亲和纯化技术ppt课件.ppt

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1、第九章第九章 亲和纯化技术亲和纯化技术 利用生物分子间的利用生物分子间的特特异性结合作用异性结合作用的原理的原理进行生物物质分离纯进行生物物质分离纯化的技术称为化的技术称为亲和纯亲和纯化技术化技术（Affinity Affinity purificationpurification）123技术要点技术要点 （1）找与底物）找与底物专一专一可逆结合可逆结合的配基；的配基； （2）将配基通过）将配基通过共共价键价键偶联到基质；偶联到基质； （3）配基）配基与与底物底物吸吸附附； （4）洗脱目标物。）洗脱目标物。 4亲和纯化技术亲和纯化技术 亲和层析亲和层析(Affinity chromatogra

2、phy) (Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离）亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取）亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀）亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）亲和电泳（电泳）5第一节第一节 亲和层析亲和层析(affinity Chromatography) 利用生物大分子物质具有与某些相应利用生物大分子物质具有与某些相应的分子的分子专一性可逆结合专一性可逆结合的特性而建立的特性而建立的层析技术。的层析技术。 适用于从成份复杂且杂质含量远大于适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。

3、目标物的混合物中提纯目标物。6特点特点 经过一次处理可得到经过一次处理可得到高纯度活性高纯度活性物质物质 ； 设备要求不高、操作简便、设备要求不高、操作简便、特异性强特异性强、分离速度、分离速度快、分离效果好、分离条件温和快、分离效果好、分离条件温和； 亲和吸附剂通用性较差，亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂专用的吸附剂。7亲和吸附剂：载体亲和吸附剂：载体配基配基 在亲和层析中起在亲和层析中起可逆结合的特异可逆结合的特异性物质称为性物质称为配基配基（Ligand）。）。 与配基结合的层与配基结合的层析介质称为析介质称为载体载体（Matrix）。）。8一、亲和层析的原理一、亲和层析的原理 （1）

4、配基固定化配基固定化：配基：配基与与载体载体偶联，结合成具有偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。特异亲和性的分离介质。 （2）吸附样品吸附样品：亲和层：亲和层析介质选择性吸附生物活析介质选择性吸附生物活性物质性物质.（3）样品解吸样品解吸：选择适宜：选择适宜的条件使被吸附物活性物的条件使被吸附物活性物质解吸。质解吸。9二、亲和层析载体二、亲和层析载体（一）、亲和层析对载体的要求：（一）、亲和层析对载体的要求： （1）充分）充分功能化功能化，与配基进行共价连接。，与配基进行共价连接。 （2）有较好的）有较好的理化稳定性和生物惰性理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的）具有高度的水不溶性和亲水

5、性水不溶性和亲水性。 （4）具有）具有多孔的立体网状结构多孔的立体网状结构。 （5）应为）应为大小均匀大小均匀的刚性小球。的刚性小球。10（二）、常用载体（二）、常用载体 纤维素纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体其它载体壳聚糖壳聚糖 (Chitosan)111 1、纤维素、纤维素 纤维素纤维素结构紧密结构紧密、均一性差，不利于大、均一性差，不利于大分子的渗入。分子的渗入。 非特异性吸附力较强，非特异性吸附力较强，空间位阻空间位阻。 主要用于主要用于分离与核酸有关的物质分

6、离与核酸有关的物质。 122 2、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 琼脂糖浓度有琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为，商品为Sepharose 2B、4B和和6B（Pharmacia）。）。 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松功能基团，结构疏松孔径大，流速快孔径大，流速快。 Sepharose CL, ,稳定性明显增加，能在稳定性明显增加，能在pH314中应用。中应用。 13 3 3、葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶： 葡聚糖凝胶孔径太小葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。应用受到限制。 4 4、聚丙烯酰胺凝胶：聚

