PCR常见问题、原因分析及其对策ppt课件.ppt

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1、PCR技术常见问题、原因分析及技术常见问题、原因分析及其对策其对策淮北师范大学生命科学学院淮北师范大学生命科学学院朱秀云朱秀云内容内容提高提高PCR反反应应特特异异性的策略性的策略3PCR技技术简术简介介1PCR常常见问题见问题、原因分析及、原因分析及对对策策2PCR技术的简介技术的简介什么是PCR?PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术PCR技术的简介技术的简介PCR技术的发展历史1985 关于PCR 的文章首次由美国科学Kary Mullis等 人在 Science杂志上发表 1989 Science杂志报道了耐

2、热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到 来。12月Science杂志将PCR和它所使用的聚 合酶命名为第一个“年度分子”。1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR技术的简介技术的简介PCR原理的简介 PCR的扩增过程模拟体内DNA的天然复制过程，利用一种从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶，及碱基互补配对原则。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的多次循环,最终使基因扩增形成特异区段的DNA带，实现DNA在体外的特

3、异性扩增。PCR技术的简介技术的简介1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2535轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的常见问题、原因分析及对策的常见问题、原因分析及对策PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性PCR的常见问题、原因分析及对策的常见问题、原因分析及对策PCR常见问题之一：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无；正对照有条带，而样品则无；1.1. 模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2. BufferBuffer对样品不合适对样品

4、不合适3.3. 引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4.4. 反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策1.1. 纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或或加大模板的用量加大模板的用量2.2. 更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3. 重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4.4. 降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间PCR的常见问题、原因分析及对策的常见问题、原因分析及对策PCR常见

5、问题之二：非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。性扩增带与非特异性扩增带。PCR的常见问题、原因分析及对策的常见问题、原因分析及对策非特异性扩增1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度

6、适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 PCR的常见问题、原因分析及对策的常见问题、原因分析及对策PCR常见问题之三：拖尾 现象：产物在凝胶上呈现象：产物在凝胶上呈Smear状态。状态。 M 1 2PCR的常见问题、原因分析及对策的常见问题、原因分析及对策拖尾1.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏

7、高6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的和镁离子的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数PCR的常见问题、原因分析及对策的常见问题、原因分析及对策PCR常见问题之四：假阳性（筛选转基（筛选转基因、检测基因表达情况因、检测基因表达情况)现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交叉污染原因：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪

8、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。一次性使用。3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略四种策略：巢式巢式PCR（Nest-PCR）递减递减PCR（Touch Down PCR）热启动热启动PCR（HotStart PCR）使用使用PCR增强剂增强剂提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略

9、策略之一：巢式巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如（如5 RACE）的特异性。）的特异性。 提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略策略之二：递减递减PCR（TouchDown PCR）递减递减PCR通过在通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循

10、环设在比估算的条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到直到退火温度低于退火温度低于Tm 5。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。随后的循环中继续扩增占据优势。递减递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析。指纹分析。提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略策略之三：热启动热启动PCR （HotStart PCR）热启

11、动主要是通过抑制一种基本成分延迟热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到合成，直到PCR 仪达到变性温度。仪达到变性温度。现在有很多公司都有现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用。于高通量应用。热启动热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。特异性最重要的方法之一。提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略策略之四：使用使用PCR增强剂增强剂甲酰胺，甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。的增强剂。其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结聚合酶延伸通过二级结构区。构区。 增强剂浓度要适当增强剂浓度要适当 。