黄酒发酵过程中高级醇的形成与控制毕业论文.doc

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1、摘 要高级醇是影响黄酒风味的重要物质之一，本文通过同源重组技术分别对支链氨基酸转氨酶的编码基因BAT1和BAT2，以及天冬氨酸-半醛脱氢酶的编码基因HOM2进行敲除，研究这些基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。主要研究内容及结果如下：（1）构建重组质粒pUC-BABK，PCR扩增重组质粒pUC-BABK上的重组盒BA-KanMX-BB并将其转化黄酒酵母单倍体，筛选获得BAT1基因敲除突变株。将BAT1基因敲除突变株与出发菌株进行黄酒发酵实验，发酵结果显示BAT1基因敲除突变株的高级醇生成量和基本发酵性能均未发生明显变化。（2）将重组盒BA-KanMX-BB转化BAT2基因敲除黄酒酵母单倍体突

2、变株，筛选获得BAT1、BAT2基因双敲除突变株。将BAT1、BAT2双敲除突变株及其单敲除突变株与出发菌株同时进行黄酒发酵实验，发酵结果显示：BAT1、BAT2双敲除突变株的生长繁殖受到了抑制，CO2总失重平均降低了2.8 g，酒精度平均下降了1.5度。同时，BAT1、BAT2双敲除突变株产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量较出发菌株分别平均降低了10.46%、52.16%、25.31%，较BAT1突变株分别平均降低了10.12%、51.82%、25.28%，较BAT2突变株分别平均降低了10.76%、24.71%、15.72%。（3）构建重组质粒pUC-HABK，PCR扩增重组质粒pUC-HABK

3、上的重组盒HA-KanMX-HB并将其转化黄酒酵母二倍体，筛选获得HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1。将突变株RY1-1与出发菌株RY1同时进行黄酒发酵实验，发酵结果显示：RY1-1产异戊醇的含量明显下降，比RY1降低了30.39%，并且其基本发酵性能无明显变化。RY1-1去除KanMX抗性基因后，得到的突变株RY1-2的高级醇生成量和基本发酵性能与RY1-1相比基本保持不变。（4）构建重组质粒pUC-HB1A1K，在突变株RY1-2的基础上再次敲除HOM2基因，获得HOM2基因两个等位基因敲除的突变株RY1-3。将突变株RY1-3与突变株RY1-2及出发菌株RY1同时进行黄酒发酵

4、实验，发酵结果显示：与RY1和RY1-2相比，RY1-3的CO2总失重平均降低了5.0 g，酒精度平均下降了3.5度。同时，RY1-3产正丙醇、异丁醇和异戊醇含量较RY1分别降低63.27%、46.80%和66.98%，较RY1-2分别降低63.75%、42.09%和53.52%。关键词：黄酒酵母；支链氨基酸转氨酶编码基因；天冬氨酸-半醛脱氢酶编码基因；同源重组；黄酒发酵；高级醇ABSTRACTIn this paper, higher alcohols as the main byproducts during yellow wine yeast fermentation were stud

5、ied. BAT1 and BAT2 genes encoding branched-chain amino acid transaminase, HOM2 gene encoding aspartic semi-aldehyde dehydrogenase were knocked out by the double homologous recombination, respectively. Then we studied the effect of gene deletion on the basic fermentation performances and higher alcoh

6、ols production.(1) Recombinant plasmid pUC-BABK were constructed. The disruption cassette BA-KanMX-BB from the recombinant plasmid pUC-BABK was transformed into yellow wine yeast haploid and the BAT1 deletion strains were successfully obtained. The yellow rice wine fermentation test of BAT1 deletion

7、 strains and parental strains showed that the higher alcohols production and the basic fermentation performances were not affected by the deletion of BAT1 gene.(2) The disruption cassette BA-KanMX-BB was transformed into BAT2 deletion strains and the BAT1 and BAT2 double deletion strains were succes

8、sfully obtained. The yellow rice wine fermentation test of BAT1 and BAT2 single and double deletions strains and parental strains showed that deletion of both BAT1 and BAT2 resulted in growth retardation and diminished higher alcohols production. The total loss of CO2 decreased by an average of 2.8