7、丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P 有供化学反应的有供化学反应的酰胺基酰胺基，能制得配基含量较能制得配基含量较高的亲和柱高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。过高或过低的溶液中酰胺基易水解。14 5 5、多孔玻璃珠：多孔玻璃珠： 化学与物理稳定性化学与物理稳定性较好，机械强度高。较好，机械强度高。 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有有非特异性吸附非特异性吸附，化学活性基团少。，化学活性基团少。 6 6、其它载体、其它载体壳聚糖壳聚糖15壳聚糖壳聚糖(甲壳素和壳聚糖甲壳素和壳聚糖

8、)16三三 、 亲和配基亲和配基 配基的选择配基的选择 配基的配基的浓度浓度 配基偶联的配基偶联的位置位置 配基分子的配基分子的大小大小 配基的配基的类型类型17（一）、配基的选择（一）、配基的选择 亲和层析配基的选用主要取决于分离亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。对象。 1 1、配基与配体有足够大的亲和力、配基与配体有足够大的亲和力 （亲（亲和势），和势），K KL L 在在10-410-8之间之间。 2 2、配基与配体的结合应是专一的、配基与配体的结合应是专一的 。 3 3、配基应具有化学活性、配基应具有化学活性 。18亲和势亲和势KL（EL复合物的解离常数复合物的解离常数 ） 19（

9、二）、配基的浓度（二）、配基的浓度 对亲和势比较低的时候（对亲和势比较低的时候（KL10-4mol/L），），增加增加配基浓度配基浓度有利于吸附。有利于吸附。 增加增加亲和柱的长度亲和柱的长度来提高吸附率。来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为理想的配基浓度为1-10mol/L。20（三）、配基偶联的位置（三）、配基偶联的位置 配基固定化时，其配基固定化时，其不参与亲和不参与亲和结合的部位与载体进行偶联结合的部位与载体进行偶联。 AMP-Sepharose亲和柱亲和柱 腺嘌呤腺嘌呤N6-氨基氨基接到载体上，对接到载体上，对脱氢

10、酶和甘油激酶有吸附力。脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 磷酸基磷酸基接到载体上，对甘油醛接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。磷酸脱氢酶有吸附力。21（四）、配基分子的大小（四）、配基分子的大小 选用选用大分子配基大分子配基。 甘氨酸甘氨酸 小分子物质作为配基，小分子物质作为配基，载体和配基间插入一载体和配基间插入一个个“手臂手臂”以消除空以消除空间障碍。间障碍。22（五）、配基的类型（五）、配基的类型 较小的有机分子或天然生物活性物质较小的有机分子或天然生物活性物质。 根据配基应用和性质根据配基应用和性质:特殊配基和通用特殊配基和通用配基配基。 特殊配基特殊配基（special ligan

11、dspecial ligand） 23通用配基（通用配基（general ligand） 用于一类物质的分离提纯。用于一类物质的分离提纯。 用用NADH作作脱氢酶脱氢酶类亲和层析的通用配类亲和层析的通用配基；基； 用用ATP作激酶类亲和层析的通用配基；作激酶类亲和层析的通用配基； 用用外源性凝集素外源性凝集素作作糖蛋白类糖蛋白类亲和层析时亲和层析时的通用配基等。的通用配基等。 24四、四、 载体的活化与偶联载体的活化与偶联 糖类载体的活化与偶联糖类载体的活化与偶联 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联活化与偶联 用于固定化配基的凝胶衍生物用于固定化配基的凝胶衍

12、生物 25（一）、糖类载体活化与偶联（一）、糖类载体活化与偶联 溴化氰溴化氰活化法活化法 高碘酸氧化法高碘酸氧化法 环氧化法环氧化法 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法 双功能试剂法双功能试剂法26溴化氰活化法溴化氰活化法 载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下用用溴化氰溴化氰处理，可引入活泼的处理，可引入活泼的“亚氨基碳亚氨基碳酸酸”中间体。中间体。 在弱碱的条件下直接与在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨含有游离脂肪族氨基或芳香族氨基的配基基或芳香族氨基的配基偶联。偶联。27方法28高碘酸氧化法高碘酸氧化法 多糖载体与多糖载体与0.1mol/L的的高碘酸钠高碘酸钠氧

