经典液相色谱法ppt课件.ppt

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1、1Chap. 5 经典液相色谱法经典液相色谱法 2本章内容层次本章内容层次掌握：吸附色谱法、分配色谱法的基本原理以及掌握：吸附色谱法、分配色谱法的基本原理以及应用，薄层色谱法的基本操作。应用，薄层色谱法的基本操作。熟悉熟悉：离子交换：离子交换色谱法的基本原理以及应用。色谱法的基本原理以及应用。了解：了解：尺寸排阻尺寸排阻色谱法、聚酰胺色谱法的基本原色谱法、聚酰胺色谱法的基本原理以及应用。理以及应用。31 吸附色谱法吸附色谱法1. 基本原理基本原理1.1 定义定义 一种溶质基于吸附现象而获得分离的液固色谱分析方法，按操作方式又可分为吸附柱色谱和薄层色谱。41.2 吸附色谱法的依据吸附色谱法的依据

2、吸附过程的两个规律：1）吸附过程是可逆的，存在着吸附 解附的动态平衡,存在一个吸附平衡常数 K=Cs/Cm2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异5吸附机理 流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之，溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。6 1.3 吸附等温线吸附等温线 指在一定温度下，某一组分在固定相和流动相之间达到平衡时，组分在固定相中的浓度Cs对组分在流动相中的浓度Cm作图得到的曲线，用函数描述为Cs=f（Cm），它描述了组分在两相中浓度之间的关系。7等温线的形状是重要的色谱特性之一。它反映了一定

3、温度下，吸附剂对溶液中某一组分的吸附能力。对某一体系，组分的分布取决于吸附等温线，它有三种类型：线型、凸型和凹型。通常在低浓度时，每种等温线均呈线型，而在高浓度时，等温线则呈凸型或凹型。892. 吸附剂吸附剂2.1 对吸附剂的要求对吸附剂的要求1）颗粒要有一定的细度且粒度要均匀2）具有较大的吸附表面积和一定的吸附能力3）与洗脱剂、样品不起化学反应，且不溶于洗脱剂中102.2 常用吸附剂常用吸附剂无机类：氧化铝、硅胶、硫酸钙、滑石粉、硅藻土等。有机类：活性炭、淀粉、蔗糖等。其中以硅胶和氧化铝硅胶和氧化铝较为常用。111 1）氧化铝氧化铝优点：分离能力强、活性可控分类：酸性、中性、碱性 以中性氧化

4、铝使用较多,用来分离生物碱、挥发油、萜类、甾体、蒽醌以及在酸碱中不稳定的苷类、醌、内酯等化合物。活化温度：200200400400122 2）硅胶硅胶优点：适用于各类样品的分离吸附能力：取决于骨架表面的硅醇基吸附机理：硅胶表面羟基作为质子给予体，通过氢键形式将溶质吸附在硅胶表面。由于硅胶具有弱酸性，所以选择性地保留胺类和其它碱性化合物。活化温度：105105110110132.3 吸附剂的活性吸附剂的活性吸附剂的活性与含水量有一定的关系。吸附剂在使用前必须先经过活化处理。活化：在一定温度下，加热除去水分以增强活性的过程。14硅胶含水量()活性级别氧化铝含水量()0053156251038151

5、53. 色谱条件的选择色谱条件的选择 在吸附色谱中，除了正确选择吸附剂外，还可以通过流动相的选择来改变K值，或改变一对化合物的K值比，从而使它们的K值有最大的差别而达到分离。流动相在色谱分析中除了起着溶质通过色谱柱的作用，还影响着溶质的分配系数，所以在色谱分析中流动相的选择也很重要。极性较大的化合物可以比较强的从溶液中被吸附剂吸附，需要极性较大的洗脱剂才能洗脱下来。16选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物质、流动相三方面综合考虑。174. 操作方法操作方法薄层色谱薄层色谱4.1 基本概念基本概念 1）薄层色谱法）薄层色谱法 将吸附剂（或载体）均匀地铺在玻璃板或塑料板、铝箔、聚酯薄膜上，形