9、g, and ethanol production decreased by an average of 1.5 degrees. The content of propanol, isobutyl alcohol and isoamyl alcohol produced by BAT1 and BAT2 double deletion strains decreased by an average of 10.46%, 52.16% and 25.31% compared with parental strains, decreased 10.12%, 51.82 % and 25.28%

10、compared with BAT1 deletion strains, decreased 10.76%, 24.71%, 15.72% compared with BAT2 deletion strains.(3) Recombinant plasmid pUC-HABK were constructed. The disruption cassette HA-KanMX-HB from the recombinant plasmid pUC-HABK was transformed into yellow wine yeast diploid and obtained one allel

11、e HOM2 gene deletion strain RY1-1. The yellow rice wine fermentation test of mutant strain RY1-1 and parental strain RY1 showed that the content of isoamyl alcohol produced by RY1-1 decreased 30.39% compared with RY1, and the basic fermentation performance of RY1-1 did not change. The KanMX of RY1-1

12、 was deleted via Cre/Loxp system, then the mutant strain RY1-2 was obtained. The basic fermentation performances and the higher alcohols production of RY1-2 remained unchanged compared with RY1-1. (4) Recombinant plasmid pUC-HA1B1K were constructed. The disruption cassette HA1-KanMX-HB1 from the rec

13、ombinant plasmid pUC-HA1B1K was transformed into mutant strain RY1-2 and obtained two allele HOM2 gene deletion strain RY1-3. The yellow rice wine fermentation test of mutant strain RY1-3, RY1-2 and parental strain RY1 showed that the once again deletion of HOM2 resulted in severe growth retardation

14、 and diminished higher alcohols production greatly. The total loss of CO2 produced by RY1-3 decreased by an average of 5.0 g, and ethanol production decreased by an average of 3.5 degrees. The content of propanol, isobutyl alcohol and isoamyl alcohol produced by RY1-3 decreased 63.27%, 46.80% and 66

15、.98% compared with RY1, decreased 63.75%, 42.09% and 53.52% compared with RY1-2. Key words: Yellow wine yeast, branched-chain amino acid transaminase encoding genes (BAT1 and BAT2), aspartic semi-aldehyde dehydrogenase encoding gene (HOM2), homologous recombination, yellow rice wine fermentation, hi

16、gher alcohols目 录1 前 言11.1 黄酒概述11.2 黄酒风味物质概述11.2.1 高级醇对黄酒风味的影响21.2.2 酯类对黄酒风味的影响31.2.3 其他类物质对黄酒风味的影响31.3 黄酒发酵过程中高级醇的形成与控制31.3.1 高级醇的形成机理31.3.2 影响黄酒中高级醇含量的主要因素61.3.3 降低黄酒中高级醇含量的主要措施71.4 低产高级醇酵母菌株的研究进展81.4.1 诱变育种81.4.2 细胞融合育种91.4.3 基因工程育种91.5 本课题的立题依据及研究内容101.5.1本课题的立体依据101.5.2 本课题的主要研究内容112 材料与方法132.1

17、材料与仪器132.1.1 主要试剂132.1.2 主要实验仪器142.1.3 菌种与质粒152.1.4 主要培养基152.1.5 主要溶液162.2 分析方法172.2.1 CO2失重的测定172.2.2 酒精度的测定172.2.3 还原糖的测定172.2.4 挥发性风味物质含量的测定182.2.5 生长曲线的测定182.3 实验方法192.3.1 引物设计192.3.2 各目的基因片段的获得212.3.3 重组质粒的构建232.3.4 酵母转化252.3.5 G418抗性基因的去除262.3.6 黄酒发酵实验263 结果与讨论283.1 BAT1基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响283.1

18、.1 BAT1基因的验证283.1.2 重组质粒pUC-BABK的构建283.1.3 BAT1基因敲除突变株的获得及验证303.1.4 BAT1基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响323.1.5 小结与讨论333.2 BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响333.2.1 BAT1、BAT2基因双敲除突变株的获得及验证333.2.2 突变株与出发菌株生长性能的比较343.2.3 BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响353.2.4 小结与讨论363.3 HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响373.3.1 HOM2基因的验证373.3.2 重

