蛋白质的结构和功能ppt课件.ppt

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1、第第1章章 蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能Chapter 1 Struction & function of Protein本章教学重点本章教学重点蛋白质元素组成特点，氨基酸结构通式，氨基酸分类、三字蛋白质元素组成特点，氨基酸结构通式，氨基酸分类、三字英文缩写符号；英文缩写符号； 肽、肽键的概念；肽、肽键的概念； 蛋白质一、二、三、四级蛋白质一、二、三、四级结构的概念及其稳定的主要化学键；二级结构主要形式及结结构的概念及其稳定的主要化学键；二级结构主要形式及结构特点；蛋白质结构与功能的关系；变构效应的概念；蛋白构特点；蛋白质结构与功能的关系；变构效应的概念；蛋白质两性电离，胶体性质，蛋白

2、质变性概念和意义，紫外吸收质两性电离，胶体性质，蛋白质变性概念和意义，紫外吸收和呈色反应；模体、结构域、分子伴侣的概念；盐析、电泳和呈色反应；模体、结构域、分子伴侣的概念；盐析、电泳和分子筛效应的原理。和分子筛效应的原理。 概概 述述1.1.什么是蛋白质什么是蛋白质? ?蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键通过肽键(peptide bond)相连形成的高分相连形成的高分子含氮化合物。子含氮化合物。2. 蛋白质的生物学重要性蛋白质的生物学重要性2-1. 蛋白质是生物体重要组成成分蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：分布广：所有器官、组织、细

3、胞的各个部分都含有所有器官、组织、细胞的各个部分都含有 蛋白质。蛋白质。 含量高：含量高：占人体干重的占人体干重的45；脾、肺及横纹肌等；脾、肺及横纹肌等 高达高达80。1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用）代谢调节作用3）免疫保护作用）免疫保护作用4）物质的转运和存储）物质的转运和存储5）运动与支持作用）运动与支持作用6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递2-2. 蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能2-3. 氧化供能氧化供能第第1 1节节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成Section 1 the Molecular Component of P

4、rotein 蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点 各种蛋白质的含氮量很接近且恒定，平均为各种蛋白质的含氮量很接近且恒定，平均为16。 通过测定生物样品中的含氮量，再根据以下公式推算蛋白通过测定生物样品中的含氮量，再根据以下公式推算蛋白质的大致含量：质的大致含量：主要有主要有C、H、O、N和和S。有些蛋白质含有少量磷或铁、。有些蛋白质含有少量磷或铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 ( g % )= 每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%1.

5、.氨基酸氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。氨基酸是组成蛋白质的基本单位。 组成人体蛋白质的氨基酸仅有组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且多属种，且多属 L-氨基酸氨基酸（仅甘氨酸除外）。（仅甘氨酸除外）。L-glyceraldehyde (an L-sugar)CHOHHOCH2OHCOOHHH2NCH2OHL-serine (an L- AA) 氨基酸的结构通式氨基酸的结构通式H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H1-1 氨基酸的分类氨基酸的分类1）非极性脂肪族氨基酸）非极性脂肪族氨基酸2）极性）极性中性中性氨基酸氨基酸3）芳香族氨基酸）芳香族氨基

6、酸4）酸性氨基酸）酸性氨基酸5）碱性氨基酸）碱性氨基酸* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:1-1-1 非极性脂肪族氨基酸非极性脂肪族氨基酸(侧链含烃链侧链含烃链)1-1-2 极性中性氨基酸极性中性氨基酸(侧链有极性但不带电荷侧链有极性但不带电荷)1-1-3 芳香族氨基酸芳香族氨基酸(侧链含芳香基团侧链含芳香基团)1-1-4 酸性氨基酸酸性氨基酸(侧链含负性解离基团侧链含负性解离基团)1-1-5 碱性氨基酸碱性氨基酸(侧链含正性解离基团侧链含正性解离基团)几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+

7、CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2半胱氨酸半胱氨酸(含巯基含巯基) -O O C-CH -CH2-SH+NH3-O O C-CH -CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3+胱氨酸胱氨酸 二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH31-2 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质1-2-1. 两性解离及等电点两性解离及等电点等电点等电点(isoelectr

8、ic point, pI) 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的时溶液的pH值值称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点。氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。的酸碱度。pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子C HN H2C O O HRC HN H2C O O HRCHNH3+COO-RCHNH3+COO-RCHNH

