布病检测方法及质量控制ppt课件.pptx

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1、布病检测方法及质量控制一、布病诊断布病的诊断过程可分为初步诊断和实验室诊断。初步诊断 实验室诊断流行病学调查临床诊断病理诊断病原学血清学（一） 初步诊断 1 1 流行病学调查流行病学调查 （1）疫区内动物基本情况，免疫情况，免疫监测情况等。 （2）本次疫病的流行情况，包括最初发病时间，地点，疫情，是否在短时间内出现许多明显的流产症状。本地区过去曾否出现过布病，附近地区近期是否有布病发生，是否有其它地方引进动物或有其它地方人员来参观。 （3）本地相关动物管理制度，牲畜流动，检疫屠宰情况，气候、地理、交通情况等。 2 2 临床诊断临床诊断（1）最初阶段的临床症状不明显。（2）随着病程的发展，布病会

2、引起母畜流产、死胎、不孕和子宫内膜炎等。（3）雄性动物出现附睾炎和睾丸炎。 3 3 病理学诊断病理学诊断 （1）胎衣呈黄色胶东样浸润，有些部位覆有纤维蛋白絮片，有出血点。 （2）胎儿胃中有淡黄色或白色黏液絮状物，肠胃和膀胱的浆膜下可见有点状或线状出血。 （3）皮下呈出血性浆液性浸润。 （4）淋巴，脾脏和肝脏有不同程度肿胀。 （5）期待呈浆液性浸润，肥厚。可能有肺炎病灶。（二）实验室诊断 实验诊断主要是运用实验技术和方法，通过感官、试剂反应、仪器分析和动物实验等手段进行的诊断。布病的实验室诊断包括病原学，血清学诊断。 1 1 病原学诊断病原学诊断属种型布鲁氏菌与否？牛、羊、猪种布鲁氏菌？变 型

3、1, 2, 3（1 1）病原）病原分离分离鉴定鉴定 将病料中（组织或奶样）的病原进行分离培养，并对其属、种、型进行分析。从而判定该疑似病原是否属于布鲁氏菌属，属于布鲁氏菌属的那个种（流产，猪，羊等），属于该种布鲁氏菌的哪个变型。优点：优点： 诊断结果明确，是布病诊断的“金标准”。 能对流行菌株进行分型，流行病学价值高。缺点：缺点： 费时 检测需要花费近一周的时间，不适用于大规模的检测。 费钱 需要高级别的生物安全实验室及生物安全管理体系，适当的培养基，这些都需要花费大量的财力。 不敏感，不易采样。（2）PCR 随着分子生物学的发展，PCR等技术得到广泛应用。我们实验室使用的主要是多重PCR技术

4、，来对布鲁氏菌的种型进行分析。其扩增的目的条带是细菌基因组中广泛分布的基因片段。通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。该方法特异性强，灵敏度高，简单快捷。引物如下引物如下: :反应反应条件如下条件如下： 95 7 min预变性；然后进行25个循环的扩增（95 35s，64 45s，72 3min），最后72延伸10 min，4保存。 结果判定：结果判定：电泳同时出现152bp、794bp和1682bp3条条带，为牛种布鲁氏菌；电泳同时出现152bp、794bp、1071bp和1682bp4条条带，为羊种布鲁氏菌；电泳同时出现152bp、794bp和1071bp3条条带，为绵羊附睾种布鲁氏菌

5、；电泳同时出现152bp、272bp、774bp、1071bp和1682bp5条条带，为猪种布鲁氏菌；电泳同时出现152bp、272bp、1071bp和1682bp4条条带，为犬种布鲁氏菌；电泳同时出现272bp、794bp、1071bp和1682bp4条条带，为沙林鼠种布鲁氏菌。 2 2 血清学血清学诊断诊断 RBT（虎红平板凝集实验） SAT（试管凝集实验） CFT（补体结合实验） ELISA（酶联联免疫吸附实验） FPA（荧光偏振实验）布鲁氏菌诱导机体抗体曲线图 2.1 RBT 简便快捷，敏感性较高。 能够检测所有光滑型布鲁氏菌的感染。 抑制IgM,检测IgG1。 等体积混合4分钟，观察

6、到凝集现 象。 会产生假阳性与假阴性。（1）技术要点：）技术要点：反应条件要控制在室温，3D摇晃4min后立即判读（大量样品操作时容易造成时间延误）。虎红抗原要4C冷藏，严禁冷冻保存。不能使用血浆样本（容易产生假阳性）。在实验过程中要加阴阳性对照。（2）RBT抗原质量控制抗原质量控制 如果想得到更为可靠、准确使检测结果，就要对检测的各个环节进行质量控制，使其标准化。 首先要对抗原进行质控。（3）RBT抗原质控的方法抗原质控的方法当新的一批抗原到来时，要对新的抗原进行质控。简述RBT抗原质控方法如下（以OIE标准血清为例）：抗原滴度（可检测性）：将OIE ISS 标准血清用生理盐水稀释为1：25

7、, 1：40, 1：45, 1：55 和1：100。RBT实验中当血清在1 :45稀释度时检测为阳性，1 :55为检测阴性则此项合格。如果超过了这个范围则检测度不合格。敏感性：取滴度略高于阴阳性临界值的阳性血清，并用待检抗原检测，当检测结果均为阳性时则此项合格特异性：对阴性血清（通过未感然布鲁氏菌动物的血液制备）进行检测，检测结果全为阴性则此项合格。纯度/无菌性 通过以上标准对抗原进行质控至关重要。因为如果没有良好质控的话，则实验中虎红抗原可能会过于敏感（产生许多假阳性），或敏感性不够（产生许多假阴性）。 当没有OIE标准血清时，需要使用国家标准血清对抗原进行质控。国家标准血清符合OIE的要求