19、组质粒pUC-HABK的构建383.3.3 HOM2基因一个等位基因敲除的突变株的获得及验证403.3.4 HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响413.3.5 遗传标记基因KanMX的去除423.3.6 小结与讨论443.4 HOM2基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响443.4.1 重组质粒pUC-HB1A1K的构建443.4.2 HOM2基因两个等位基因敲除的突变株的获得及验证473.4.3 突变株与出发菌株生长性能的比较483.4.4 HOM2基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响493.4.5 小结与讨论504 结 论515 展 望526 参考

20、文献537 攻读硕士学位期间发表论文情况588 致 谢59 1 前 言1.1 黄酒概述黄酒是我国的民族特产，至今已经有6、7千年的历史，与啤酒、葡萄酒并称为世界上三大最古老的酿造酒1。黄酒由于具有悠久的历史、丰富的营养、独特的风味、酒精度低等特点2，所以受到广大人民群众的喜爱。黄酒是以谷物为主要原料酿制成的粮食酒，它不同于白酒，黄酒是没有经过蒸馏的，酒精含量较低。黄酒是一种高营养性的饮料酒，所以又被誉为“液体蛋糕”。黄酒中富含的营养物质有氨基酸、糖、肽等，其中黄酒中的氨基酸不仅种类高达20种之多，而且其含量非常丰富，其中人体必需的8种氨基酸含量，居酿造酒之首。黄酒中还含有丰富的人体所必需的微量

21、元素、有机酸和各种维生素3-4。黄酒除了直接饮用外，还可以入药，也可以入馔来去腥增香。黄酒是传统的养生保健佳品，目前的初步研究已经表明，黄酒具有抗衰老、抗氧化、降胆固醇、降血压、参与机体的代谢活动和免疫调节等功效5-6。黄酒是一种集饮用与保健为一体的酿造酒，是我国重点发展和扶植的饮料酒之一。我国从实行改革开放的政策以来，黄酒行业的发展速度较快。近年来，由于国家政策的支持、黄酒企业积极引导人们消费，从而黄酒行业的发展势头良好，且行业的整体规模也稳步扩大。2006年至2010年，我国的黄酒产量由63.8万千升增加至134.1 万千升，合计增长110%，年平均复合增长率为20%。黄酒行业龙头骨干不断

22、做大做强，发展迅速。2012年全国黄酒行业实现主营业务收入134.32亿元，同比增长12.89%；利润总额为14.49亿元，同比增长7.33%；工业销售产值136.40亿元，同比增长18.42%。2013年1-8月，全国规模以上的黄酒企业销售额同比增加8%，利润增加19%左右，较其他酒种相对稳定。但是，目前仍存在着一些问题制约着黄酒行业的快速发展，如消费市场地域性限制没有突破导致市场拓展艰难、业内存在着无序竞争从而导致黄酒价值低估身价降低、传统观念影响从而导致创新能力不够以及过分强调传统的黄酒酿造技术从而导致黄酒生产效率难以提高等。随着人们生活水平和物质文化的日益提高，消费者对黄酒产品的品质要

23、求也在不断的提高和变化，包括黄酒的风味口感和营养价值等，特别是消费者随着对黄酒的认识越来越高，对形成其风味的微量成分也越来越重视。传统的黄酒产品介绍与宣传已经开始制约着消费群体的进一步快速扩大，同时也制约着地域性市场的进一步拓展。如何运用研究成果来不断改进黄酒的传统酿造工艺技术，如何利用现代科学技术向生产者和消费者客观科学的介绍黄酒的风味物质，以及进一步的改善黄酒的口感和风味，达到吸引更多的消费者等，已经成为黄酒行业发展中重点研究的当务之急。1.2 黄酒风味物质概述黄酒独特的生产工艺赋予了其丰满、醇和、柔顺、圆润、浓郁、悠长的感觉，也赋予了其醇、香、柔、爽的独特风味7。黄酒这种独特的风味特征，