6、成薄层，把要分离的样品点加在薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。182）比移值）比移值Rf 在薄层色谱法中，常用比移值Rf来表示各组分在色谱中的保留行为。 Rf(A)= b/c Rf(B)=a/c19 在给定条件下，Rf值为常数，其值在01之间。 当Rf值为0时，表示化合物在薄层上不随溶剂的扩散而移动，仍在原点位置；Rf为1时，表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶剂同步移动。Rf值：一般要求0.2 0.8 最佳范围0.30.5。203）薄层色谱法的特点）薄层色谱法的特点展开时间短，一般只需十几到几十分钟；分离能力强，斑点集中；灵敏度高，通常用量为几至几十微克；显色方便；仪

7、器简单，操作方便。214.2 操作技术操作技术薄层色谱法的操作步骤：选择选择制板制板点样点样展开展开斑点的检出斑点的检出定性定量定性定量221）选）选 择择(1)选板 玻璃板表面光滑、平整清洁(2)固定相：吸附剂；粘合剂(3)流动相(4)显色剂232）制板）制板 薄层板的制备，就是将吸附剂均匀地涂铺在玻璃板上，使成薄层称之为制板。制板的步骤：制板的步骤：(1)吸附剂的涂布 (2)板的活化24(1) 吸附剂的涂布常用薄板：加粘合剂的硬板硬板和不加粘合剂的软板软板一般氧化铝采用软板多，而硅胶常采用硬板。硬板的涂铺方法：倾注法 、平铺法、涂铺器 、喷雾法25(2) 板的活化 铺成的薄层，必需置于水平

8、台面上晾干（也可以热风吹干），再置烘箱中活化即可。263）点样）点样 薄层分析时，一般使用微量注射器或毛细管点样。注意事项：（1）溶剂应易挥发或用流动相。（2）样品浓度合适，一般对照品浓度宜控制在几mg/ml。27（3）点样体积宜在20ml以下，点加量一般为几几十微克，直径以小于3mm为宜。少量多次点加。（4）点样时，原点距离底边、两侧边以及点与点之间的距离均应在11.5cm。（5）要求原点直径一致，点样间距精确。所有原点应在同一水平线上，斑点面积也尽可能一致。28（6）用于定量或分离提纯时，往往沿着起始线点加样品成一条状，以使点加的量相应增多。（7）点样时最好在密闭容器中或比较干燥的条件下完

9、成，避免薄板吸收水分降低活性，若在空气中点样，时间最好在10分钟内完成。点样完毕后使溶剂挥干，再选用适当溶剂展开。294）展开）展开（1）展开原理 将薄板一端浸入展开剂，点样处不可接触展开剂，展开剂借助毛细作用上升，带动样品中组分的迁移。30（2）展开箱的分类常规饱和箱（NS）用溶剂饱和的滤纸作衬里使展开箱充分饱和（CS）夹心板箱，可减少展开箱的体积 （3）展开剂的选择首选单元溶剂，再选混合溶剂（由简至繁）31（4）边缘效应 定义：点于同一薄层的同一物质的斑点，在色谱展开过程中，靠薄层边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点的Rf值有所不同，此种现象称为边缘效应。产生原因：边缘效应多数出现在极性强弱不

10、等的混合溶剂展开系统中，用单一组分展开剂，边缘效应较为少见。32减少边缘效应的办法 最好用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一定时间，待溶剂蒸汽达到饱和后再展开；如在展开缸内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条，效果也很好；如采用3cm以下的狭小薄板，只点23个点时，也会减小边缘效应。335）斑点的检出）斑点的检出（1）光学检出法（2）显色剂法显色剂种类：专属型显色剂、通用型显色剂 346）定性与定量分析）定性与定量分析定性分析（1）用保留值定性Rf（2）用多种溶剂系统定性 定量分析（1）斑点捕集后洗脱测定法（2）薄层扫描法35影响影响Rf值的因素值的因素：分离对象的化学结构、固定相的组成及性质、流动相的