13、化反应氧化反应24小小时会产生醛；时会产生醛； 在温和条件下，醛与赖氨酸上的在温和条件下，醛与赖氨酸上的-NH2生成生成西西夫碱夫碱，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基烷基胺胺。29 环氧化法环氧化法 碱性条件下，多糖载体与碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷环氧氯丙烷作用作用生成环氧化合物；生成环氧化合物； 环氧化合物又与环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶氨基酸或蛋白质上氨基偶联联。30 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法 甲苯磺酰氯法甲苯磺酰氯法 在无水丙酮中进行。在无水丙酮中进行。 优点：活化反应迅速；优点：活化反应迅速； 偶联条件温和；偶联条件温和； 偶联效率高。偶

14、联效率高。 31双功能试剂法双功能试剂法 双功能试剂双功能试剂是同一分子中具有是同一分子中具有两个反应活性基团两个反应活性基团的的化学试剂，常作为连接两个分子的化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁桥梁”。 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、酚、醇类等偶联。酚、醇类等偶联。 32（二）、（二）、聚丙烯酰胺凝胶及聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联其它凝胶衍生物活化与偶联 叠氮化法叠氮化法 重氮化法重氮化法 ( (含氨基载体含氨基载体) ) 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）碳二亚胺缩合法（

15、含羧基载体）33聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法 有大量可修饰的有大量可修饰的酰胺基酰胺基。 酰胺基能被酰胺基能被含氮化合物含氮化合物置换制备多种衍生物。置换制备多种衍生物。 34叠氮化法叠氮化法 聚丙烯酰胺的聚丙烯酰胺的酰肼衍生物酰肼衍生物，加，加1mol/L的亚的亚硝酸，反应液搅硝酸，反应液搅90s； 加入加入脂肪胺类配基脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。，制得亲和吸附剂。 35重氮化法重氮化法 -氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 用连二亚硫酸钠还原，亚

16、硝酸钠处理，得用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。，制得亲和层析柱。36碳二亚胺缩合法碳二亚胺缩合法 碳二亚胺为碳二亚胺为羧基活化剂羧基活化剂。 反应中的脲反应中的脲衍生物可用衍生物可用有机溶剂洗有机溶剂洗涤除去。涤除去。37（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物 1、CNBr活化的活化的Sepharose 4B Sepharose 4B经经CNBr活化，可偶联蛋白和核酸活化，可偶联蛋白和核酸类配基。类配基。2、AH-Sepharose 4B和和CH-Sepharose 4B

17、含有含有6个碳原子的个碳原子的”手臂手臂”的琼脂糖衍生物的琼脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基用于含有羧基的一类配基。 CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶联。能与含有一级氨基的配基偶联。38 393、环氧活化型、环氧活化型Sepharose 6B 由亲水由亲水“手臂手臂”与与Sepharose 6B载体通载体通过醚链形成的衍生物。过醚链形成的衍生物。 用于用于小分子配基的固定化小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。404、活化型亲和胶、活化型亲和胶10和和15 由由N-羟琥珀酰亚胺羟琥珀酰亚胺

18、与琼脂糖衍生物形成的活化酯。与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的的“手臂手臂”长为长为10个碳原子，产生一些负电个碳原子，产生一些负电荷，荷，有利于碱性或中性蛋白偶联有利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15为为15个碳原子的个碳原子的“手臂手臂”，产生一些正电荷，产生一些正电荷，故故有利于酸性蛋白的偶联有利于酸性蛋白的偶联。 415、CM-生物胶生物胶A、亲和胶、亲和胶202和亲和胶和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无，无“手臂手臂” 的的羧基衍生物羧基衍生物； Affi-Gel 102具有具有6个原子个原子“手臂手臂”，未端为氨基。，未端为氨基。 Affi-G

