DNA提取各种缓冲液的配制.doc

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1、植物总DNA的提取一、所需仪器设备及消耗品剪刀、塑料袋（封口）、冰箱、棕色广口瓶（1000、500、200、100、50ml）、量筒（1000、500、100、10ml）、烧杯（1000、500、200、100ml）、pH试纸、电子天平、高压灭菌锅、研钵、液氮罐（液氮）、水浴锅、离心机、移液器（1套）、枪头（1ml、200ml、20l）、枪头盒、离心管（1.5ml）（包括盒和架）、一次性手套、电泳仪、电泳槽、塑料胶带（宽）、微波炉、凝胶成像系统、垃圾桶、冰盒（自制）、记号笔、单面刀片二、所需化学药品及试剂CTAB、NaCl、EDTA-Na22H2O、Tris、冰乙酸、硼酸、-巯基乙醇、NaAc

2、、氯仿（三氯甲烷）、异戊醇、无水乙醇、溴酚蓝、琼脂糖、蔗糖、溴化乙锭（EB）、RNase、NaOH、HCl（浓）、ddH2O三、各种缓冲液的配制（一）2%CTAB提取缓冲液（300ml）（高压灭菌）4mol/L的NaCl 35ml3=105ml1mol/L的Tris-HCl 10ml3=30ml0.5mol/L的EDTA 4ml3=12mlCTAB 2g3=6g（二）1TE（母液pH8.0）（50ml）（高压灭菌）1mol/L的Tris-HCl（pH8.0） 500l0.5mol/L的EDTA（pH8.0） 100l最后加ddH2O定容到 50ml工作液为0.1TE（45ml灭菌的ddH2O中

3、，加入5ml已灭菌的1TE）（三）4mol/L的NaCl（150ml）（高压灭菌） 35.055g的NaCl，加ddH2O120ml溶解，再加水定容到150ml（四）1mol/L的NaCl（400l）（用于配制RNase储存液） 取4mol/L的NaCl（已灭菌）100l，加300l灭菌的ddH2O。（五）3mol/L的NaAc溶液（pH5.2）（50ml）（高压灭菌）NaAc3H2O 20.405g加ddH2O 30ml用冰乙酸调节pH至 5.2加ddH2O定容到 50ml（六）RNase储存液（10mg/ml）（1ml）1mol/L的Tris-HCl（pH7.5） 10l1mol/L的Na

4、Cl 15lRNase 10mg沸水浴1520min（七）EB储存液（1mg/ml）EB 30mgddH2O 30ml磁力搅拌至完全溶解，装入棕色瓶，铝箔包裹，保存于室温。制胶时EB终浓度为0.5g/ml（30ml加15l、40ml加20l）（八）10TBE缓冲液（电泳缓冲液）（高压灭菌）Tris碱 54g硼酸 27.5g0.5mol/L的EDTA（pH8.0） 20ml以上溶于400ml的ddH2O中，在定容到500ml工作液为1TBE或0.5TBE（九）6上样缓冲液（4保存）0.25%的溴酚蓝（2.5mg/1ml 40%（w/v）的蔗糖水溶液）40%（w/v）蔗糖水溶液（2g/5ml的dd

5、H2O，加热溶解，注：温度不能太高）（十）1mol/L的HCl溶液（不用灭菌） 8.62 ml的浓盐酸，加灭菌ddH2O 91.38ml，混匀，室温保存（100ml）。（十一）5mol/L的NaOH溶液（50ml，10g的NaOH溶于50ml灭菌的ddH2O中）（不用灭菌）200g的NaOH，溶于灭菌的ddH2O中，定容至1000ml（十二）1mol/L的Tris-HCl（pH8.0）（100ml）（高压灭菌） 12.11g的Tris碱 80ml的ddH2O加浓盐酸调节pH值至8.0（大约加4.2ml）（十三）0.5mol/L的EDTA（pH8.0）（50ml）（高压灭菌） 9.305g的ED

6、TA-Na22H2O1g的NaOH 磁力搅拌器剧烈搅拌40ml的ddH2O最后加水定容到50ml，用NaOH调节pH值至8.0DNA定量用紫外分光光度计法，1 OD26050g/ml双链DNA。PCR（聚合酶链反应）一、所需仪器设备及消耗品冰箱（4、20）、高压灭菌锅、离心机、移液器（1套）、枪头、枪头盒、PCR管（包括盒和架）、PCR仪、离心管（包括盒和架）、一次性手套、电泳仪、电泳槽、塑料胶带（宽）、微波炉、凝胶成像系统、垃圾桶、冰盒（自制）、记号笔、单面刀片二、所需化学药品及试剂质粒（阳性对照）、引物（1、2）、4dNTP、DNA模板、buffer（MgCl2）、TaqDNA聚合酶、dd

