蛋白质纯化个人总结.doc

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1、蛋白质纯化个人总结离子交换分离纯化蛋白原理总结离子交换分离纯化蛋白原理及应用离子交换剂基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶（HPLC）等离子交换树脂一般只适合分离小分子物质如氨基酸等不适合分离蛋白质等大分子物质一方面是因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部另一方面因为交联聚苯乙烯骨架疏水性很强用于蛋白质分离时会出现疏水性的不可逆吸附。此外离子交换树脂的机械强度较差而且树脂的体积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。根据交换基团的电荷性质进行分类：阳离子交换树脂：强酸型含磺酸基团(R-SO3H)中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)弱酸型含酚基、羧基阴离子交换树脂：强碱含

2、季胺基团-N+(CH3)3弱碱含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。弱酸型只能在碱性pH范围内使用弱碱型只能在酸性pH范围内使用离子交换纤维素的种类很多可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。由于这些材料是纤维状的大部分活性基团分布在表面所以适合于分离蛋白质等生物大分子。阴离子交换纤维素DEAE-纤维素,具二乙胺乙基阳离子交换纤维素CM-纤维素,具有羧甲基分别是应用得最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素。另外根据纤维素颗粒的物理结构不同可分为“纤维型”和“微晶型”两大类。“微晶型”因颗粒细、比重大能制成紧密的柱交换容量大分辨率高。离

3、子交换凝胶：离子交换葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶具有许多优点分离大分子物质不会引起被分离物质的变性戒失活非特异性吸附很低；交换容量大(为离子交换纤维素的3-4倍)；容易制成微球型因此装柱和层析时的流速都较易控制。它的缺点是随着洗脱液的离子强度和pH的变化床体积变化大明显影响流速;另外,由于它的凝胶性质,有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。如：葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose）平衡缓冲液：它的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合。增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的

4、结合力洗脱缓冲液：在离子交换层析中一般常用梯度洗脱通常有改变离子强度和改变pH两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH的洗脱对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。强酸性阳离子换剂H+的结合力比对Na+的小；H型SPSepharoseFFNacl、NaOH、NH4OH、NH4Cl洗脱NAOH或HCLH+或Na+洗脱强碱性阴离子交换剂对OH-的结合力比对C1-的小得多；OH型弱碱性阴离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大

5、。Cl型DEAE-纤维素Nacl、NaOH、乙酸铵（NH4Ac）、磷酸根（PO3-）洗脱Tris-Hcl、磷酸盐缓冲液平衡。阴离子交换剂碱性阳离子交换剂碱性CM纤维素碱性缓冲液酸性缓冲液酸性蛋白碱性蛋白蛋白pIpH时pIpH时带负电带正电磷酸缓冲液平衡弱酸性阳离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大；Na型CM-纤维素DEAE-纤维阴离子交换剂纯化分离酸性蛋白碱性缓冲液阳离子交换剂纯化分离碱性蛋白酸性缓冲液碱性越强就越容易被阳离子交换剂吸附蛋白在pH58稳定时则应选择阴离子交换剂；蛋白在pH5以下稳定时则可选择阳离子交换剂。阴离子交换剂pH8.6以下分离中性或酸性物质。阳离子交换剂一般pH4条

6、件下使用DEAE-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH为79然后提高盐浓度或降低pH使之洗脱。CM纤维素常选在pH4.56.0左右吸附蛋白质然后提高pH或盐浓度进行洗脱。例：用离子交换那首先就要考虑是要阳离子还是阴离子还有就是你的目的物的PH值蛋白质是pI=6.27阴离子交换用pH8.0-9.0的缓冲液首先利用缓冲液PH值把目的蛋白给结合到柱子上然后用合适的盐离子洗脱下来。阴离子交换柱：上样缓冲液20mMTris-HCl用00.5MNaCl梯度洗脱流速约2ml/min。注意：首先是蛋白的等电点是多少选择pH值挂柱时pH尽量不要超过pI值的2个点。Nacl的浓度可以设梯度平衡时用0.1mol之后可以选