19、el202具有具有10个原子的个原子的“手臂手臂”，未端具有羧基；，未端具有羧基；42五、五、 影响吸附亲和力的几个因素影响吸附亲和力的几个因素 K KL L 配基浓度配基浓度对亲和力的影响对亲和力的影响 空间障碍空间障碍的影响的影响 配基与载体的配基与载体的结合位点结合位点的影响的影响 载体孔径载体孔径的影响的影响 微环境微环境的影响的影响43（一）、配基浓度对亲和力的影响（一）、配基浓度对亲和力的影响 为将亲和配体与其它物质分开，需要为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值阻留值10。 配基浓度配基浓度与与亲和对解离常数亲和对解离常数相关。相关。 对于低亲和力系统，对于低亲和力系统，配基浓度

20、配基浓度。 44（二）、空间障碍的影响（二）、空间障碍的影响 空间位阻。空间位阻。 对于对于分子大的配体分子大的配体以及以及小小分子配基分子配基更明显。更明显。 “手臂手臂”，增加与载体相，增加与载体相连配基的活动度，减轻载连配基的活动度，减轻载体的立体障碍。体的立体障碍。 常用的常用的“手臂手臂”多为烃链多为烃链。 45（三）、配基与载体的结合位点的影响（三）、配基与载体的结合位点的影响 多肽或蛋白质等大分子配基多肽或蛋白质等大分子配基 须须控制偶联控制偶联反应反应条件条件，使它以，使它以最少的功能最少的功能基团与载体连接基团与载体连接。 保持蛋白质原有的保持蛋白质原有的高级结构高级结构，使

21、亲和吸附，使亲和吸附剂具有较大的亲和力。剂具有较大的亲和力。 46 （四）、载体孔径的影响（四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。对吸附剂亲和能力有影响。 （五）、微环境的影响（五）、微环境的影响 载体及载体及“手臂手臂”的的电性、极性电性、极性对亲和力的影响。对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团避免引入离子键的基团。 疏水作用疏水作用的存在，会引起的存在，会引起非特异性吸附非特异性吸附作用。作用。47六、六、 配基与间隔臂的连接配基与间隔臂的连接 （一）、含氮配基的连接（一）、含氮配基的连接 （二）、

22、含羧基配基的连接（二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接（三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接（四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接48七、七、 亲和层析的吸附和洗脱亲和层析的吸附和洗脱 影响影响吸附吸附的条件的条件 亲和层析的亲和层析的洗脱洗脱 亲和吸附剂的再生亲和吸附剂的再生49（一）、影响吸附的条件（一）、影响吸附的条件 亲和吸附剂及配体的性质亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析、温度和层析流速有关。流速有关。 温度温度升高会使吸附作用减弱。升高会使吸附作用减弱。 流速流速每小时低于每小时低于10 ml/

23、cm2。 层析柱用前必须充分平衡。层析柱用前必须充分平衡。 上样体积上样体积为柱床体积的为柱床体积的5%。50非专一性吸附非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。亲和层析中的非专一性吸附。 离子效应离子效应 疏水基团疏水基团 复合亲和力复合亲和力51离子效应离子效应 配基与配基与载体载体-间隔臂间隔臂的不的不完全结合，将无关完全结合，将无关离子离子基团引入基团引入吸附剂。吸附剂。 具有具有离子基团离子基团的亲和吸的亲和吸附剂会影响蛋白质的洗附剂会影响蛋白质的洗脱行为。脱行为。52疏水基团疏水基团 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引，形成的疏水区相互吸引

24、，形成非专一性非专一性吸附。吸附。 疏水基团：疏水基团： （1）长的烃链结构的）长的烃链结构的“手臂手臂”： （2）疏水性配基：）疏水性配基：53复合亲和力复合亲和力 离子效应离子效应作用，又有作用，又有疏水作用疏水作用。 配体与配基有较强生物特异性。配体与配基有较强生物特异性。 用用高浓度的盐高浓度的盐和和有机溶剂，有机溶剂，以提高以提高选择性。选择性。54（二）、亲和层析的洗脱（二）、亲和层析的洗脱 洗脱：洗脱： 洗脱方法主要有三种：洗脱方法主要有三种： 非专一性洗脱非专一性洗脱 特殊洗脱特殊洗脱 专一性洗脱专一性洗脱55非专一性洗脱非专一性洗脱 改变改变洗脱剂的洗脱剂的pH。 离子强度的