24、是众多风味物质综合反应的集中体现。黄酒中的风味物质种类非常丰富，主要包括醇类、酸类、酯类、醛类及羰基化合物等，其中酸类是黄酒中的重要呈味物质，而醇类、酯类和醛类则是黄酒香气的骨架成分，这些风味物质之间具有风味累加、相杀作用或风味协同作用，从而形成了黄酒特有的复合香8-10。其中，高级醇和酯类是黄酒中最重要的两类风味物质，对促进黄酒酒体丰满、浓厚，并增加酒的协调性起着重要作用。1.2.1 高级醇对黄酒风味的影响高级醇通常又被称为杂醇油，是指具有三个碳原子以上的一元醇类物质的总称。黄酒中的高级醇主要有正丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、活性戊醇、 苯甲醇、-苯乙醇等11-12，其中含量

25、最高的是异戊醇和异丁醇，其次是正丙醇和苯乙醇13。高级醇是黄酒酿造过程中不可避免的重要副产物，是构成黄酒酒体的重要成分。高级醇的种类和含量对黄酒的口感、品质有很大的影响，黄酒中所含有的主要高级醇及其风味特征见表1-1。适宜的高级醇含量能给人以柔和、醇厚、圆润、丰满及协调的感觉。所以黄酒中的高级醇含量不宜过低或过高：若过低，酒味淡，酒体不丰满；若过高，不但造成酒体有不愉快的异杂味，还会有较强的致醉性，也就是人们俗称的“上头”14-17。另外，高级醇含量过高对人体有毒害作用，其毒性会随着分子量的增大而加剧。尤其是异戊醇含量过高时，由于造成人体神经系统充血，而使人产生恶心、呕吐、头疼等中毒症状。黄酒

26、中高级醇含量仅次于异戊醇的是异丁醇，异丁醇的毒性虽然比异戊醇的毒性小，但是异丁醇含量过多也会刺激人的眼、鼻。对人体粘膜有刺激性作用的正丙醇对人体生理作用则和乙醇相近。黄酒中高级醇含量过高对人体有毒害作用这一点已经引起了消费者和生产者的高度重视，而且目前的检测数据显示，在所有酿造酒中，黄酒中高级醇的含量是最高的18，因此采取安全有效的解决措施，达到控制黄酒中的高级醇含量在适宜的范围内，对提高黄酒的品质和地位、以及进一步扩展黄酒市场具有重要意义。表1-1 黄酒中主要高级醇及其显味特征Table 1-1 Main higher alcohols in yellow rice wine and the

27、ir characteristics of flavor 高级醇显味特征正丙醇刺激的酒精味，似醚臭，有苦味正丁醇较强的乙醇味和微弱的清香感异丁醇有微弱的戊醇味，有苦味感异戊醇杂醇油味，刺舌头，稍涩，有香蕉味苯乙醇似玫瑰香味，微带苦涩1.2.2 酯类对黄酒风味的影响酯类物质是黄酒中又一重要的风味物质，对黄酒的风味和品质起着关键性的作用，通常具有很强的水果味或花香味。黄酒中的酯类物质种类丰富，包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸异戊酯等，其中含量最高的是乳酸乙酯和乙酸乙酯，占酯类物质总量的85%以上19。中低沸点酯类的含量是随着发酵过程的进行而不断增加的，而高级酯类则增加

28、的非常少，高级酯大部分产生于黄酒陈酿过程中，其含量随着贮存时间而逐渐升高7,20。黄酒中常见的酯类及其所呈现的风味特征见表1-2，由表可知，黄酒中常见酯类对黄酒风味有着正面的作用，所以可以通过适当的提高这些有着积极作用的酯类的含量，来进一步改善黄酒的品质。 表1-2 黄酒中主要酯类及其显味特征Table 1-2 Main esters in yellow rice wine and their characteristics of flavor 酯类显味特征乙酸乙酯香蕉、苹果香，味辣带涩，味淡乳酸乙酯香气弱，味微苦，适量有浓厚感，多则带涩辛酸乙酯似梨香、菠萝香，苹果味带甜己酸乙酯似菠萝香，味甜

