNA 数据库中的序列进行比较的方法，找出它在进化树中的位置，这样就可以鉴定出萝卜表面乳酸菌中存在的乳酸菌种类,。此方法优点是获得的信息比较全,缺点是如果成分太复杂，工作量会很大。第三种是，对PCR 产物进行

14、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism s,RFLP)分析, 然后观察其酶切电泳图谱和数值分析来确定萝卜表面乳酸菌基因的核糖体型, 然后与核糖体库中的数据进行比较，这样可以分析不同种属之间的关系。随着分子分类的方法和理论的日渐成熟，16S rRNA分析技术成为了微生物分类学研究的一种可靠的工具。细菌主要是根据是细菌生理、生化性状和形态特征进行分类, 采用的对乳酸菌进行纯培养分离方法，然后鉴定其生理、生化、形态、反应特征和免疫学特性4-5。1.6 本论文研究的目的及意义随着人们生活水平逐步提高，人们越来越重视食品安全问题。有机蔬菜纯

15、天然、不含任何农药残留，通常被称为“零污染”的蔬菜，因此备受消费者青睐。然而，近年来越来越多抗生素抗药性乳酸菌被发现具有一定可转移的抗药性，为乳酸菌的安全敲响了警钟。该研究以期待为有白机萝卜鲜食的食品安全评价提供参考。2 材料和方法2.1 材料和仪器2.1.1 样品有机白萝卜样品购买于成都有机蔬菜种植基地零售超市。2.1.2 试剂2.1.2.1 DNA提取与检测试剂表1 DNA提取与检测试剂试剂生产厂家ddH2O北京奥博星生物技术有限责任公司TE Buffer北京奥博星生物技术有限责任公司10%（W/V）SDS北京奥博星生物技术有限责任公司20 mg/mL蛋白酶K北京奥博星生物技术有限责任公司

16、5M NaCl北京奥博星生物技术有限责任公司CTAB/ NaCl溶液（pH8.0）成都市科龙化工试剂厂241氯仿/异戊醇成都市科龙化工试剂厂25241 苯酚/氯仿/异戊醇成都市科龙化工试剂厂异丙醇成都市科龙化工试剂厂无水乙醇、70%乙醇成都市科龙化工试剂厂电泳级琼脂糖成都市科龙化工试剂厂核酸染色剂成都市科龙化工试剂厂DNA Marker I, DNA Marker VII成都市科龙化工试剂厂2.1.2.2 PCR扩增试剂表2 PCR扩增试剂PCR扩增试剂生产厂家4种底物：dNTP (dATP+dCTP+dGTP+dTTP)Tiangen公司10Taq 缓冲液Tiangen公司Taq DNA p

17、olymerase ( 5.0U/l )Tiangen公司MgCl2（25mM）Tiangen公司PCR mixture东盛公司2.1.2.3 16S rRNA目的基因的PCR扩增表3 16S rRNA目的基因的PCR扩增试剂16S rRNA目的基因的PCR扩增试剂生产厂家10PCR buffer；东盛公司脱氧核苷酸（dNTP 混合物）；东盛公司Taq DNA 聚合酶；东盛公司DNA 模板；东盛公司引物P1:Eu27f, AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG东盛公司引物P2:1490R, GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 东盛公司三蒸水东盛公司2.1.3 仪器

18、表4 实验所用仪器及设备仪器生产厂家IS09001电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司BCD-155TD GA冰箱青岛海尔股份有限公司DSX-280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器宁波甬安医疗器械制造有限公司LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂SW-OJ-LF洁净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司PTC-200 型 PCR 扩增仪美国 MJ Research 公司DYCP-31DN 型琼脂糖水平电泳仪北京六一仪器厂GEL DOC XR 型凝胶成像分析系统美国 Bio-Rad 公司2.1.4 培养基及配制2.1.4.1 MRS培养基配制方法（配制量1 L）(1) 称取酵母粉 5

19、g，蛋白胨 10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，柠檬酸铵2g，乙酸钠5g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2g，碳酸钙20g于1 L的烧杯中；(2) 加入约800mL（80%）去蒸馏水，加热充分搅拌溶解；(3) 滴加1mol/LNaOH，调节pH至6.56.8；(4) 加去蒸馏水至1L；(5) 加入15g琼脂，高温高压灭菌（121灭菌30min），待冷却至60左右时摇匀倒平板，每个平板的培养基加20mL左右，平板制成后保存于4。2.1.4.2 MRS液体培养基(1) 称取酵母粉 5g，蛋白胨 10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，柠檬酸铵2g，乙酸