25、离子强度的分步和梯度变化分步和梯度变化. 亲和势很高，亲和势很高，促溶离子促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序，其洗脱能力的强弱顺序ClICF3COOSCN CCl3COO。 用蛋白质变性剂（如脲或用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍盐酸胍）。）。56特殊洗脱特殊洗脱 裂解配基与载体的连接键裂解配基与载体的连接键。 断裂方法有：断裂方法有： 硫酯键硫酯键用羟胺处理用羟胺处理30分钟；分钟； 偶氮键偶氮键用用连二亚硫酸钠连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理；硼酸缓冲液处理； 二硫键二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇糖醇等处理。等处理。57专一性洗脱专一性洗脱 S（固定化配基），（固定化配

26、基），E（酶），（酶），I（游离配基）（游离配基） （1）竞争性效应）竞争性效应，即，即ESI不如不如EI稳定，稳定，增加增加洗脱剂中洗脱剂中I，会使，会使E洗脱下来洗脱下来（正洗脱）。（正洗脱）。 （2）当）当ESI稳定性与稳定性与EI相同时，相同时，I的存在并不的存在并不影响影响E对对S的结合，非竞争性效应。的结合，非竞争性效应。 （3 3）反竞争性效应）反竞争性效应，即，即ESI比比EI稳定，稳定，I使使E与与S结合更紧密结合更紧密（负洗脱）（负洗脱） 。58反竞争性效应反竞争性效应59亲和层析中配基的选择和洗脱条件亲和层析中配基的选择和洗脱条件 60（三）、亲和吸附剂的再生（三）、亲和

27、吸附剂的再生 用缓冲液充分用缓冲液充分平衡平衡后即可重复使用。后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多亲和力下降，非特异吸附增加，大多由由变性蛋白变性蛋白沉积造成，用沉积造成，用6mol/L脲脲洗柱。洗柱。61八、其他亲和层析八、其他亲和层析 金属金属离子离子亲和层析亲和层析 有机染料亲和层析有机染料亲和层析 拟生物亲和层析拟生物亲和层析（Biomimetic AFCBiomimetic AFC） 62（一）、金属螯合亲和层析（一）、金属螯合亲和层析 将环氧活化型将环氧活化型Sepharose 6B与金属螯合与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金剂偶联，再用金属离子溶液处理制成

28、金属螯合亲和层析柱。属螯合亲和层析柱。 金属螯合剂金属螯合剂:亚氨二醋酸、氨基水杨酸、亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等羟基喹啉、羧甲基氨基酸等 .63 蛋白质上的氨基酸残基，如蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪组氨酸的咪唑基唑基、半胱氨酸的巯基半胱氨酸的巯基和和色氨酸的吲哚色氨酸的吲哚基基，利于蛋白质与固定化金属离子结合。，利于蛋白质与固定化金属离子结合。 金属离子如金属离子如锌和铜锌和铜。64 吸附：吸附：pH在在68。 洗脱：降低洗脱：降低pH值、增加离子强度、或在值、增加离子强度、或在缓冲液中加缓冲液中加5mmol/L EDTA等方法。等方法。特点：特点： 蛋白质蛋白

29、质吸附容量吸附容量大；大； 价格便宜；价格便宜； 具有普遍适用性。具有普遍适用性。65（二）、有机染料亲和层析（二）、有机染料亲和层析 有机染料具有类似于有机染料具有类似于NAD+的的结构。结构。 需核苷酸类物质为辅酶的酶，需核苷酸类物质为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。对染料具有一定亲和力。 染料共价偶联到琼脂糖染料共价偶联到琼脂糖载体上，载体上，能制得亲和层析柱。能制得亲和层析柱。 染料亲和层析已成功的分离纯染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。化了多种酶。66亲和层析亲和层析 一一 、原理、原理 二二 、亲和层析载体亲和层析载体 三三 、亲和配基亲和配基 四四 、载体的活化与偶联载体的活