7、H2O、琼脂糖、DNA标准样品（DNA ladder）、溴化乙锭（EB）、5TBE电泳缓冲液（Tris、硼酸、EDTA）三、PCR反应体系与反应程序仅供参考成分母液浓度各成分加入量（l/20l）各成分终浓度或含量无离子水9.7缓冲液（buffer）1021MgCl225mmol/L1.21.5 mmol/L4dNTP2mmol/L20.2 mmol/L引物5pmol/L20.5pmol/LTaqDNA聚合酶5U/l0.63U模板DNA20ng/l2.550ng操作顺序： 水、4dNTP混合 buffer、taqDNA聚合酶混合，、混合 加入引物 混匀、分装PCR管 向每个PCR管加入模板DNA

8、PCR扩增反应程序：94预变性35min。进入循环：94变性30s56退火3045s72延伸12min，3036个循环。循环结束后再72延伸7min。外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗旱生理效果Induced Expression of DREB Transcriptional Factor and Study on Its Physiological Effects of Drought Tolerance in Transgenic Wheat成分母液浓度各成分加入量（l/25l）各成分终浓度或含量无离子水13？缓冲液（buffer）102.514dNTP2mm

9、ol/L20.2 mmol/L引物15？1mol/L？引物25？1mol/L？TaqDNA聚合酶5U/l0.2？1U模板DNA20ng/l1？50ngPCR扩增反应程序：94预变性5min。进入循环：94变性45s45退火45s72延伸1min，35个循环。循环结束后再72延伸10min。一般PCR反应中引物的终浓度为0.21.0mol/L，1.0mol/L时，特异性降低或形成引物二聚体，0.2mol/L时，降低产量。PCR反应中每种dNTP的终浓度为20200mol/L。所用引物浓度是5mol/L吗？PCR反应时，每个引物的终浓度是多少？4dNTP的终浓度是多少？TaqDNA聚合酶的终浓度是

10、多少？模板DNA的终浓度是多少？4 少少终 模少是的聚 ？是浓 度的引时吗 是物 浓 每反量产时 0体二形降性时 0./ . .浓物反 0后环环 延 火 性 环 变序应增 / 合 物 / 物/ / .0 子含浓终 量加浓成 效理抗达的中转基 因答 束环环0 0 性序序增 入 个 装引引混、合合聚 混混、序 . .合 / /引/ / / ./ 0 .子含浓浓 /量加浓成参程反系反 、 液电 、 （、 （准 、 、聚 （ 、（、照试及学刀单笔、制盒垃统成炉微宽料槽、电手次架括（离 ）架（ 、枪套器移、菌、0耗及设应链聚 /0 法光用.至值 0容 搅搅搅力 的 菌压） （ /. 加（.值节 0 .

11、菌压（0（） / 0 容 的， 的菌菌） 菌0于 的00（ / ） 保温混 酸的 菌灭（溶 高太度，溶加 /（溶蔗 液水蔗 0 （的存保液缓 . 0容在 ）. 菌压）液电冲 0 （ .为终温于，包，入装全 / 存 0 0 0存 0 定 . 酸 0 菌灭（ （ （液 / 灭 ）已 的 液储 于（0（ / 到水解溶 加 菌压（0 的灭入， .为 0 定 0 . 0 0 的菌压） （ 0 的 菌灭）0（缓取 配的种 ）（ （化糖、琼溴醇无戊烷甲氯 基硼乙 、试品化刀单号记自盒垃系成、微）胶、电套一架盒（ （心头枪、0、 、套器机、水氮罐氮钵灭高子纸 、0、 00、 、0、0（） 、 0（口、冰）（塑耗及器需提 需及）、0、（、 0、子氮水机 0头 架电胶微系自刀试 乙 烷戊溴（ （）种取（） （压的00 . 为 ，的 （ 解 /（ 储 液 灭 0 酸 0 0 0 装包终 电菌 .） 0 缓存 蔗液溶 加高溶灭 混） 0菌）菌 容 / （压 . / （菌的 力 容 .用 聚应及、器、 （手、微成制单刀、（ （ 聚、准 、 系成量/浓子0 / 引 . 聚、引 入增性 0 答基的理 量 浓 0 / /增变 延环 / 性二 量反 吗的 是聚是 4