9、2COO-RCHNH2COO-RCHCOOHRNH3+CHCOOHRNH3+怎样确定氨基酸怎样确定氨基酸pI 酸碱滴定酸碱滴定根据酸碱基团根据酸碱基团pKa计算计算中性氨基酸中性氨基酸pI酸性氨基酸酸性氨基酸pI碱性氨基酸碱性氨基酸pI1-2-2. 紫外吸收紫外吸收 芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收Trp、Tyr(含共轭双键含共轭双键)最大最大吸收峰在吸收峰在 280 nm附近。附近。大多数蛋白质含有这两种氨大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质基酸残基，所以测定蛋白质溶液溶液280nm的光吸收值是分的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法

10、。简便的方法。1-2-3 茚三酮反应茚三酮反应 氨基酸与茚三酮水合物共热，大多可生成氨基酸与茚三酮水合物共热，大多可生成蓝紫色蓝紫色化合化合物，其最大吸收峰在物，其最大吸收峰在570nm处。由于此峰值与氨基酸处。由于此峰值与氨基酸的含量存在正比关系，可作为氨基酸定量分析方法。的含量存在正比关系，可作为氨基酸定量分析方法。(氧化脱羧脱氨)2. .肽肽2-1 肽肽(peptide)* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。* 肽键肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的是由一个氨基酸的 -羧基与另羧基与另一个氨基酸的一个氨基酸的 -氨基脱水缩合而形

11、成的化学键。氨基脱水缩合而形成的化学键。NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘 氨氨 酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键肽键N H2-C H -C -N -C H -COO HHHHON H2-C H -C -N -C H -COO HHHHO* 两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽，三分子氨基酸缩合则形，三分子氨基酸缩合则形成成三肽三肽* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为为氨基酸残基氨基酸残基(residue)。* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称

12、为由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽多肽(polypeptide)。N 末端：末端：多肽链中有多肽链中有自由氨基自由氨基的一端的一端C 末端：末端：多肽链中有多肽链中有自由羧基自由羧基的一端的一端多肽链有两端多肽链有两端* 多肽链多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。以肽键连接而成的一种结构。N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶2-2 几种重要的生物活性肽几种重要的生物活性肽2-2-1. 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathio

13、ne, GSH)GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+ NADP+ nGSH与与GSSG间的转换间的转换 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)2-2-2. 多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽第第2节节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构Section 2 the Molecular Structure of Protein蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括 一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结

14、构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)高级结构高级结构1. .蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构是指多肽链中氨基酸的排列顺序。蛋白质的一级结构是指多肽链中氨基酸的排列顺序。 稳定蛋白质一级结构的主要化学键是肽键，有些蛋白稳定蛋白质一级结构的主要化学键是肽键，有些蛋白质还包括二硫键。质还包括二硫键。 蛋白质一级结构是空间结构和功能的基础，但不是唯蛋白质一级结构是空间结构和功能的基础，但不是唯一的因素。一的因素。2. .蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构是指多肽链中某个肽段的主链蛋白质的二级结构

15、是指多肽链中某个肽段的主链骨架原子的相对空间位置。骨架原子的相对空间位置。 主链骨架原子包括主链骨架原子包括N(H)，C(O)和相邻的和相邻的2个个C 。 稳定蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。稳定蛋白质二级结构的主要化学键是氢键。2-1 肽单元或肽单位肽单元或肽单位(peptide unit)5747参与肽键的参与肽键的6个原子个原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一平面，位于同一平面，C 1和和C 2在平面上所处的位置为反式在平面上所处的位置为反式(trans)构构型，此同一平面上的型，此同一平面上的6个原子构成了个原子构成了所谓的所谓的肽单元肽单元 。2-2 二级结构的主要形式二级结

16、构的主要形式 -螺旋螺旋 ( -helix ) -折叠折叠 ( -pleated sheet ) -转角转角 ( -turn ) 无规卷曲无规卷曲 ( random coil ) 2-2-1 -螺旋螺旋肽段肽段主链主链围绕中心轴做有规律的围绕中心轴做有规律的螺旋式上升螺旋式上升,螺旋走向为顺时针螺旋走向为顺时针(右手螺旋右手螺旋).肽单位肽单位(肽平面肽平面)围绕围绕N- C 键旋转键旋转57(Phi角角) 或绕或绕C-C键旋转键旋转47(Psi角角).氨基酸氨基酸侧侧链伸向螺旋外侧链伸向螺旋外侧.每每3.6个氨基酸个氨基酸残基上升一圈残基上升一圈(360),螺距为螺距为0.54nm.每个肽键