30、化与偶联 五五 、影响吸附亲和力的因素影响吸附亲和力的因素 六六 、配基与间隔臂的连接配基与间隔臂的连接 七七 、亲和层析的吸附和洗脱亲和层析的吸附和洗脱 八、其他亲和层析八、其他亲和层析67第二节第二节 其他亲和纯化技术其他亲和纯化技术 一、亲和过滤（膜分离）一、亲和过滤（膜分离） 二、亲和分配（双水相萃取）二、亲和分配（双水相萃取） 三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取）三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 四、亲和沉淀（沉淀分级）四、亲和沉淀（沉淀分级） 五、亲和电泳（电泳）五、亲和电泳（电泳）68一、一、 亲和过滤亲和过滤（Affinity FiltrationAffinity Filtrati

31、on） 将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲和错流过滤亲和错流过滤和和亲和膜分离亲和膜分离。 亲和错流过滤亲和错流过滤（affinity Cross Flow affinity Cross Flow Filtration,ACFFFiltration,ACFF）: : 是将是将亲和层析与超亲和层析与超滤技术滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。层析与膜过滤的优点。69亲和错流过滤亲和错流过滤 （affinity Cross Flow Fi

32、ltrationaffinity Cross Flow Filtration） 基质基质及及大分子亲和配基大分子亲和配基 基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆专一可逆的的吸附，形成吸附，形成复合体复合体； 用膜对混合液进行错流过滤，用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨复合体因分子巨大可被保留大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。它成分分离。 70基质基质 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 菌类的完整细胞菌类的完整细胞 （酵母酵母、芽胞杆菌、芽胞杆菌

33、、链球菌等细胞）链球菌等细胞） 琼脂糖、脂质体等琼脂糖、脂质体等 酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白A71亲和膜亲和膜 （affinity membrane） 亲和膜利用亲和膜利用亲和配基亲和配基修饰的修饰的微滤膜微滤膜为亲和吸附介质为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析固定床亲和层析的变型。的变型。 将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。 72亲和膜优点亲和膜优点 传质阻力小传质阻力小，达到吸附平衡的时间短；，达到吸附平衡的时间短； 配基利用率高，配基利用率高，配基用量低配基用量低； 压降小

34、，流速快；压降小，流速快； 设备体积小。设备体积小。73二、亲和萃取二、亲和萃取 （Affinity extraction） 定义：利用定义：利用偶联亲和配基的偶联亲和配基的PEG为成相聚为成相聚合物进行的合物进行的双水相萃取双水相萃取，在亲和配基的亲，在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相（上相）的分配，提高目标产物的相）的分配，提高目标产物的分配系数和分配系数和选择性选择性。 PEG/Dextran, PEG/无机盐无机盐74 mA目标分子的亲和分配系数目标分子的亲和分配系数 T和和B分别表示上相和下相；分别表示上相和下相； mA和和m O为有、无

35、配基时目标分子的分配系数；为有、无配基时目标分子的分配系数； m L为配基的分配系数；为配基的分配系数； CL为配基浓度；为配基浓度； Kd为配基与目标分子反应的解离常数。为配基与目标分子反应的解离常数。 上相配基浓度上相配基浓度CLT越高，越高，m A越大越大 75亲和萃取纯化过程亲和萃取纯化过程 亲和分配（进亲和分配（进料），料）， 杂蛋白反萃取杂蛋白反萃取（清洗）（清洗） 目标产物反萃取目标产物反萃取（洗脱）（洗脱）。 76三、亲和反胶团萃取三、亲和反胶团萃取（Affinity-based reversed micellar extraction） 定义：指在定义：指在反胶团反胶团相中除