29、爽口，大曲酒香，有愉快气味乙酸异戊酯梨香，香蕉油香，苹果味琥珀酸二乙酯微弱并令人愉快的香气1.2.3 其他类物质对黄酒风味的影响黄酒中的酸是黄酒风味中重要的呈味物质，含酸量过低，味淡，酒体不协调；含酸量过高，会影响酒体的整体风味。黄酒中一些不愉快的味感部分来自于脂肪酸，所以黄酒中脂肪酸的含量以少一点为好。黄酒中的氨基酸含量丰富，赋予黄酒复杂的口感。黄酒中含糖量的多少也能够影响黄酒的品质，黄酒中含有一定量的糖能够赋予酒体醇厚感和愉快感，而含糖量过低的酒，其口感往往会比较粗糙。1.3 黄酒发酵过程中高级醇的形成与控制1.3.1 高级醇的形成机理研究表明，在酿酒过程的主发酵期间，酵母菌的生长繁殖伴随

30、着高级醇的生成，80%的高级醇是在这段时间逐渐形成的21，酵母生成高级醇的代谢途径有两个(图1-1)：一是分解代谢途径即Ehrlich途径，由氨基酸转氨途径生成-酮酸22-23，-酮酸经脱羧再脱氢生成高级醇；二是糖代谢途径即Harris途径，由葡萄糖经过EMP途径以及TCA循环生成-酮酸24-25,-酮酸经脱羧再脱氢生成高级醇。在正常发酵液中生成的高级醇总量，75%是由糖代谢产生的，另外25%来源于Ehrlich途径26-27。图1-1 高级醇合成途径Fig.1-1 Synthesis pathway of higher alcohols1.3.1.1 分解代谢途径（Ehrlich代谢机制）1

31、907年，德国化学家Ehrlich28最早提出了由氨基酸的分解代谢形成高级醇的途径。1911年，Neubauer29等人对Ehrlich代谢途径进行了进一步的补充，即推断a-酮酸是高级醇代谢过程中重要的中间代谢产物，a-酮酸经脱羧转化成醛，醛再进一步还原为相应的高级醇。随后，Lampitt30，Yamada31，Thorne32-33，Ingraham34等进一步研究证实氨基酸的分解代谢生成各种高级醇。Ehrlich代谢机制随着其后研究的不断完善，现在可归纳为：酿酒酵母在酒精发酵过程中，氨基酸通过转氨酶的转氨作用将氨基转移到-酮戊二酸上形成谷氨酸和-酮酸，-酮酸在脱羧酶催化作用下，经脱羧成醛，

32、醛再经醇脱氢酶作用下还原为相应的高级醇，反应过程如图1-2所示35-36。图1-2 Ehrlich代谢途径Fig.1-2 Ehrlich pathway根据此反应机制，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等都可以转化为相应的高级醇。各种氨基酸与相应的高级醇之间的关系见表1-3。表1-3 氨基酸代谢产物与其相应的高级醇Table 1-3 Amino acid metabolite and its corresponding higher alcohol氨基酸-酮酸高级醇亮氨酸-异己酸异戊醇异亮氨酸-酮基-甲基戊酸活性戊醇缬氨酸-酮基异戊酸异丁醇苏氨酸-酮基丁酸丙醇苯丙氨酸3-苯基-2-酮基丙酸苯丙醇1.3.

33、1.2 合成代谢途径（Harris途径）经过进一步研究得知，氨基酸分解代谢途径并不是高级醇生成的唯一途径，主要依据可以归纳为以下几点：（1）在合成培养基中进行酒精发酵时，培养基中加入的氨基酸种类与生成的高级醇种类不具有相关性；（2）高级醇的生成速率与乙醇的形成速率相平行，与培养基中氨基酸含量的高低无关；（3）酵母在含有单一氮源的培养基中发酵时，仍能形成各种高级醇；（4）高级醇中的某些组成（如正丁醇，其相应的氨基酸为缬氨酸）在自然界中并不存在。Harris于1953年提出了高级醇由糖代谢通过丙酮酸的合成途径37。Thouki于1958年提出由葡萄糖能直接形成高级醇38，即合成代谢途径：糖类提供合