17、的每个肽键的N-H和第四个和第四个肽键的肽键的C=O形成与形成与长轴平行长轴平行的的氢氢键键.2 C 间距间距0.15nm。影响影响 -螺旋形成的因素螺旋形成的因素氨基酸结构刚性氨基酸结构刚性(Pro)氨基酸形成离子键或静电斥力氨基酸形成离子键或静电斥力 (Glu/Asp/His/Lys/Arg)氨基酸侧链大小氨基酸侧链大小(Val/Ile)2-2-2 -折叠折叠 伸展伸展(2 C 间的距离达间的距离达0.35 nm ) 瘦长瘦长/弯曲弯曲/桶状，两链同向或反向桶状，两链同向或反向 在不同链或同一条链不同片段形成氢键在不同链或同一条链不同片段形成氢键 侧链突出在折叠的上方或下方侧链突出在折叠的

18、上方或下方 强度大强度大,有刚性有刚性2-2-3 -转角和无规卷曲转角和无规卷曲 -转角转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。 常由常由4个个AA残基组成残基组成 1st AA-C=O与与4thAA-N-H形成形成氢键氢键 2nd AA是是Pro或或Gly/Asp/Asn/Trp 形似发夹形似发夹 反向反向常见于反向平行末端常见于反向平行末端2-3 超二级结构超二级结构(模体模体/模序，模序，motif)二级结构组合形式如：二级结构组合形式如： ， ， 。在许多蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构在许多蛋白质分子中，二个或三个具

19、有二级结构的肽段，在空间上相互接近所形成的有规则的二的肽段，在空间上相互接近所形成的有规则的二级结构组合，被称为级结构组合，被称为模体模体(motif)。模体是赋予功。模体是赋予功能含义的超二级结构。能含义的超二级结构。 钙结合蛋白中结合钙结合蛋白中结合钙离子的模体钙离子的模体锌指结构锌指结构2-4 侧链对二级结构形成的影响侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成其氨基酸残基的侧链适合形成 - -螺旋或螺旋或-折叠，折叠，它就会出现相应的二级结构。它就会出现相应的二级结构。the conforma

20、tional preferences of the 20 AAs for the -helix Glu、Met、Ala、LeuLys、Phe、Gln、Trp、Ile、ValAsp、HisCys、Ser、Thr、ArgAsn、TyrGly、ProStrongWeakWeak(usually found in the beta-reverse turn)3.蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布。所有原子在三维空间的排布。 在二级结构基础上进一步折叠形成在二级结构基础上进一步折叠形成

21、 天然结构天然结构/功能结构功能结构 稳定因素：疏水键、离子键、氢键和稳定因素：疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。力等。 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb)三级结构三级结构 N 端端 C端端3-1 结构域结构域(domain) 较大的蛋白质分子中较大的蛋白质分子中折叠形成的折叠形成的 结构较为紧密的结构较为紧密的具具独特空间构象的独特空间构象的并并各行其功能的各行其功能的局部区域称之局部区域称之纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 3-2 分子伴侣分子伴侣(chaperon)* 热休克蛋白热休克蛋白70(Hsp70) * 伴侣蛋白伴侣蛋白(chaperonin) (如如Hsp

22、60/GroEL、GroES)* 核质蛋白核质蛋白(nucleoplasmin) 是为加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构提供是为加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构提供合适微环境的一类蛋白质。合适微环境的一类蛋白质。* 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。 * 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。导其正确折叠。 * 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫

23、键的正确形成起了分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。重要的作用。 4.蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为相互作用，称为蛋白质的四级结构。蛋白质的四级结构。 含有二条或多条多肽链的蛋白质分子中，每条具有完整三含有二条或多条多肽链的蛋白质分子中，每条具有完整三级结构的多肽链称为蛋白质的级结构的多肽链称为蛋白质的亚基亚基 (subunit)。 亚基间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。亚基间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。 由由2个亚基组成的

24、蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为称之为同二聚体同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则，若亚基分子结构不同，则称之为称之为异二聚体异二聚体(heterodimer)。血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构5.蛋白质组学蛋白质组学 蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，蛋白质组是指一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质，即即“一种基因组所表达的全套蛋白质一种基因组所表达的全套蛋白质”。 蛋白质组学蛋白质组学是研究细胞或机体全部蛋白质的表达及其活动是研究细胞或机体全部蛋白质的表达及其活动方式方式( (包括翻译后修饰

