浙江大学生物化学丙实验报告(共11页).doc

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1、精选优质文档-倾情为你奉上专业： 农业资源与环境 姓名： 李佳怡 学号： 日期： 2015.6.9 地点： 生物实验中心310 装 订 线实验报告课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：_实验名称： 质粒DNA的微量制备及电泳检测 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习并掌握质粒DNA的提取原理和方法；2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；3、学习并掌

2、握对电泳检测结果的初步分析。二、实验内容和原理1、实验内容质粒DNA的提取DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定2、 实验原理质粒：质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小在1-200kb之间，具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。从细菌细胞中抽提质粒DNA的步骤：a细菌培养使质粒大量扩增；b收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ；c进一步除

3、去蛋白、脂类、RNA等杂质，分离和纯化质粒DNA。碱裂解法来分离纯化质粒DNA：在EDTA存在下，经过SDS处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH），使核质体DNA与质粒DNA的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA与质粒DNA又存在复性的差异，质粒DNA很快得以复性，而细菌核质体DNA分子难以复性，核质体DNA会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀，这是由于当加入无水乙

4、醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定: DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中（pH8.3缓冲液）带负电荷，它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，并能区分出不同的区带。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有：DNA分子质量的影响：

5、双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大，迁移率越小。 DNA构型的影响：超螺旋DNA线状DNA开环DNA。胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为12；电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm）（电场强度） 。而对于大片段电泳，甚至用0.51.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。EB的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有

6、利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。碱基组成与电泳温度的影响: 一般影响不大。质粒DNA不同构型在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速度：环形双链DNA分子有三种构型。 第一种是共价闭合环状DNA，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型，迁移速度最快； 第二种是开环DNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口两条核苷酸链中只有一条保持

7、完整的环形结构，即OC构型，迁移速度最慢； 第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状,通称L构型。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。实验有关试剂的作用： 溶液：葡萄糖：增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。TrisHCl：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。溶液：SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。溶液：中和溶液的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕，并使质粒DNA

8、复性。高盐的3mol/L NaAc/KAc有利于变性的大分子核质体DNA以及K/Na离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。乙醇或异丙醇可以沉淀核酸，当加入乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。70的乙醇用于洗涤核酸沉淀，其目的是去除盐及挥发性较小的异丙醇。RNaseA用于消化质粒DN

9、A溶液中的残余RNA。三、 实验材料与试剂 1、实验材料 含重组质粒菌种 2、实验试剂 LB液体培养基 氨苄青霉素：100mg/ml 溶液 溶液 溶液 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液（pH 8.0） RNaseA（1mg/ml） 0.5TBE缓冲液（pH8.0） 琼脂糖 6加样缓冲液 1mg/ml溴化乙锭（EB）四、 实验器材与仪器1、恒温培养箱 37； 2、恒温摇床 37； 3、高压灭菌锅； 4、超净工作台； 5、台式离心机； 6、振荡器；7、微量移液枪(10，20，200，1000ul)； 8、枪头（10，20，1000ul）及枪头盒；9、离心管 1.

10、5ml及离心管架； 10、制冰机； 11、冰箱； 12、干式恒温器 37、50 ； 13、微波炉； 14、电泳仪及；15、电泳槽； 16、紫外检测仪。五、实验操作方法和步骤1、收集细菌,碱裂解液提取质粒DNA，纯化质粒DNA去除核DNA，粗提取质粒DNA离心：取1.2ml的过夜培养菌液加入1.5ml离心管中，8000r/min离心1min；弃上清液， 将管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。冰浴：将菌体沉淀加100ul溶液，振荡悬浮菌体，冰浴放置510min。再离心：加200ul溶液，盖紧管盖，快速温和颠倒离心管数次，确保离心管内溶液混匀 使之变清，冰浴10min。加150ul溶液，盖紧管口，颠

11、倒数次使之混匀，冰浴 放置5min。（说明：以上步骤目的）去除可溶性杂蛋白等杂质，纯化质粒DNA离心：12000r/min离心10min，将上清液转至另一干净离心管，加入等体积的酚：氯仿： 异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000r/min离心 10min 。冰浴：上清液移入另一干净离心管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀后置-20冰箱中20min。离心：12000r/min离心10min，弃上清液，将溶液管口倒置吸水纸上，使液体尽可能流尽。去除核RNA加样：加入1ml 70乙醇洗沉淀一次（动作要轻），弃70乙醇溶液，将管口倒置于吸水 纸上，使液体尽可能流尽，自然干燥或50干燥。保存：将沉淀

12、溶于50ul TE缓冲液（pH8.0，含20mg/L RNaseA）中，置37恒温器中保温 30min后，取质粒DNA样液做琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余纯化的质粒DNA样品置于 -20保存备用。2、DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定加样：取5ul纯化的质粒DNA样品，与1ul 6电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心 加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过 样品槽容量。（注：a勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡；b上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样 品槽底部凝胶刺穿；c每加完一个样品要换枪头以防互相污染。）电泳：加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压