7、择0.30.61.2mol的浓度一般0.6或1.2就可以洗脱下目的峰。然后蛋白上柱变性了是洗不下来的只能用1molNaOH或8mol脲洗再生柱子还有些脂质洗不下来需要用30%异丙醇洗柱再生。蛋白质纯化蛋白质纯化1蛋白纯化的一般原则每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。2程序分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步.3主要方法（1）根据分子大小不同的分离方法（2）利用溶解度差别分离（3）根据电荷不同的分离方法主要包括电泳和离子交换层析分离（4）蛋白质的选择吸附分离（5）根据配

8、体特性的分离亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质）(6)低温有机溶剂沉淀法4注意事项蛋白质组学质谱问题个人总结1.色谱柱中为什么极性大(盐)的组分要用极性较大的溶剂洗脱吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时由于不同化合物吸附能力不同往下洗脱的速度也不同于是形成了不同层次即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带再用溶剂洗脱时已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干挤出后按色带分割开再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。常用

9、的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般要经过纯化和活性处理颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言粒度愈小表面积愈大吸附能力就愈高但颗粒愈小时溶剂的流速就太慢因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种本实验选择中性氧化铝。化合物的吸附性与它们的极性成正比化合物分子中含有极性较大的基团时吸附性也较强。对氧化铝的吸附性递减：酸和碱醇、胺、硫醇酯、醛、酮芳香族化合物卤代物、醚烯饱和烃。先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中选用的溶剂极性要低体积要小。如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小则可加入少量极性较大的溶剂使溶液体积不致太大。色层的展开首先使用极性较小的溶

10、剂使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来.2.反相色谱是非极性固定相和极性流动相用于分离非极性或者弱极性物质。我想请教的是如果流动相极性偏大是不是分离效果不好？还有就是如果分离度不好加大水的比例延长保留时间会不会影响到分离效果？对于液相色谱分离影响因素多有两点因素最影响分离第一是物质与流动相的极性第二个叫洗脱能力:出峰快与慢以及分离效果用极性来理解出峰顺序反相色谱一般使用强度因子来表示一般极性参数大的强度因子就小但甲醇与乙腈比较特殊极性参数甲醇与乙腈分别为5.1与5.8强度因子却是甲醇3.0乙腈3.2。所以说象你上面问的“如果流动相极

11、性偏大是不是分离效果不好？还有就是如果分离度不好加大水的比例延长保留时间会不会影响到分离效果？”可以这样理解流动相洗脱能力越强分离越不好。而对于反相色谱来说只有两相一相是有机相而另一相是水相。有机相是强洗脱剂水是弱洗脱剂。当然有机相中的洗脱能力也是有差别的按THFACNMEOH顺序。而不要用极性去理解那样太复杂了。有机相比例越大洗脱能力越强水相比例越大洗脱能力越弱但越容易分离。3.在反相液相色谱中固定相的极性小于流动相洗脱顺序取决于溶质分子的疏水性疏水性强的保留时间长！4.分析色谱图打开泵和检测器快跑排除气泡设置既定流速稳定一段时间让基线跑平用液相针吸取称量融配脱气后的对照（含量已标定）打开定

12、量环将液相针里的液体匀速注入定量环中拔出针头立刻关闭六通阀一般随六通阀关闭电脑自动采样等主峰跑完整后记录其峰面积一般跑两个对照每个对照跑两针共四针。然后开始注称好溶配脱气后的样以对照主峰的保留时间来判断样品中目标峰的位置外标法以峰面积计算供试品中某物质的含量。_=S样_K/m样（1-水分）_对照品含量%_100_:供试品的含量(%);S样:供试品的主峰面积;K:单位面积对照品的质量m样(1-水分):称取供试品折干后的质量(mg);_对:对照品的含量(%)5.什么是共沉淀？共沉淀(coprecipitation)一种沉淀从溶液中析出时引起某些可溶性物质一起沉淀的现象。例如用氯化钡沉淀硫酸钡时若溶