20、钠5g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2g于1L的烧杯中；(2) 加入约800mL（80%）蒸馏水，加热充分搅拌溶解；(3) 滴加1mol/LNaOH，调节pH至6.56.8；(4) 加蒸馏水至1L，充分搅拌均匀后，分装入试管中（5mL/支）；(5) 高温高压灭菌（121灭菌30min），保存。2.2 实验方法2.2.1 乳酸菌的培养随机选取有机白萝卜表皮25 g放于225 mL无菌生理盐水中，振荡30 min，制成细菌原液。用移液枪取900l无菌水于EP管中，再取100l细菌原液，混合均匀记为1:10；吸取1:10的细菌液于900l无菌水中混匀制成1:100细菌液；吸取1:10

21、0的细菌液于900l无菌水中混匀制成1:1000细菌液; 吸取1:1000的细菌液900l无菌水中混匀制成1:10000细菌液。配制液体MRS培养基200mL，灭菌后倒10个平板，待其冷却凝固后于恒温箱过夜，用移液枪取100l菌种于平板，用玻璃涂棒将菌种涂均匀，作好标记，每个浓度的细菌液接两个平板，于37恒温箱培养48h6。2.2.2 乳酸菌的分离纯化在MRS固体培养基中加入碳酸钙，将菌种稀释至合适的浓度，均匀涂布于加入碳酸钙后的固体培养基，37恒温培育48h。乳酸菌会在含有碳酸钙的培养基上产生溶解圈，观察挑选有碳酸钙溶解圈的单菌落（最好挑一些溶解圈半径较大的），然后在MRS 固体培养基上反复

22、划线，直到分离长出单菌落。将分离的单菌落编号菌种在MRS固体培养基上，保藏温度4，备用。2.2.3 乳酸菌总DNA的提取(1) 将已培养至饱和的细菌液吸取2.0mL，10000rpm离心2min，弃上清，加ddH2O无菌水洗涤，10000rpm离心2min，弃上清；(2) 沉淀物加入555 l TE buffer，充分悬浮（不能有菌团），加入40 l 10 SDS和5 l20 mg/mL蛋白酶K，悬振混匀，37温育1h；(3) 加入100l 5M的 NaCl，混匀，再加入80l CTAB/NaCl溶液，混匀，70温育10 min；(4) 加入780l 241氯仿/异戊醇，混匀，4，12000r

23、pm离心5min，上清液转入新管中，弃废管；(5) 加入等体积的25241 酚/氯仿/异戊醇（注意取下层溶液），混匀，4，12000rpm离心5min，上清液转入新管中，弃废管；(6) 加入0.6体积的异丙醇，轻轻混匀，4静止2h，4，12000rpm离心10min，弃上清，500l70乙醇洗涤，4，12000rpm离心10min，弃上清；(7) 真空干燥10min，加入TE buffer 30l溶解，-20保存7。2.2.4 16S rRNA目的基因的PCR扩增及克隆分析2.2.4.1 16S rRNA目的基因的PCR扩增(1) PCR引物Forward Primer：Eu27F(5-AGA

24、GTTTGATCCTGGCTCAG-3，10M )；Reverse Primer：1490R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，10M)；(2) PCR反应16S rRNA 序列的PCR反应体系（50l）如表5表5 16S rRNA PCR扩增反应体系PCR反应试剂添加量灭菌水(ddwater)33.75 l10Taq 缓冲液（冰上解冻）5 ldNTP( 冰上解冻)4 lMgCl2（25mM）3lForward Primer1 lReverse Primer1 l模板DNA2 lTaq DNA 聚合酶(Tiangen，5 U/l)0.25 l按以下程序在PCR自动扩增仪中对目的基