25、、转运定位、结构变化、蛋白质间相包括翻译后修饰、转运定位、结构变化、蛋白质间相互作用等互作用等) )，揭示蛋白质功能与生命活动规律的一个新的研，揭示蛋白质功能与生命活动规律的一个新的研究领域。究领域。 蛋白质组学蛋白质组学是高通量，高效率的研究，其研究技术平台：是高通量，高效率的研究，其研究技术平台： 双向电泳分离样品蛋白质双向电泳分离样品蛋白质 蛋白质点的定位、切取蛋白质点的定位、切取 蛋白质点的质谱分析蛋白质点的质谱分析 蛋白质组学蛋白质组学研究的科学意义研究的科学意义 阐明生命在生理或病理状态下的变化规律阐明生命在生理或病理状态下的变化规律 疾病诊断、新药筛选、农业、环保等疾病诊断、新药

26、筛选、农业、环保等第第3节节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系Section 3 The Relation of Structure & Function of Protein1.蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系1-1 一级结构是空间结构的基础一级结构是空间结构的基础牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶1-2 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构和功能一级结构相似的蛋

27、白质具有相似的高级结构和功能胰岛素胰岛素氨基酸残基序号氨基酸残基序号A5A6A10B30人人ThrSerIleThr猪猪ThrSerIleAla狗狗ThrSerIleAla兔兔ThrGlyIleSer牛牛AlaGlyValAla羊羊AlaSerValAla马马ThrSerIleAla1-3 一级结构提供重要的生物进化信息一级结构提供重要的生物进化信息细胞色素细胞色素(cytochrome C)的进化树的进化树表：细胞色素表：细胞色素C的种属差异量（以人的种属差异量（以人Cyt C为参照）为参照）生物名称生物名称黑猩猩黑猩猩恒河猴恒河猴兔兔袋鼠袋鼠鲸鲸牛牛猪猪羊羊狗狗骡骡马马残基差异数残基差异数

28、0191010 10101112生物名称生物名称鸡、火鸡鸡、火鸡响尾蛇响尾蛇乌龟乌龟狗、鱼狗、鱼蛾蛾小麦小麦面包霉面包霉酵母酵母残基差异数残基差异数1314153131354345同一种蛋白质一级结构差异愈小，物种间进化愈接近同一种蛋白质一级结构差异愈小，物种间进化愈接近1-4 一级结构改变可引起疾病一级结构改变可引起疾病 例如：例如：镰刀形红细胞贫血镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽链肽链N-val his leu thr pro val glu C(146)由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为由蛋白质分子发生

29、变异所导致的疾病，称为“分子病分子病”。2.蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系2-1 Hb亚基亚基与与Mb空间结构相似，都具有运输氧气的功能空间结构相似，都具有运输氧气的功能MbHbHbHbA2-2 Hb亚基构象变化可影响亚基与氧结合亚基构象变化可影响亚基与氧结合Hb与与O2结合后称为结合后称为氧合氧合Hb。氧合。氧合Hb占总占总Hb的百分数的百分数（称（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。O2 saturationpO2(mmHg)P50P50Hb 和Mb的氧结合/解离曲线S型型矩型矩型变构效应变构效应(allosteric effect)又称

30、别构效应。是指寡聚体蛋白质与其配体结又称别构效应。是指寡聚体蛋白质与其配体结合后，引起该蛋白质分子的构象变化，而导致合后，引起该蛋白质分子的构象变化，而导致其活性改变的现象。其活性改变的现象。* 协同效应协同效应(cooperativity) 寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中其他亚基与配体结合能力的现象，称之。此寡聚体中其他亚基与配体结合能力的现象，称之。 如果是促进作用则称为正协同效应如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应如果是抑制作用则称为负协同效应 (

31、negative cooperativity)Deoxy-HbOxy-Hb O2血红素与氧结合血红素与氧结合后，铁原子半径后，铁原子半径变小，就能进入变小，就能进入卟啉环的小孔中，卟啉环的小孔中，继而引起肽链位继而引起肽链位置的变动。置的变动。2-3 蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象改变与疾病 若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。时可导致疾病发生。这类疾病如这类疾病如：人纹状体脊髓变：人纹状体脊髓变性病、性病、脑退行性疾病脑退行性疾病、亨停