13、液中有K+、Fe3+存在在沉淀条件下本来是可溶性的硫酸钾和硫酸铁也会有一小部分被硫酸钡沉淀夹带下来作为杂质混在主沉淀中。2产生共沉淀的原因有：表面吸附由于沉淀表面的离子电荷未达到平衡它们的残余电荷吸引了溶液中带相反电荷的离子。这种吸附是有选择性的：首先吸附晶格离子；其次凡与晶格离子生成的盐类溶解度越小的离子就越容易被吸附；离子的价数愈高、浓度愈大则愈容易被吸附。吸附是一放热过程因此溶液温度升高可减少吸附。包藏在沉淀过程中如果沉淀剂较浓又加入过快则沉淀颗粒表面吸附的杂质离子来不及被主沉淀的晶格离子取代就被后来沉积上来的离子所覆盖于是杂质离子就有可能陷入沉淀的内部这种现象称为包藏又叫吸留。由包藏引

14、起的共沉淀也遵循表面吸附规律。例如在过量氯化钡存在下沉淀硫酸钡时,沉淀表面首先吸附构晶离子Ba2+；为了保持电中性表面上的Ba2+又吸引Cl-；如果晶体成长很慢溶液中的硫酸钡将置换出大部分Cl-；如果晶体成长很快,则硫酸钡来不及交换Cl-,就引起较大量的氯化钡的包藏共沉淀。因为硝酸钡比氯化钡的溶解度小所以钡的硝酸盐比氯化物更易被包藏。生成混晶如果晶形沉淀晶格中的阴、阳离子被具有相同电荷的、离子半径相近的其他离子所取代就形成混晶。例如,当大量Ba2+和痕量Ra2+共存时硫酸钡就可和硫酸镭形成混晶同时析出这是由于二者有相同的晶格结构,Ra2+和Ba2+的离子大小相近的缘故。共沉淀现象是玷污沉淀的主

15、要因素要通过沉淀反应在溶液中获得绝对纯的沉淀是不可能的。在重量分析中总是设法减少共沉淀的影响。洗涤和陈化是经常采取的措施它们虽然对减少混晶共沉淀无能为力却可以有效地减少表面吸附和包藏引入的杂质。改变杂质离子存在形式降低沉淀速度或采用均相沉淀都是经常采取的措施如这些方法不能奏效还可采取再沉淀的方法。4共沉淀分离法共沉淀分离法是富集痕量组分的有效方法之一是利用溶液中主沉淀物（称为载体）析出时将共存的某些微量组分载带下来而得到分离的方法。例如,在痕量Ra2+存在下将硫酸钡沉淀时,几乎可载带下来所有的Ra2+；当氯化银沉淀时可将溶液中极微量的金收集起来予以富集。6.免疫共沉淀（Co-Immunopre

16、cipitation）可以：（1）测定两种目标蛋白质是否在体内结合；（2）确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质_的抗体免疫沉淀_那么与_在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上使之与含有抗原的溶液及

17、抗体反应后beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。7.重量分析（gravimetricanalysis）化学分析中的一种定量测定方法指以质量为测量值的分析方法。将被测组分与其他分离称重计算含量。精确到0.1-0.2%对低含量组分测定误差较大尽量避免用又称重量法。gravimetricanalysis沉淀法、气化法、电解法例如欲测定一种水溶液试样中的某离子含量可在适当条件下将其中欲测的离子转变为溶解度极小的物质而定量析出再经过滤、洗涤、干燥或灼烧成为有一定组成的物质冷至室温后称重即可定量地

18、测定该离子的含量。8.表面吸附物理吸附和化学吸附通过分子间引力（即范德华力）吸附称为物理吸附；化学作用生成化学键为化学吸附。离子交换实际上也是一种吸附。吸附过程是非均相过程一相为流体混合物一相为固体吸附剂。气体分子从气相吸附到固体表面其分子的自由能会降低与未被吸附前相比其分子的熵也是降低的据热力学定律：G=H-TS。固体表面有吸附水中溶解及胶体物质的能力比表面积很大的活性炭等具有很高的吸附能力可用作吸附剂。吸附可分为物理吸附和化学吸附物理吸附和化学吸附并非不相容的而且随着条件的变化可以相伴发生但在一个系统中可能某一种吸附是主要的。9.翻译后修饰（Post-translationalmodifi