25、因进行扩增：95预热 5 min95变性1 min 50退火1 min 35 cycles72延伸2 min72延伸10 min反应结束后，20保存。(3) 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物取PCR扩增后的产物5 l，加1 l 6 loading buffer混匀，上样于1.0%的琼脂糖凝胶，电泳检测扩增效果。DNA Marker VII 5 l作标准，1 TAE缓冲液介质，4 10 V/cm直流电电泳。2.2.4.2 连接反应（Ligation)和重组DNA的转化从PGM-T ligation Kit剂盒（Tiangen公司）1 l连接缓冲液加入到200 l的Eppendorff 管中。然后加入

26、扩增后的DNA片段4 l，再加入pGM-T载体 1 l ，再加入3 l ddH2O，T4 DNA ligase 1 l轻轻混匀后（注：以上添加溶液顺序不能颠倒）在PCR仪中16过夜连接。连接结束后取3 l重组质粒DNA加入到冰上已解冻的装有感受态大肠杆菌DH5 Eppendoff 管中，轻轻混匀，冰上放置30 min，42热激90s，迅速置冰水浴中2 min，加入已经在37预热的SOC培养基300500 l，37摇床培养45 min。2.2.4.3 重组菌落的筛选向含氨苄青霉素的LB培养基平板培养皿中加入40 l X-gal和30 l IPTG后涂布平板，37放置13 h，加入100 l重组大

27、肠杆菌液涂在LB平板上。Eppendoff管中剩余的400 l重组大肠杆菌DH5在4 12000 rpm下离心 1 min，倒掉上清液约300 l，微型震荡仪上悬震菌体沉淀，吸取菌悬液涂于新的LB平板。涂好后的平板在37培养15 h左右，挑选白色的菌落。2.2.4.4 重组大肠杆菌的扩大培养将LB液体培养基分装入试管中，每管约4 mL，121，灭菌20 min，冷却后每管加入5 l氨苄青霉素（25 mg/mL）。用无菌牙签挑取白色的单菌落接种于试管中，37，150 rpm震荡培养1518 h，直至从试管另一面看不到牙签即可。2.2.4.5 重组质粒的提取和鉴定质粒的提取参见质粒小提试剂盒（Om

28、ega公司）的说明操作，步骤如下：(1) 柱平衡步骤：向吸收柱CB3中（吸附柱放入收集管中）加入500 l的平衡液BL，12000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(2) 取1.5 mL在2.2.4.4中培养的大肠杆菌，加入到Eppendorf管中，使用普通离心机，12000 rpm离心1分钟，尽量去除上清液。(3) 向留有菌体沉淀的Eppendorf管中加入250 l溶液P1（先确认是否已加入RNaseA），使用旋涡混匀器彻底悬浮菌体沉淀。(4) 向Eppendorf管中加入250 l溶液P2，温和的上下翻转4-6次使菌体充分裂解。(5) 向Eppendorf

29、管中加入350 l溶液P3，立即上下翻转，充分的混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000 rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。(6) 小心的将上清液用移液枪转移到吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。室温放置12分钟，12000 rpm离心30 60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(7) 向吸附柱CB3中加入700 l漂洗液PW（先确认是否已加入无水乙醇），12000 rpm，离心30 60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装入收集管中。(8) 向吸附柱CB3中加入500 l漂洗液PW，12000 rpm（-13400g）离心30-60秒，倒

30、掉收集管中的废液。(9) 将吸附柱重新装入收集管中，12000 rpm离心2分钟。(10) 将吸附柱CB3放置于一个干净的Eppendorf管中，向吸附膜的中央部分滴加50 100 l洗脱缓冲液EB，室温放置1分钟，12000 rpm（-13400g）离心2分钟将质粒溶液收集到Eppendorf管中。(11) 为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入带有吸附柱的Eppendorf管中，重复（10）的操作。(12) 将上面收集到的质粒DNA保存在-20备用。(13) 限制性内切酶处理质粒DNA：在1.5 mL的Eppendorf管中加入灭菌水1.5 l/管、酶EcoR I 1 l/管，然后再

31、加入质粒DNA 2 l/管，用手指轻轻弹匀，小型离心机上离心使管壁上的液体落入管底，37酶切1 h，电泳检测。2.2.4.6 DNA序列的测定该部分送往成都博瑞克生物技术有限公司完成。2.2.5 最小抑制浓度（MIC）的测定根据欧洲抗微生物药物敏感委员会关于微生物对不同抗生素敏感阈值X的数据库分析菌株的抗生素抗药性。当分离菌株的最小抑菌质量浓度(Minimal Iinhibitory Concentration, MIC) Xg/mL时为敏感性菌株，反之当MICXg/mL为抗药性菌株。最小抑制浓度的测定采用微量肉汤稀释法。培养液制备：在2mL MRS液体培养基中接种从平板上挑取的单菌落，然后在