11、组成及性质、介质的影响（包括实验室及展开箱的湿度、温度、饱和与否、上样量等等）解决方法解决方法：为了解决由于Rf值重现性差，进行定性困难的问题，也可以采用相对比移植Rst来定性。 Rst Rf (i)/Rf(s)36薄层扫描法薄层扫描法b定义：直接测量板上被分离化合物斑点的吸收、反射、荧光等进行定量的方法。b分类：吸收扫描法和荧光扫描法b扫描方式：线性扫描法和锯齿扫描法b定量方法：外标法外标一点法和外标两点法 内标法37b优点：快速、高效、灵敏b主要不同：吸附剂颗粒小 薄层厚度薄 点样直径小 展开方式不同高效薄层色谱382 分配色谱法分配色谱法 分配色谱是将某种溶剂涂布在固体颗粒表面或纸纤维上

12、形成一层液膜作为固定相，利用各组分在固定相和流动相之间分配系数的不同而实现分离的方法。 391. 基本原理基本原理 msCCK 分配定律：分配色谱以直线型等温线最普遍，洗脱峰峰形对称而尖锐。 在分配色谱中，用溶剂极性来描述分配作用的，因此溶解度的“相似相溶”经验规则可用于分配色谱中。 402. 分配色谱的分类分配色谱的分类b正相色谱正相色谱：固定相的极性大于流动相的极性 保留：极性越大的组分保留越强b反相色谱反相色谱：流动相的极性大于固定相的极性 保留：极性越小的组分保留越强413. 载体载体b作用：负载固定液b要求：化学惰性，粒度小而均匀，纯净，与固定液间有较大的分子间作用力。b常用载体：硅

13、胶 、硅藻土 、纤维素 424. 固定液相与流动液相固定液相与流动液相b溶剂对选择原则1）不相互溶（预先互饱和）2）Ss Sm ( 提高分析效率)43固定相与流动相的选择固定相与流动相的选择 b先采用对各组分溶解度均较大的溶剂为洗脱剂 b根据分离情况改变洗脱剂的组成和比例（即在流动相中加入一些别的溶剂），调整各组分的分离及洗脱速率 445. 操作方法操作方法 5.1 柱色谱柱色谱 b固定相的涂布与装柱 b分配柱色谱的加样和洗脱5.2 纸色谱纸色谱 b色谱纸的选择和处理 b点样及展开b分离混合物，Rf值之差最好大于0.05以免斑点重叠；鉴别单一化合物，Rf值最好在0.40.6之间。456. 应用

14、应用b分配色谱适用于各种类型化合物的分离，尤其适用于是强极性亲水性物质的分离（如：脂肪酸和多元醇）b优点：较好的重现性，并可根据K值预示分离结果。分配系数在较大的浓度范围内是常数，其洗脱峰多数为对称峰，峰形尖锐。在大多数情况下，均能找到一组合适的溶剂进行分离。 46473 离子交换色谱法离子交换色谱法 以离子交换树脂为固定相，用水或与水混合的溶剂作为流动相，利用离子交换树脂对各组分离子交换能力（亲合力）的不同而使实现分离的方法称为离子交换色谱法(ion exchange chromatography, IEC)。 481. 离子交换树脂的分类离子交换树脂的分类b离子交换树脂主要由高分子聚合物的