19、cationPTM）是指蛋白质在翻译后的化学修饰。胺基酸的翻译后修饰会附在蛋白质其他的生物化学官能团（如醋酸盐、磷酸盐、不同的脂类及碳水化合物）、改变胺基酸的化学性质或是造成结构的改变（如建立双硫键）来扩阔蛋白质的功能。再者酶可以从蛋白质的N末端移除氨基酸或从中间将肽链剪开。举例来说胰岛素是肽的激素它会在建立双硫键后被剪开两次并在链的中间移走多肽前体而形成的蛋白质包含了两条以双硫键连接的多肽链。其他修饰就像磷酸化是控制蛋白质活动机制的一部份。蛋白质活动可以是令酶活性化或钝化。翻译后修饰包括以下加入官能团的反应：乙酰化通常于蛋白质的N末端加入乙酰。烷基化加入如甲基或乙基等烷基。甲基化烷基化中常见

20、的一种在赖氨酸、精氨酸等的侧链氨基上加入甲基。生物素化用生物素附加物令保存的赖氨酸酰化。谷氨酸化在谷氨酸与导管素及其他蛋白质之间建立共价键。甘氨酸化在一个至超过40种甘氨酸与导管素的C末端建立共价键。糖化将糖基加入天冬酰胺、羟离氨酸、丝氨酸或苏氨酸形成糖蛋白。异戊二烯化加入如法呢醇及四异戊二烯等异戊二烯。硫辛酸化附着硫辛酸的功能性。磷酸泛酰巯基乙胺基化像在脂肪酸、聚酮、非核糖体肽链及白氨酸的生物合成中从乙酰辅酶A加入4'磷酸泛酰巯基乙胺基。磷酸化加入磷酸根至丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸。硫酸化将硫酸根加入至酪氨酸。硒化C末端酰胺化2加入其他蛋白质或肽编辑干扰素激活基因化与干扰素激活基

21、因15（ISG15）蛋白质建立共价键。小泛素相关修饰化与小泛素相关修饰子蛋白建立共价键。泛素化与泛素建立共价键。3改变氨基酸的化学性质编辑瓜氨化将精氨酸转为瓜氨酸。脱氨化将谷氨酰胺转为谷氨酸或将天冬酰胺转为天冬氨酸。结构改变双硫键与两个半胱氨酸的氨基酸建立共价键。分解蛋白质将蛋白质的肽键剪开。10.亲和色谱法（affinitychromatography）将相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相利用与固定相不同程度的亲和性使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用使相互作用物质之一方与不溶性担体

22、形成共价结合化合物用来作为层析用固定相将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获达到纯化的目的。可用于分离活体高分子物质、过滤性病毒及细胞。或用于对作用进行研究。11.蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即WesternBlot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实特异的相互验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。蛋白免疫印迹(WesternBlot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上然后用特异性抗体检测某特定抗原现已广泛应用于基因

23、在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳被检测物是蛋白质“探针”是抗体“显色”用标记的二抗。经过(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上固相载体以非共价键形式吸附蛋白质且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原与对应的抗体起免疫反应再与酶或同位素标记的第二抗体起反应经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。WesternBlot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光E

24、CLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。12.MultidomainproteinAproteindomainisaconservedpartofagivenproteinsequenceand(tertiary)structurethatcanevolve,function,andexistindependentlyoftherestoftheproteinchain.Eachdomainformsapactthree-dimensionalstructureandoftencanbeindependentlystableandfolded

25、.Manyproteinsconsistofseveralstructuraldomains.Onedomainmayappearinavarietyofdifferentproteins.Molecularevolutionusesdomainsasbuildingblocksandthesemayberebinedindifferentarrangementstocreateproteinswithdifferentfunctions.Domainsvaryinlengthfrombetweenabout25aminoacidsupto500aminoacidsinlength.Thesh

26、ortestdomainssuchaszincfingersarestabilizedbymetalionsordisulfidebridges.Domainsoftenformfunctionalunits,suchasthecalcium-bindingEFhanddomainofcalmodulin.Becausetheyareindependentlystable,domainscanbe“swapped”bygeicengineeringbetweenoneproteinandanothertomakechimericproteins.13.所有的质谱仪都是不能直接记录质荷比的它记录