32、30环境中静止培养过夜，然后用生理盐水稀释至每毫升1107 个细胞的浓度，即得到培养液。将STR配制成2048g/mL的贮存液，MRS液体培养基2倍梯度稀释成使用液。STR的梯度稀释浓度为21024g/mL。向96孔板中加入198L含不同浓度抗生素的MRS液体培养基后，接种2L分离菌株的培养液（1107CFU/mL），37静止培养24h后，统计不同菌株的MIC，每组实验重复3次并设置空白对照。3 结果3.1 乳酸菌的分离乳酸菌是指发酵时能够产生乳酸的一大类细菌，包括40个属，近300个种。MRS平板分离乳酸菌时，利用其产生的乳酸溶解CaCO3形成溶钙圈的特性，实现乳酸菌的初步分离。在当前研究中

33、，从平板中分离得到43个溶钙圈菌落，编号为为LS1到LS43。3.2 基因组DNA的提取DNA作为分子生物学研究的基础,在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入，在此基础上产生的基因工程技术已在医药、畜牧业等领域获得广泛应用。研究和应用DNA的基础是提取纯化结构完整的DNA，实验中将SDS法和CTAB法结合用于DNA的提取，不仅能使微生物细胞能更完全的得到破碎，并有利于蛋白质等杂质与DNA的分离。实验结果如图4。 图3 Wide Range DNA Marker 图4 部分乳酸菌的总DNA电泳结果图由图4可看出每条泳道均出现清晰的条带且与Marker的条带基本一致。实验中染色剂Gold-vie

34、w中所含有的EB嵌入核酸双链的碱基之间，形成EB-DNA复合物。该复合物，经紫外光照射，可以发出红-橙色的荧光。1 ng的DNA即可检出。由电泳亮斑可知，细菌基因组DNA的大小超过12 kb，因此，则可认为达到了对基因组DNA的提取要求。3.3 16S rRNA的PCR扩增片断电泳结果分析所有样本菌的16S rRNA基因皆进行了PCR扩增，扩增后电泳检测的结果如图6所示。 图5 DNA Marker III 图6 16S rRNA的PCR扩增电泳图（部分） 由图6电泳亮斑可知，对所有样本菌的16S rRNA基因皆进行了PCR扩增。所扩增片段的大小在1200 2000 bp之间，和原核生物的16

35、S rRNA基因片段大小一致，因此达到了对微生物的16S rRNA基因的PCR扩增目的8。3.4 重组子的筛选和鉴定以Taq DNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个碱基A，pGM-T载体，其结构图谱如图7所示，具有一个T碱基的粘性末端，它们既可按碱基互补配对原则，将目的片段与载体相连，构建成重组子。pGM-T载体不仅含有多克隆酶切位点，还含丝状噬菌体f1的复制起始区，用于产生环状ssDNA；含有T7和SP6 DNA聚合酶启动子；在多克隆区域具有编码-半乳糖苷酶的基因（lacZ），插入失活-肽可在指示平板上通过蓝、白菌落直接筛选重组菌落。图7 pGM-T结构图谱本实验采用了内切酶EcoR对

36、重组质粒进行了切割，EcoR酶的切位点如图8所示。阳性重组子经酶切后有16S rRNA目的基因片段电泳亮斑，并和DNA Marker 中长度为1.5 kb的核酸片段亮斑位置相一致。由检测图10可知，连接反应已将PCR扩增后的16S rRNA基因连接到了T-载体上，并在感受态菌株E.coli DH5中得到了表达，形成白色菌落。图8 EcoR酶切示意图 图9 DNA Marker 图10 酶切后的质粒电泳图（部分）3.5 16S rRNA分析通过16S rRNA序列经校对后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度较高的菌株将结果记录如表6。Stackebrandt9等认为当细菌的

