WI-03-27无菌实验检验方法.doc

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1、恩施金凰新材料有限公司文件编号WI-03-27版 号A.0无菌试验检验方法页 次1/5生效日期2020/01/021目的制订无菌试验检验方法，对从事测试的工作人员进行培训指导，规范检验方法及操作。2适用范围本方法适用于一次性使用无菌医疗器械灭菌后灭菌效果的检测。 3职责质检部对本检验方法实施负责。4. 内容4.1 无菌操作规则4.1.1 无菌室的灭菌：4.1.1.1 定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用纯化水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用5%来苏尔或者0.1%新洁尔灭擦拭。 4.1.1.2 生化培养箱灭菌：先用0.1%新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭，再用紫外灯照射。4.1.1.3 实验前灭

2、菌：打开紫外灯、空气净化器系统各2030分钟4.1.1.4 实验后灭菌：用75酒精（0.1%新洁尔灭）擦拭超净台、边台、显微镜载物台。 4.1.2 实验人员的无菌准备：4.1.2.1 肥皂等洗手4.1.2.2 穿好无菌工作服、戴好隔离帽、口罩、放好拖鞋 4.1.2.3 用75酒精棉球擦净双手4.1.3 无菌操作 4.1.3.1 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基的瓶子等均要用75酒精擦拭瓶子的外表面 4.1.3.2 靠近酒精灯火焰操作4.1.3.3 器皿使用前必须过火灭菌 4.1.3.4 继续使用的器皿（如瓶盖、滴管等）要放在高处，使用时仍要过火。4.1.4 实验前准备4.1.4.1培

3、养基的制备：培养基使用按药典的处方生产的符合规定的脱水培养基，并按照该培养基瓶签上的“用法”制备及灭菌。4.1.4.2 制备好的培养基，应保存在225、避光的环境或置冰箱冷藏储存；培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年恩施金凰新材料有限公司文件编号WI-03-27版 号A.0无菌试验检验方法页 次2/5生效日期2020/01/02内使用。4.1.4.3 器具灭菌：与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸气灭菌器内12130min，或置电热干燥箱内1602h。4.1.4.4 无菌室要求：无菌室应符合洁净度10 000级，无菌操作台（超净工作台）应

4、符合洁净度100级单向流空气区域要求。4.1.4.5 无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取直径约90mm培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20mL，在3035培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好，置3035培养48h后取出检查，3只双碟上生长的菌落数平均不得超过1个。4.1.4.6 无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时打开平皿盖，至试验结束盖好照上法培养，应符合上述要求。4.2 生物指示剂无菌检测4.2.1 生物指示剂（枯草芽胞杆菌）：按规定的方法放置，随产品同时进行环氧乙烷灭

5、菌后，进行无菌试验，监测产品的批灭菌效果。4.2.2 实验原理：将芽胞菌片与需灭菌的物品一起灭菌，然后按无菌操作要求将菌片放置到适合于枯草杆菌生长的培养基中，作为测试菌片并在合适的温度下培养；另取一芽胞菌片不经灭菌按上述方法置于培养基中，作为阳性对照。按产品使用说明书提供的培养时间培养后，根据培养结果对灭菌效果进行判断。4.2.3 实验器材及培养基4.2.3.1 仪器：净化工作台、生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱4.2.3.2 器具：酒精灯、带透气塞试管（规格15015mm）4.2.4 操作步骤： 取5支枯草芽孢杆菌分散于环氧乙烷灭菌柜，待灭菌完后，捏破后放到培养箱培养恩施金凰新材料有限

6、公司文件编号WI-03-27版 号A.0无菌试验检验方法页 次3/5生效日期2020/01/024.2.4.3 阳性对照管的制备：另取一支同批号的未灭菌的生物指示剂捏破后直接放到培养箱培养，作为阳性对照液。4.2.5 培养：将测试管和阳性对照管置于37下培养48小时，然后观察。4.2.6 结果判断：4.2.6.1 当阳性对照管显示浑浊并确定有菌生长时，可根据观察的结果进行判断。4.2.6.2当测试管澄清或虽显浑浊，但经证明并非有测试菌生长，均应判芽胞菌片无存活的芽胞，即本次EO灭菌效果符合规定。4.2.6.3 当任一测试管出现混浊，并确认有菌生长，均应判芽胞菌片有存活的芽胞，即本次EO灭菌效果