13、电泳。当溴酚蓝 条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需3060min）。观察和拍照：取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带， 再用成像仪进行拍照，以便于分析。注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察。六、 实验数据记录和处理1、样品离心后：上层淡黄色，下层有乳黄色沉淀；2、加入溶液后：沉淀溶解，溶液呈淡黄色；3、加入溶液后：溶液无色澄清；4、冰浴后：部分凝固，呈现无色；5、加入溶液后：有白色絮状沉淀出现；6、离心后：溶液分层，沉淀白色，有部分粉末悬浮；7、加 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）后：分层，下层颜色土黄色，上层淡黄

14、色；8、离心后：分层，上层无色透明，下层淡黄色，中层杂蛋白油状。七、实验结果与分析电泳图谱：1、 实验结果：第一条带对应的DNA为超螺旋构型DNA，条带最亮，表明此结构的DNA含量最高，同时其迁移距离最远，在同样时间内，超螺旋构型DNA迁移速度最快，结果正常。第二条带对应的DNA为线状DNA，在三条带中颜色最浅，含量最少。第三条带对应的DNA，为开环DNA，迁移速度最慢，含量较线状DNA微多一些。点样孔处有较多DNA残留，表明加样时有较多溢出，操作不够规范，仍需改进。在第一条带之前无其它可辨的条带，可推测无RNA残留。2、 结果分析：根据实验结果得出如下分析：在加样时，未控制好位置和高度，导致

15、残留在点样孔中的样品较多，因此也影响了各个条带中的样品量，若在加样时操作规范，则可增大条带中DNA的量。各个条带之间距离较大，表明超螺旋构型DNA、线状DNA、开环DNA三种不同类型的DNA之间分离较好，且超螺旋型DNA亮度最亮，表明其含量最多。但仍存在较多开环和线状DNA含量也较多，表明提取到的DNA杂质较多，原因可能为没有在洗涤沉淀时进行充分洗涤，只是稍微放置一会后就将乙醇倒掉了，应多放置一段时间，并微微摇动，以除去杂质。由于在第一条带之上不再有其它可辨的条带，可推测无RNA残留。说明DNA纯度高，提取过程对RNA的去除完全。八、讨论、心得思考题：1、在提取质粒DNA的过程中， EDTA、

16、 SDS、 NaOH、乙酸钾、酚-氯仿-异戊醇等试剂的作用是什么？ EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。 乙酸钾：质粒DNA复性。 酚-氯仿-异戊醇：酚：一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。氯仿：有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡（泡沫）。 其余试剂见实验原理部分。2、在质粒DNA的提取过程中，应注意哪些操作，为什么？（1）各步骤中的混匀过

17、程要温和，因为质粒DNA是环状生物大分子，若是过于剧烈，极易收集到破碎、断裂的片段而不是完整的超螺旋DNA；（2）各步骤中的试剂的量要适当，过量和不足都会影响实验结果。（3） 提取过程中应尽量保持较低温度。 （4） 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。3、琼脂糖凝胶电泳操作应注意哪些环节？ （1）倒胶时把握好胶的温度，不要高于60C，否则温度太高会使制胶板变形。（2）胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄坏点样孔。（3）配胶和灌电泳槽需使用同一缓冲液。pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA片段的泳动。（4）加样时需将枪头深入加样孔内再吹出样品，

18、以免样品从凝胶表面扩散；加样时枪头不要刺穿或碰坏凝胶孔壁，否则将导致样品将从凝胶底部扩散或DNA带型不整齐。此外点样孔内不能有气泡。（5）样品应加在阴极端，没加完一个样品要更换枪头，防止相互污染。（6）观察时在透射仪的样品台上铺一张保鲜膜，赶去气泡。（7）要选择合适的电压、pH等条件。讨论心得：1、 质粒在正常情况下以超螺旋构型存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。2、 DNA泳动速率受到多方面因素的影响。3、 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。4、 用无水乙醇沉淀DNA：乙醇可以任意比和水相溶，乙醇与核酸不会起化学反应，不会破

19、坏DNA。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。本次实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混，其含量约为67%，因此可以考虑用95%乙醇，但是DNA回收率可能会下降。5、 提取过程中应尽量保持较低温度。 6、 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。7、 要尽可能充分利用提取物，可增加产率；但是在不同情况和实验要求下应在产率和质量之间进行必要地调节。8、 对于实验步骤（二）中第5步的絮状沉淀不需要摇碎，摇碎沉淀一方面容易造成剧烈震荡，破坏DNA结构，另一方面破碎的沉淀可能会降低提取物的质量。9、 观察时要注意安全

20、，防止紫外线直射眼睛。10、 实验过程应保持一定的连续性，不应当做做停停，以减少外界条件的影响。附：琼脂糖核酸电泳实验操作流程 1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般2030 ml）；3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4.室温下3045分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在DNA样品中加入10体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60100V电压，电泳2040min即可；8. 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。专心-专注-专业