15、骨架和活性基团所组成，它的骨架具有特殊的网状结构。以聚苯乙烯型最常用。b根据所交换离子的电荷可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂 。491.1 阳离子交换树脂阳离子交换树脂 b根据可交换的离子的不同氢型树脂含有SO3H,COOH,OH,SH,PO3H2等酸性基团盐型树脂含有钠盐、钾盐b依据其酸性强度强酸型阳离子交换剂弱酸型阳离子交换剂树脂的酸性强度一般按下列次序递减：RSO3HHO-R- SO3HRPO3H2RCOOHROH 50磺化苯乙烯树脂磺化苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯经聚合，磺化而成，是应用最普遍的离子交换树脂 CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCHCH2CHCH2CHCH2

16、CHCH2CHSO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3H51交换反应：交换反应： R-SO3-H+ + Na+ + Cl- R-SO3- Na+ + H+ + Cl- 521.2 阴离子交换树脂阴离子交换树脂 b根据可交换的离子的不同氢氧型树脂N+R3OH- 氯型树脂N+R3Cl- b依据其碱性强度强碱性阴离子交换树脂 弱碱性阴离子交换树脂 532. 离子交换树脂的特性离子交换树脂的特性2.1 交联度交联度b定义：表示离子交换树脂中交联剂的含量，通常以重量百分比来表示。 高交联度树脂网状结构紧密，网眼小，刚性较强，能承受一定的压力；孔穴较多；溶胀较小，吸水量少。低

17、交联度树脂网状结构疏松，网眼大，具有较好的渗透性，但存在着易变形和耐压差等缺点。 54根据分离对象选择树脂交联度：根据分离对象选择树脂交联度： b分离小分子物质（氨基酸） 选择8%树脂为宜b分离分子量较大的物质（多肽） 选择24%树脂为宜552.2 交换容量交换容量b定义是指每克干树脂中真正参加交换反应的基团数。常用单位为mmol/g。b交换容量是一个重要的实验参数，通常以实测值为准。562.3 溶胀溶胀b定义当将树脂浸入水中后，有大量水进入树脂内部，引起树脂膨胀的现象称为溶胀。b溶胀的程度取决于交联度的高低 交联度高，溶胀小；交联度低，溶胀大。b一般说来，lg树脂最大吸水量为lg。 572.

18、4 粒度粒度 b离子交换树脂的颗粒大小，一般是以溶胀状态所能通过的筛孔来表示。b实际操作根据需要选用不同粒度的树脂： 交换纯水常用1050目树脂，分析用树脂常用100200目。583. 离子交换平衡离子交换平衡离子交换反应可用下式表示：R-A+ + B+ R-B+ + A+ 59离子交换反应平衡时离子交换反应平衡时 ：b选择性系数 （交换系数）R-A+R-B+分别表示在树脂相中A+、B+ 的离子浓度A+、B+分别表示A+、B+离子在溶液中的浓度。BARARK-B/AB60当各离子强度和树脂的填充状况一定时，KA/B为常数。bKA/B1，说明树脂对B比对A有更大的亲合力b离子的相对亲合力将随水合

19、离子半径的增加和电荷的减小而降低。 61离子交换色谱的分离机理离子交换色谱的分离机理 b利用样品组分选择性系数的不同而进行分离主要用于金属离子的分离。b各种离子对离子交换树脂的亲合力不同，当两种或两种以上的离子共存时，利用它们的选择性系数的不同，从而在离子交换柱上进行洗脱时，它们的移动速度也不同，达到分离。62b利用各组分离解度的差别而进行分离用于用于弱酸性、碱性组分分离b调整流动相的pH，使组分中的各个不同成分以离子型或以游离型的不同形式出现。由于游离型(中性分子)成分不被交换树脂所吸附，而和离子型成分相分离。例如用强酸性树脂来分离氨基酸即利用此原理 63b形成络离子后进行离子交换分离 对于

