PCR引物设计及相关软件使用ppt课件.ppt

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1、PCR引物设计及相关软件使用重庆大学生物工程学院重庆大学生物工程学院采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物主要内容l背景lPCR引物设计原则l常用PCR引物设计软件lPrimer Premier 5.0 介绍lOligo 6.22 介绍l在线Primer3 介绍采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的

2、体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物PCRl引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过

3、计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物引物设计的原则l引物与模板的序列要紧密互补l引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构l引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物影响因素l如引物长度（primer length），产物长度（produc

4、t length）l序列Tm 值(melting temperature)l引物与模板形成双链的稳定性(internal stability, 用G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物l在错配位点（false priming site）的引发效率l引物及产物的GC 含量（composition），等等。l必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。采用

5、PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一般原则n引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。n引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一般原则3.引

6、物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一般原则4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72左

7、右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一般原则6. G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 采用PP管及配件：根据给水设计图配

8、置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一般原则7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一般原则8. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口

9、面的圆度，保持熔接部位干净无污物常用的引物设计软件lOligo 6 （引物评价）*lPremier Primer （自动搜索）*lVector NTI SuitlDnasislOmigalDnastarlPrimer3 （在线服务）*采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物Primer Premier 5.0 的使用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪

10、边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物简并引物设计l根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）8、酵母线粒体（Yeast Mitoch

11、ondrion）采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物Primer Premier 5.0使用介绍(1)Preimer Premier 启动界面Load sequence采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物基本信息Sequence nameOriginal sequenceUse these two button to translate the DNA seq to a protein seq or

12、a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好Choose a function 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物引物搜

13、索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管

14、材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物引物编辑采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物引物编辑Edit primer hereAnalysis the edit resultAccept the edit result Return to the mai

15、n window采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物Some other useful function of PP5采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物Enzyme采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物Melting temperature graphPer 25-mer采用PP管及配件：根据给水设计图配

16、置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物GC% graphPer 25-mer采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物Stability Per 5-mer采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物pIRESneo2质粒克隆扩增质粒克隆扩增MYL2序列查询及序列查询及启动子功能分析启动子功能分析不加酶切位点引物设计基因组DNA制备高保真PCR Clon

17、ing大量纯化的MYL2 promoter片段酶切获得无promoter线性质粒载体片段DNALigation Reaction 转入DH5aColony ScreeningPCR Identification MYL2promoterpIRESneopEGFP-c3质粒克隆扩增质粒克隆扩增酶切获取MYL2promoterPlasmid vector开环分子酶切获得EGFP片段酶切及凝胶电泳鉴定及回收环状DNA分子DNALigation Reaction 环状DNA分子转入DH5aColony ScreeningPCR Identification rat原代胚胎心肌细胞培养及冻存MYL2pr

18、omoterpIRES/neo/EGFP心肌细胞心肌细胞脂质体荧光鉴定rat心肌细胞特异表达心肌细胞特异表达EGFP无绿色荧光蛋白表达达到目的达到目的两端不含酶切位点的两端不含酶切位点的MYL2/prmoter片段片段5端含酶切位点的引物端含酶切位点的引物PCR两端含酶切位点两端含酶切位点MYL2/prmoter片段片段TA克隆克隆Strategy of Construct采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物MYL2序列查询及分析序列查询及分析采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用

19、管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔

20、接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配

21、件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物Primer5.0软件安装及引物设计l网上下载软件l利用密码生成机破解软件并激活软件采用PP管及配件：根据给水设计图配置好PP管及配件，用管件在管材垂直角切断管材，边剪边旋转，以保证切口面的圆度，保持熔接部位干净无污物心肌特异性表达载体构建