34、成氨基酸的碳骨架，然后在合成代谢的最后阶段形成-酮酸中间体，-酮酸中间体经脱羧和还原形成相应的高级醇39。Webb40和Ingraham34,41-42于1963年，共同提出了异丁醇的糖代谢合成途径。此后的研究中，正丙醇、异戊醇和活性戊醇的合成代谢途径也陆续被提出并最终得到证明，总的反应途径如图1-3所示。图1-3 Harris途径Fig.1-3 Harris pathway1.3.2 影响黄酒中高级醇含量的主要因素影响黄酒中高级醇含量的因素有很多，如原辅料的成分及比例、发酵工艺的控制、酵母菌种及黄酒后处理工艺等，这些因素相互作用，共同决定黄酒中的高级醇含量43。1.3.2.1 黄酒酿造原辅料

35、黄酒发酵过程中，原料及微生物中蛋白质的分解是氨基酸的主要来源。原辅料中含有丰富的蛋白质，主要包括酿造用米和制曲用小麦等，这些物质为黄酒酿造提供了大量的蛋白质。黄酒酿造过程中的微生物数量多且种类广，除了酵母菌，还包括细菌、霉菌等，这些微生物死亡后自溶于发酵醪液中，也会提供丰富的蛋白质44。 在整个黄酒酿造过程中，氨基酸的含量是一个动态过程，其原因主要为以下两个方面：一是酵母菌等微生物的生长繁殖需要消耗氨基酸，二是在蛋白酶的作用下蛋白质可以不断水解为氨基酸。由于发酵醪中存在过量的氨基酸时会通过分解代谢途径转化为高级醇，因此控制发酵醪中初始物的浓度可以有利于降低高级醇的生成量38。1.3.2.2 碳

36、氮比这里的氮源主要是指氨基酸态氮，在黄酒酿造过程中，当醪液中氨基酸含量较低时，不能满足酵母菌的生长繁殖需要，酵母菌就会通过Harris途径合成其所需要的氨基酸，这样就会形成较多的-酮酸，并经过脱羧和还原形成高级醇；当醪液中氨基酸含量较高时，酵母的生长繁殖增加，从而也会导致生成的高级醇含量增加，而且某些特定的的氨基酸也可以通过Ehrlich代谢途径转化形成相应的高级醇45。因此发酵醪中的碳氮比控制在能满足酵母菌的需要的范围内，这样能够防止生成过多的高级醇。1.3.2.3 酵母菌种同化氨基酸的能力酵母菌吸收氨基酸的主要方式是主动运输，如果酵母分泌的运输酶不同，那其同化的氨基酸也就不同46。酵母菌在

37、黄酒发酵过程中，能快速同化的氨基酸只有8种，但是酵母菌生长繁殖过程中需要的不仅仅是这8中氨基酸，所以酵母菌只能依靠自身合成那些不能被自身同化的氨基酸。酵母菌要合成那些不能被自身同化的氨基酸时，由糖代谢途径提供所需要的酮酸，而-氨基氮来自于能被酵母快速同化的8种氨基酸（经转氨酶脱下）。黄酒发酵起始时，酵母菌合成的酮酸量能正好满足合成氨基酸的需要，所以发酵醪中没有过量的酮酸，但是随着发酵进行，由于酵母菌会放慢或者停止合成氨基酸，所以发酵醪液中就会产生过量的酮酸，而酵母菌无法承受过量酮酸的积累，所以就会通过合成代谢途径将过量的酮酸转化为高级醇。 因此黄酒中高级醇的含量及种类也与酵母菌同化不同氨基酸的

38、能力有关。1.3.2.4 酵母菌的接种量及增殖倍数黄酒发酵醪液中，酵母细胞的数量与发酵力的大小相对应，酵母细胞接种后经过生长繁殖，其数量会达到一定的范围内，以满足发酵力的需要。由于高级醇是酵母生长繁殖过程中合成自身细胞蛋白时的副产物，所以高级醇的生成是不可避免的，但是高级醇的生成量又是可以控制的，从理论上说，高级醇的生成量会随着酵母细胞增殖倍数的增加而增加，所以合理适当的加大酵母菌的接种量可以减少其增殖倍数，由此也相应的减少了高级醇的生成量47。1.3.2.5 发酵温度在黄酒发酵过程中，发酵温度是酵母菌参与生化反应的非常重要的外界因素。一般情况下，如果改变发酵温度，那么黄酒中高级醇的种类及数量