8、，应由国家参考实验室提供。 2.2 SAT特异性抗体可与相应的布氏菌抗原发生特异性结合，在电解质的作用下，就会形成肉眼可见的凝集反应，通过这种检测来判断，该动物是否为患病动物。优点：优点：SAT主要检查血清中的IgG和IgM。特异较好，实用性、敏感性较强。缺点：缺点：有前带现象，有时出现假阴性结果。出结果慢，需要两天。实验要点：实验要点： 受检血清应新鲜、无溶血、无污染。 存放血清处温度不能超过10，采血后应于3-4日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。个别血清会出现前带现象，建议多做几个管，多采用几个稀释度。 2.3 iELISA 间接酶联免疫吸附试验（iELISA）是另一种对

9、布病抗体敏感性较高的实验。大概步骤如下，抗原包被在平板上，血清或奶样中的特异性抗体能够与抗原形成复合物。通过洗液洗涤去除未结合的抗体，当用酶标二抗孵育显色以后，可以通过index值来判断动物是否为阳性。（1）实验实验要点要点：要严格控制孵育时间和实验温度。洗涤步骤是最为关键的。要充分洗涤，拍干残留液体，不要让板子变干燥。奶样要-20C 冻存，在4C 保存抗体滴度会降低。 实验过程中，要加入阴阳性对照。（2）新进）新进iELISA试剂盒的质控：试剂盒的质控：对不同检测样品都要进行一次质控（血清，奶）包括以下几个方面：可检测性（OIE标准血清为例）：OIEELISAspISS 1 :16稀释为阳性

10、，1 :64稀释时为阴性。敏感性 同RBT特异性 同RBT可重复性（每种样品要经过多次重复（20次）并且在两块板子上进行检测，来观察产品的重复性是否良好）。2.4 CFT 补体结合实验（CFT），是利用绵羊红细胞与溶血素，补体组成溶血指示系统。当布鲁氏菌的特异性抗原、抗体复合物竞争结合指示系统中的补体时，溶血被抑制。因此可以通过抗溶血的程度来判断抗体滴度与阴阳性。补体结合实验主要检查IgG类抗体，特异性强，准确性高，敏感性差，但是操作比较复杂，可以作为确诊检测。 在过去的实验中主要通过凝集管进行检测，费时费力废材料。在接受ANSES培训以后，我们开始做微量CFT，用96孔板进行CFT实验，大大

11、地提高了检测效率。（1）CFT实验步骤比较实验步骤比较繁琐繁琐，要要注意以下的事项注意以下的事项：采血5天后方能使用（让红细胞静息）。每批溶血素需要测一次效价，每次实验前要测补体效价。使用与测定补体效价同一批的红细胞，溶血素来做主体实验。待检血清需灭活。加入对照（+，-,Ag, C, SRBCs）。（2）CFT抗原质控抗原质控质控方法与RBT抗原相似可检测性（OIE标准血清为例）：CFT抗抗原的质控标准为，OIE标准血清200倍稀释时产生50%的溶血抑制现象。敏感性 同RBT特异性 同RBT可重复性2.5 FPA 荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immu

12、noassay，FPA)是一种定量免疫分析技术 荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。 偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关（如图）。所以利用荧光素标记布鲁氏菌的抗原，当抗体与抗原形成复合物以后，转动速度变慢，荧光强度增强。阳性阳性 阴性阴性形成大的免疫复合物 未形成复合物，旋转速度变慢 旋转加快形成偏振光 不形成偏振光2.6 2.6 血清学血清学方法选择的原则方法选择的原则 一般来说检测方法的敏感性和特异性不可兼得，当敏感性提高时，特异性就会降低，当特异性提高时，敏感

13、性会降低。因此在血清学检测时，可以根据实际情况来选择检测方法。可以通过敏感性较高又具备一定特异性的方法对样品进行初筛，然后通过特异性较高的方法进行确诊。从上图中可以看出FPA、RBT、iELISA的敏感性较高，适合用作初筛实验。而CFT、cELISA、SAT的敏感性不是很高但是特异性较强所以适合用作确诊方法。综上我们推荐使用以下检测方法组合。初筛：选择RBT，因为它具有以下的特点：方便，便宜，敏感性强又兼具有一定的特异性。但是它对疫苗诱导抗体敏感。确诊：SAT（OIE不推荐），CFT（便宜，特异性强，对疫苗诱导产生的抗体不是很敏感）。 2.7 2.7 其它方面的实验室质量控制其它方面的实验室质

14、量控制（1 1）实验室资源的质控：）实验室资源的质控：人员：要求人员充足，通过能力认证并可追溯，业务熟练（经过内部或外部培训），分工明确。仪器：经过认证，校准，并且有定时检查维护。如冰箱，生物安全柜，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，移液器等。以移液器为例，需要按时对移液器进行校准。 精确度低 精确度高 精准度高 精准度低检测步骤：要有标准化的实验步骤，实验条件，并编辑成册。记录检测试剂信息：要及时记录各种检测试剂的信息（批号，生产日期等）。检测结果记录，验证：要在实验过程中对实验结果进行记录，需要第二个人对实验结果进行验证。表格：各种表格要完备，并要放在触手可及的地方。（3）实验室外部质控）实验室外部质控 环比实验：外部的质量体系对实验室进行的能力验证。 在环比实验中，实验室会收到15-20个盲样，这些盲样的滴度都已经被测定，并且都通过了稳定性与均一性实验。通过环比实验，可以评判各实验室在检测过程中所存在的问题，以便其不断改进。 中国动物卫生与流行病学中心，人兽共患病监测室在2015年11月29日进行了第一次环比实验，现结果正在汇总分析当中。20152015年环比实验样品制备年环比实验样品制备谢谢大家！谢谢大家！