32、顿舞蹈病、疯牛病等。、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。 有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第第4节节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质Section 4 The Physical & Chemical Characters of Protein1. .蛋白质的两性解离蛋白质的两性解离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸蛋白质分子除两

33、端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下可解条件下可解离成带负电荷或正电荷的基团。离成带负电荷或正电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 。2. .蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至数万至数百万百万

34、kD，其分子的直径可达，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范，为胶粒范围之内。围之内。 稳定蛋白质胶体的因素：颗粒表面电荷、水化膜。稳定蛋白质胶体的因素：颗粒表面电荷、水化膜。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉3. .蛋白质的变性、凝固和沉淀蛋白质的变性、凝固和沉淀 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturat

35、ion)是在某些物理和化学因是在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。质改变和生物活性的丧失。 变性蛋白质的特征：变性蛋白质的特征：（二硫键、非共价键破坏，溶解度降低，（二硫键、非共价键破坏，溶解度降低， 黏度黏度 增加增加，不易结晶，易沉淀，易被，不易结晶，易沉淀，易被 蛋白酶水解，蛋白酶水解， 生物学活性丧失）生物学活性丧失） 造成变性的因素造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属如加热、乙醇等有机

36、溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等离子及生物碱试剂等 。 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。级结构。 应用举例应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。（如疫苗等）的必要条件。 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性

37、复性(renaturation) 。天然状态，有催化活性天然状态，有催化活性非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇* 蛋白质沉淀蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融合在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融合相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。并不变性。 * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，

38、蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 4. .蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。5. .蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发

39、生茚三酮反应。 双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共 热，呈现紫色或红色，此反应称为热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应双缩脲反应，双，双 缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。CONH2NH2CONH2NH2加热CONH2NHCONH2+ NH3Peptides and proteins (long-chain polypeptides) react with Cu2+ in alkalinity to create a blueviolet/red

40、color. The peptide must have at least 2 peptide bonds. So, amino acids第第5节节 蛋白质的分离纯化与结构分析蛋白质的分离纯化与结构分析Section 5 Separation, Purification & Analysis of Protein（自学）1. .透析及超滤透析及超滤* 透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。* 超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的

41、超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。2.丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀时，必须在使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮低温下进行，丙酮用量一般用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。淀。 *盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导

42、致蛋白质沉淀。化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 * 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 3.电泳电泳 蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术场

43、中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳称为电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。等。 几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。4.层析层析 层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分

44、离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。进行分离。* 凝胶过滤凝胶过滤(gel filt

45、ration)又称分子筛层析，利用各蛋又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。白质分子大小不同分离。5.超速离心超速离心 * 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 * 蛋 白 质 在 离 心 场 中 的 行 为 用蛋 白 质 在 离 心 场 中 的 行 为 用 沉 降 系 数沉 降 系 数(sedimentation coefficient, S)表示表示,沉降系数与蛋沉降系数与蛋白质的密度和形状相关白质的密度和形状相关 。因为沉降系数因为沉降系数S大体上

46、和分子量成正比关系，大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。6.氨基酸序列分析氨基酸序列分析 * 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 * 蛋 白 质 在 离 心 场 中 的 行 为 用蛋 白 质 在 离 心 场 中 的 行 为 用 沉 降 系 数沉 降 系 数(sedimentation coeffi

47、cient, S)表示表示,沉降系数与蛋沉降系数与蛋白质的密度和形状相关白质的密度和形状相关 。分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸

48、顺序的结果。序的结果。通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列7.蛋白质空间结构测定蛋白质空间结构测定 * 二级结构测定二级结构测定通常采用通常采用圆二色光谱圆二色光谱(circular dichroism，CD)测测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的螺旋的CD峰有峰有222nm处的负峰、处的负峰、208nm处的负峰和处的负峰和198 nm处的处的正峰三个成分；而

49、正峰三个成分；而 -折叠的折叠的CD谱不很固定。谱不很固定。 * 三级结构测定三级结构测定X射线衍射法射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。空间结构最准确的方法。 *同源模建同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐序列对齐补偿氨基酸替补、插入和缺失补偿氨基酸替补、插入和缺失通过通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。相似性越高，预测的模型也越准确。根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构*折叠识别折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。*从无到有从无到有：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上：根据单个氨基酸形成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。