7、不符合规定。4.2.8 生物指示剂的保存和注意事项 4.2.8.1 菌片应储存在温度：425、 相对湿度：3070% ，远离灭菌剂，避免日光或紫外线照射处，切不可冷冻。4.2.8.2 生物指示剂必须在有效期内使用；使用过的菌片和培养基应在灭菌后废弃。4.2.8.3检验员接到已经灭过菌的布点菌片后，应尽快将该菌片按无菌操作方法转移到装有适宜培养基的试管进行培养、观察并记录结果。4.3 产品无菌检测4.3.1 器具及试剂4.3.1.1 仪器：超净工作台 光学显微镜 恒温培养箱 生化培养箱 压力蒸汽灭菌器4.3.1.2 用具：试管、注射器、量筒、三角烧瓶、锥形瓶、移液管、灭菌刻度吸管（1ml）、灭菌

8、平皿（9cm）、酒精灯、75乙醇棉、灭菌的剪刀和镊子、精密PH试纸、灭菌袋或牛皮纸 4.3.1.3 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基4.3.1.4 培养基、稀释液、冲洗液的制备方法4.3.1.4.1 无菌生理盐水：按9.0g氯化钠加蒸馏水溶解使成1000ml的比例溶解、分装，121高压灭菌15min。恩施金凰新材料有限公司文件编号WI-03-27版 号A.0无菌试验检验方法页 次4/5生效日期2020/01/024.3.1.4.2 硫乙醇酸盐流体培养基：按瓶签上的“用法”称取培养基，加热溶解，调PH值，使灭菌后为7.10.2后分装，加透气塞密封，121高压灭菌15min。4.3.1

9、.4.3改良马丁培养基：按瓶签上的“用法”称取培养基，加热溶解，调PH值，使灭菌后为6.40.2后分装，加透气塞密封，115高压灭菌30min。4.3.2 阳性对照：4.3.2.1 阳性对照菌：金黄色葡萄球菌4.3.2.2 阳性对照试验的菌液制备：a. 接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基上，3035培养1824小时；b. 上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50100cfu（菌落形成单位）的菌悬液；4.3.2.3 阳性对照试验的加菌量及供试品用量：加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。4.3.2.4 阳性对照管培养

10、4872小时应生长良好。4.3.3 检验步骤4.3.3.1 供试品数量：当生产同一批次小于200个时，同一批号至少7个单位供试品,其中3个做细菌，3个做霉菌，1个做细菌阳性对照品（金黄色葡萄球菌）。当同一批次大于200个时，同一批号至少21个单位供试品,其中10个做细菌，10个做霉菌，1个做细菌阳性对照品（金黄色葡萄球菌）。4.3.3.2 供试液制备及接种4.3.3.2.1 制备及接种优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使介质充分洗提供试品的浸提表面。供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2h内使用。4.3.3.2.3

11、直接接种法：即每支供试品按规定量分别接种到各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合：接种的供试品体积不得大于培养基体积的10，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。恩施金凰新材料有限公司文件编号WI-03-27版 号A.0无菌试验检验方法页 次5/5生效日期2020/01/024.3.3.3 培养及观察：4.3.3.3.1 上述含培养基的容器按规定的温度培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。4.3.3.3.2 如在加入供试品后、或在培养过程中培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观

12、上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长;或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。4.3.3.4 结果判断：4.3.3.4.1 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：1) 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；2) 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；3）阴性对照管有菌生长；4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确认是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。4.3.3.4.2 试验经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。4.3.3.4.3 如细菌及霉菌培养管中任何一管显混浊并确证为有菌生长，应重新取样依法复试两次。除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。编制：日期：审批：日期：批准：日期：