39、也会发生改变，从而影响到各种高级醇之间的平衡48。若发酵温度过高，那么酵母菌对氨基酸的脱氨基作用就会加速，同时还会加速酵母菌自溶产生大量氨基酸，由于发酵温度过高造成的这两种反应都会增加高级醇的生成量。所以通过降低发酵末期的温度，抑制酵母菌的活动能力，可以降低高级醇生成量。1.3.2.6 溶氧酵母菌属于兼性厌氧微生物，在有氧条件和无氧条件下均可以生长。但是酵母菌在有氧条件和无氧条件下的生理代谢活动是不同的，酵母菌在高含氧量条件下比在低含氧量条件下的生长代谢旺盛。酵母菌在溶氧高的发酵条件下形成的高级醇含量明显增加，这一点在葡萄酒和啤酒的酿造工艺中都有所证实49。1.3.2.7 其他等因素周天银等5

40、0研究发现，糖化酶的添加量会影响高级醇的生成，并且这一点已经在生产中得到了实践。当发酵醪中糖化能力不能满足酵母所需时，为加快其糖化速度可以加入一定量的糖化酶，使发酵醪中糖化力与酵母的发酵力达到平衡，这样就加快了酵母的发酵速度。发酵过程中，在保证酵母细胞量充足的情况下，减少其增殖倍数，这样酵母细胞不但能迅速消耗糖分，而且能大大减弱对氨基酸的分解作用，这样就能大大降低高级醇的生成量。武庆尉等51研究发现，酸性蛋白酶的添加量也能改变高级醇的生成量，适当地增加酸性蛋白酶的使用量时，高级醇的生成量最多可降低24.71%，但是酸性蛋白酶的添加量过多时又会使高级醇的含量增加。在黄酒发酵过程中，发酵醪中酵母细

41、胞的总数控制在一定范围内，使其发酵力、糖化力及蛋白分解力三者达到平衡协调时，则能够更有效的降低高级醇的含量。 除了以上因素，很多文献中也表明离子水平、pH值等因素也会对发酵醪中微生物的代谢产生一定的影响，从而进一步地影响高级醇的生成量。 1.3.3 降低黄酒中高级醇含量的主要措施1.3.3.1 选育低产高级醇黄酒酵母菌株即使在相同的酿造工艺条件下，不同的黄酒酵母菌株由于其生理代谢活动的不同，所以其发酵过程中生成高级醇的含量也会存在极大的差异。根据生成高级醇的两条代谢途径，选育高级醇代谢过程中某些关键性酶活性降低或失活的菌株，从而可以阻断或减弱生成高级醇的代谢途径，以达到显著降低黄酒中高级醇含量

42、的目的47。1.3.3.2 优化黄酒发酵工艺选用蛋白质含量低的黄酒生产用原料，并提高原料的精白度，以去除部分原料表皮中所含有的蛋白质。以较低温度浸渍较长时间，以使原料中的部分蛋白质因分解而被除去。选择适宜的制曲工艺，经选育得到优良的曲霉菌种，以控制其产酶数量。严格控制黄酒发酵温度，使其不能超过工艺要求，并降低发酵末期的温度。适当增加酵母接种量并严格控制发酵醪中的溶氧。1.3.3.3 黄酒后处理工艺控制高级醇含量根据高级醇的理化性质，可以通过以下方法降低半成品黄酒中的高级醇含量。（1）黄酒中高级醇分子的直径一般比酒中其他主要成分分子的直径大，根据这一特点，可以利用滤膜装置来截留分子直径较大的高级

43、醇分子52。同时也可以利用大孔型吸附树脂达到定向吸附酒中高级醇分子的目的53，从而降低黄酒中的高级醇含量。（2）通过通风处理、热处理等一些理化手段54，能够加速酒体中高级醇成酯成酸的生化反应，从而不但降低了酒体中高级醇的含量，而且形成了能够提高黄酒品质的风味物质。 1.4 低产高级醇酵母菌株的研究进展在酵母发酵过程中，可以通过优化酿酒工艺来控制高级醇的生成，而基于代谢控制理论，通过影响或者改变酵母菌株的代谢途径，从根本上降低高级醇的生成，不但可以降低生产成本，还能提高黄酒的品质。根据酵母菌生成高级醇的两条代谢途径，人们对高级醇的形成及其代谢调控做了更进一步的研究，并且由此产生了一些能够降低发酵