20、选择性系数相同的两个组分，如A与B，可使其与适当的络合剂形成络离子，然后利用不同络离子与离子交换树脂的亲合力不同而进行分离。 64经验规律：经验规律： b在低浓度水溶液及常温下，阳离子的交换能力随其电荷的升高而增大。 Th4+Al3+Ca2+Na+b常温下，在低浓度水溶液中，等价阳离子的交换亲合力随水合离子半径增大而变小，随其裸离子半径增大而变大。 Cs+Rb+K+Na+Li+ Ra+Ba+Sr2+Ca2+Mg2+Be2+ 65在强酸性阳离子交换树脂中b一价阳离子的亲合力顺序为： Ag+Tl+Cs+Rb+K+NH3+Na+H+Li+b 二价阳离子的亲合力顺序为： Ba2+Pb2+Sr2+Ca2

21、+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+UO22+b稀土元素的亲合力随原子序数增大而减小，其顺序为：La3+Ce3+Pr3+Nd3+Sm3+Eu3+Gd3+Tb3+Dy3+Y3+Ho3+Ev3+Tm3+Yb3+Lu3+Sc3+66b阴离子的亲合力受阴离子的电荷数，离子的大小，交换离子的浓度，以及树脂的性质所影响。 b在强碱性阴离子交换树脂中，阴离子的亲合力顺序为：柠檬酸根PO43-SO42-C2O42-I-HSO4-NO3-CrO42-Br-CN-NO2-Cl-HCOO-CH3COO-OH-F-b在弱碱性阴离子交换树脂中，其亲合力顺序为：OH-SO42-CrO42-柠檬酸根酒石酸根N

22、O3-AsO43-PO43-MnO42-CH3COO-I-Br-Cl-F-674. 操作方法及应用操作方法及应用4.1 树脂的处理和再生树脂的处理和再生阳离子交换树脂：先将树脂浸于蒸馏水中使其溶胀，然后用5%10%盐酸处理使其变为氢型。阴离子交换树脂：用10%NaOH或10%NaCl溶液处理，使其变为羟基型或氯型。最后用蒸馏水洗去多余的酸或碱并洗至中性。再生：将用过的树脂用适当的酸或碱、盐处理684.2 装柱装柱4.3 洗脱洗脱：大多数用水 、不同离子浓度的pH缓冲液，复杂的多组分采用梯度洗脱4.4 应用应用 除去干扰离子 测定盐类含量 微量元素的富集694 空间排阻色谱法空间排阻色谱法b主要

23、用于大分子物质如蛋白质等的分离主要用于大分子物质如蛋白质等的分离 b固定相为凝胶等化学惰性、具有多孔网状结构的物质，利用凝胶对不同大小分子阻滞作用不同，从而按分子大小实现分离。 701. 基本原理基本原理分子筛效应分子筛效应b分子量大的溶质组分完全不能进入凝胶颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙随溶剂最早流出色谱柱。b分子量小的组分，可自由渗入凝胶颗粒内的孔隙中，最晚流出色谱柱。b中等大小分子的组分，只能进入部分颗粒内较大的孔隙，组分流出介于两者之间。71分配系数小分子， K1，即VRV0+Vi，大分子，K0， VRV0中等大小分子，0K1 ， VR V0V0+Vi CmCsK 722.凝胶的分类凝胶的分类b葡聚糖凝胶b聚丙烯酰胺凝胶 b琼脂糖凝胶b聚苯乙烯凝胶 b葡聚糖凝胶LH20 b无机凝胶 733. 操作方法及应用操作方法及应用 b凝胶的选择 ：根据分离对象和分离要求选择适当型号的凝胶 3.1 组别分离组别分离：从小分子物质中分离大分子物质或从大分子物质中分离小分子物质，即对于分配系数有显著差别的分离叫组别分离。3.2 分级分离分级分离：被分离物质之间分子量比较接近，根据其分配系数的分布和凝胶的工作范围，把某一分子量范围内的组分分离开。b分级分离常用于分子量的测定。 74装柱装柱：先溶胀；填充均匀；柱平衡洗脱:应用应用：大分子物质分子量的测定、分离纯化、脱盐、浓缩。