37、16S rRNA序列的相似性大于或等于97%时，则可以认为是同一个属，当序列相似性大于或等于98%时，可以认为是同一个种。从平板上分离得到的43株菌通过16S rRNA序列分析结果表明：有机白萝卜表皮附生乳酸菌主要分为Pediococcus、Leuconostoc和Weissella属（表6），其中，以LS5为代表的19株分离菌株属于Pediococcus属，它们的16S rRNA序列与P. pentosaceus DSM 20336T 的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS5为代表的19株菌被鉴定为P. pentosaceus，占所有菌株的44%；以LS2为代表的7株菌属于Leuc

38、onostoc属，它们的16S rRNA序列与L. mesenteroides ATCC 8293T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS2为代表的7株菌被鉴定为L. mesenteroides，占所有菌株的16%；以LS15为代表的2株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA序列与L. pseudomesenteroides NRIC 1777T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS15为代表的2株菌被鉴定为L. pseudomesenteroides，占所有菌株的5%；以LS26为代表的7株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA序列与L.

39、citreum ATCC 49370T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS26为代表的7株菌被鉴定为L. citreum，占所有菌株的16%；以LS34为代表的6株菌属于Leuconostoc属，它们的16S rRNA序列与L. holzapfelii LMG 23990T的16S rRNA序列相似性为99%，因此以LS34为代表的6株菌被鉴定为L. holzapfelii，占所有菌株的14%；以LS17为代表的2株菌属于Weissella属，它们的16S rRNA序列与W. cibaria LMG 17699T的16S rRNA序列相似性为100%，因此以LS17为代表的2株菌倍

40、被鉴定为W. cibaria，占所有菌株的5%。表6 16S rRNA序列比对结果属簇 群相似菌株相似性菌株数量PediococcusLS5P. pentosaceus DSM 20336T99%19LeuconostocLS2L. mesenteroides ATCC 8293T99%7LS15L. pseudomesenteroides NRIC 1777T99%2LS26L. citreum ATCC 49370T99%7LS34L. holzapfelii LMG 23990T99%6WeissellaLS17W. cibaria LMG 17699T100%23.6 链霉素抗性分析结

41、果查询欧洲抗微生物药物敏感委员会 (http:/www.eucast.org)关于微生物对不同抗生素敏感阈值的数据库（http:/www.eucast.org/mic_distributions/）可知，P. pentosaceus、L. mesenteroides、L. pseudomesenteroides、L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria对链霉素的敏感阈值分别是64、64、64、64、64和8；在分离得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P. pentosaceus中，有5株菌表现出对链霉

42、素的抗药性； L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides对链霉素都表现为敏感；L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。表7 有机白萝卜表皮附生乳酸菌对链霉素的MIC与抗药性(g/mL)菌株STR阈值MICR或SP. pentosaceusLS16432SLS264SLS364SLS564SLS964SLS1432SLS20128RLS2164SLS22512RLS3064SLS3164SLS3332SLS3432SLS354SLS3632SLS38128RLS391024RLS424SLS4

43、3256RL. mesenteroidesLS46464SLS664SLS1332SLS1932SLS2316SLS3232SLS3732SL. pseudomesenteroidesLS156464SLS2532SL. citreumLS76432SLS8128RLS1132SLS1832SLS244SLS264SLS298SL. holzapfeliiLS106432SLS1616SLS1716SLS2832SLS4032SLS41128RW. cibariaLS128128RLS274S注：“R” 代表耐药，“S”代表敏感4 结论从有机白萝卜表皮分离得到的43株菌分别属于Pediococ

44、cus、Leuconostoc和Weissella属，其中，19株菌被鉴定为P. pentosaceus，占所有菌株的44%；7株菌被鉴定为L. mesenteroides，占所有菌株的16%；2株菌被鉴定为L. pseudomesenteroides，占所有菌株的5%；7株菌被鉴定为L. citreum，占所有菌株的16%；6株菌被鉴定为L. holzapfelii，占所有菌株的14%；2株菌被鉴定为W. cibaria，占所有菌株的5%。在分离得到的43株乳酸菌中，共有8菌株表现出了对链霉素的抗药性，占所有乳酸菌的18.6%；其中，在19株P. pentosaceus中，有5株菌表现出对链霉素的抗药性； L. mesenteroides和L. pseudomesenteroides对链霉素都表现为敏感；L. citreum、L. holzapfelii和W. cibaria分别有一株菌表现出对链霉素的抗药性。总