44、过程中高级醇生成量的思路和方法。1.4.1 诱变育种诱变育种是一种有效而且容易操作的育种方法，常用于选育低产高级醇酵母菌株。有多种方法可以对酿酒酵母进行诱变处理，其中普遍采用的物理诱变方法为紫外线诱变，化学诱变方法有亚硝酸诱变、亚硝基胍诱变等。在Ehrlich代谢途径中，氨基酸分解生成相应的高级醇的反应过程，是由酵母细胞中的氨基酸转氨酶、酮酸脱羧酶、脱氢酶等酶的催化活性决定的。因此，根据代谢控制原理，选育分支链氨基酸营养缺陷型菌株，由于其不能合成相应的氨基酸合成途径中的某些酶尤其是和高级醇的生成有关的酶，因而减少了-酮酸的积累，由于-酮酸是合成高级醇的前体物，所以达到了降低高级醇生成量的目的。

45、Rous55等人通过紫外诱变的方法选育出一株异亮氨酸营养缺陷型突变菌株，用该突变株进行葡萄酒发酵时生成的异戊醇的含量比出发菌株降低了50%，同时总高级醇的生成量降低了20%。王鹏银56等人利用N+离子注入技术诱变并筛选到了一株亮氨酸营养缺陷型酿酒酵母菌株A713，该突变株发酵产异戊醇含量降低了39.85%，且总高级醇含量降低了33.62%。赵树欣57等人利用离子注入与紫外诱变经二重诱变筛选得到的突变株，其生成的总高级醇含量降低了34.5%。Ingraham34等人选育出了亮氨酸营养缺陷型突变株，该突变株发酵产异戊醇的含量降低了95%，但由于该突变株需要在富含亮氨酸的培养基中生长，而且其发酵性能

46、也明显降低，所以限制了该菌在工业上的应用。诱变育种的方法虽然简单易操作，但其缺点也是显而易见的。首先，诱变育种得到的菌株大多数都是营养缺陷型菌株，在其发酵过程中要向发酵液中补加维生素、氨基酸等营养物质，所以不利于工业化生产。其次，进行诱变后需要大量处理供试菌株，而且诱变育种的方式由于诱发突变的盲目性大、难以掌握方向，所以筛选到的目的菌株很少，同时也很难将不同目的性状集中到同一株菌，另外，筛选得到的目的菌株也容易发生回复突变。1.4.2 细胞融合育种细胞融合又称为原生质体融合，该技术也常用于选育酵母菌种。Nobuhiko58等人将赖氨酸营养缺陷型菌株K-14和呼吸缺陷型菌株NCYC1333进行细

47、胞融合，从而得到了耐酒精力高、絮凝性较低、高级醇生成量适中的优良菌株F-32。王芬59等将发酵度高、产乙醛量低，但产高级醇含量高的菌株NW7-45与发酵度不高但产高级醇量少的菌株JW1-1进行融合反应，选育出了发酵度高且产高级醇量低的优良菌株DR9-2。细胞融合育种存在过程比较繁琐且得到的目的菌株后代会出现性状分离等缺点，因而限制了该技术在工业育种方面的应用。1.4.3 基因工程育种基因工程育种指的是利用分子生物学手段在分子水平上按照人们的意愿对菌株进行有目的的改造，从而提高有利发酵产物的生成量或者降低不利发酵产物的生成量。与传统育种方法相比，基因工程育种具有针对性强、遗传性能稳定、周期性短等优点，并克服了远源杂交不亲和性，所以说基因工程育种是一种非常优越的育种方法。结合酵母中高级醇生成的两条代谢途径，许多科学家对降低酿酒酵母生成高级醇的含量，尤其是降低其生成异丁醇和异戊醇的含量进行了大量且深入的研究。1.4.3.1 支链氨基酸转氨酶对高级醇生成量的影响Coln60，Kispal61和Eden21等人对酵母中支链氨基酸分解生成高级醇的代谢途径进行了大量深入的研究，他们的研究成果表明，该途径的第一步反应为支链氨基酸的转氨作用，该反应是由支链氨基酸转氨酶控制的，支链氨基酸转氨