36、通相中除通常的表面活性剂以外，添加常的表面活性剂以外，添加另一种亲水另一种亲水头部为亲和配基头部为亲和配基的的助表面活性剂助表面活性剂（cosurfactant）；）； 通过通过亲和配基亲和配基与与目标分子目标分子的的亲和结合作用，促进目标产亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配。物在反胶团相的分配。77亲和反胶团萃取过程亲和反胶团萃取过程78反萃取反萃取79四、亲和沉淀四、亲和沉淀 （Affinity precipitation） 亲和沉淀亲和沉淀: :是是生物亲和相互作用生物亲和相互作用与与沉淀分离沉淀分离相结合的生物大分子的分离纯化技术。相结合的生物大分子的分离纯化技术。 一次作用亲

37、和沉淀一次作用亲和沉淀 二次作用亲和沉淀二次作用亲和沉淀80一次作用亲和沉淀一次作用亲和沉淀 水溶性化合物分子水溶性化合物分子上偶联有两个或两个以上的上偶联有两个或两个以上的亲亲和配基和配基 双配基（双配基（bis-ligand）；多配基（）；多配基（polyligand）。）。 双配基或多配基双配基或多配基与含有两个以上与含有两个以上亲和结合部位亲和结合部位的的多价蛋白质多价蛋白质产生亲和交联，增大为较大的交联网产生亲和交联，增大为较大的交联网络而沉淀。络而沉淀。81二次作用亲和沉淀二次作用亲和沉淀 制备亲和沉淀介质制备亲和沉淀介质: :利用在利用在物理场物理场改变时溶解度下改变时溶解度下降

38、、发生可逆性沉淀的降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物水溶性聚合物为载体为载体固定亲固定亲和配基。和配基。 亲和介质结合目标分子后，通过亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场改变物理场使使介质介质与目标分子共同沉淀与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。的方法称为二次作用亲和沉淀。 离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。 沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。82可逆沉淀性聚合物可逆沉淀性聚合物 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺83可逆沉淀性聚合物可逆沉淀性聚合物聚合脂质体（聚合脂质体（polymerized lip

39、osome,PLS） 84亲和沉淀纯化技术优点亲和沉淀纯化技术优点 （1）溶液中进行溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速，无扩散传质阻力，亲和结合速度快；度快； （2）亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高；）亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； （3）离心或过滤技术回收沉淀，规模放大；）离心或过滤技术回收沉淀，规模放大； （4）可用于）可用于高粘度高粘度或或含微粒含微粒料液中目标产物纯化。料液中目标产物纯化。85五、亲和电泳（五、亲和电泳（Affinity ElectrophoresisAffinity Electrophoresis） 亲和电泳是将亲和层析与电泳技术结合起来，亲和电泳是将亲和

40、层析与电泳技术结合起来，将亲和层析的将亲和层析的吸附剂包埋到琼脂凝胶板吸附剂包埋到琼脂凝胶板上制成上制成AEP载体。载体。 （1）、）、外源凝集素亲和电泳外源凝集素亲和电泳（Lectin Affinity Electrophoresis，LAE） （2）、）、毛细管亲和电泳毛细管亲和电泳（Capillary Affinity Electrophoresis，CAE）86外源凝集素亲和电泳外源凝集素亲和电泳 利用利用外源凝集素外源凝集素对目标蛋白质对目标蛋白质的特异性作用进行亲和电泳。的特异性作用进行亲和电泳。 适用于分析血清糖蛋白。适用于分析血清糖蛋白。87毛细管亲和电泳毛细管亲和电泳 将亲和技术应用于毛细管电泳将亲和技术应用于毛细管电泳毛细管亲和毛细管亲和电泳电泳。 原理：根据底物、配基、与底物原理：根据底物、配基、与底物-配基复合物配基复合物的迁移时间不同，采用毛细管区带电泳测定的迁移时间不同，采用毛细管区带电泳测定Kd或或Kb。 用于手性药物及用于手性药物及DNA片段的特异性分离。片段的特异性分离。 88