27、的是电信号应为每一个质荷比对应的是一个DC与RF电压的比值采用母离子扫描模式时固定了Q3的DC/RFQ1的DC/RF在我们设定的范围内扫描。质谱仪在工作时它Q1和Q3的DC/RF都是记录的采用母离子扫描时在某一个时间点当检测器检测到设定的子离子时他会同时记录该时间点前dwelltime点Q1四级杆的DC/RF的然后就可以反馈给你母离子的质荷比啦！14.蛋白质组学中定量方法：同位素标记同重标记定量法相对与绝对定量spectrumcount即不同谱图之间的相对定量。15.组蛋白（histones）组蛋白（histone）是指所有真核生物的细胞核中与DNA结合存在的碱性蛋白质的总称。其分子量约100

28、0020000。含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特别多二者加起来约为所有氨基酸残基的1/4。组蛋白的甲基化修饰主要是由一类含有SET结构域的蛋白来执行的组蛋白甲基化修饰参与异染色质形成、基因印记、_染色体失活和转录调控等多种主要生理功能组蛋白的修饰作用是表观遗传学研究的一个重要领域。组蛋白与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。因氨基酸成分和分子量不同主要分成5类。常与肿瘤发生等多种人类疾病相关可以特异性地激活或者抑制基因的转录活性。研究发现组蛋白甲基转移酶的作用对象不仅仅限于组蛋白某些非组蛋白也可以被组蛋白甲基转移酶甲基化这将为探明细胞内部基因转录、信号转导、甚至个体的发育和分化机制

29、提供更广阔的空间。2组蛋白的基因非常保守。亲缘关系较远的种属中四种组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）氨基酸序列都非常相似不同生物的H1序列变化较大在某些组织中H1被特殊的组蛋白所取代。真核生物细胞核中组蛋白的含量约为每克DNA1克大部分真核生物中有5种组蛋白两栖类、鱼类和鸟类还有H5以替代或补充H1。染色质是由许多核小体组成的H2AH2BH3和H4各2个分子构成的8聚体是核小体的核心部分H1的作用是与线形DNA结合以帮助后者形成高级结构。组蛋白是已知蛋白质中最保守的例如人类和豌豆的H4氨基酸序列只有两个不同并认识到它们作为碱性物质应在核中与核酸结合一些实验室随后证明组蛋白以独特的方式构成核小

30、体的组分。3组成部分组蛋白是存在于染色体内的与DNA结合的碱性蛋白质染色体中组蛋白以外的蛋白质成分称非组蛋白。绝大部分非组蛋白呈酸性因此也称酸性蛋白质或剩余蛋白质。组蛋白对染色体的结构起重要的作用。染色体是由重复单位核小体组成。每一核小体包括一个核心8聚体（由4种核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的各两个单体组成）；长度约为200个碱基对的脱氧核糖核酸(DNA）；和一个单体组蛋白H1。长度为147碱基对的DNA盘绕于核心8聚体外面。在核心8聚体之间则由长度约为60个碱基对的DNA连接。这种DNA称为“接头”DNA。几乎所有真核细胞染色体的组蛋白均可分成5种主要的组分分别用字母或数字命名命名方

31、法也不统一如H1或称F1；H2A或称F2A2b1；H2B或称F2Bb2；H3或称F3；H4或称F2A1。有核的红细胞或个别生物体中还存在特别的组蛋白成分红细胞中为H5或F2C鲑鱼组织中为H6或T。H2A、H2B、H3、H4组成核小体的核心也称核心组蛋白。根据组蛋白的一级结构又可将它们分为3种类型：赖氨酸含量特别丰富的组蛋白（H1）；赖氨酸含量较丰富的组蛋白（H2A和H2B）；精氨酸含量丰富的组蛋白（H3和H4）4合成修饰这是组蛋白各组分微不均一性的主要原因。修饰的方式有：乙酰化。有两种一种是H1、H2A、H4组蛋白的氨基末端乙酰化形成-乙酰丝氨酸组蛋白在细胞质内合成后输入细胞核之前发生这一修饰

32、。二是在H2A、H2B、H3、H4的氨基末端区域的某些专一位置形成N6-乙酰赖氨酸。磷酸化。所有组蛋白的组分均能磷酸化在细胞分裂期间H1的13个丝氨酸可以磷酸化。而在有丝分裂时期H1有36个丝氨酸或苏氨酸发生磷酸化其他四个核心组蛋白的磷酸化可以发生在氨基末端区域的丝氨酸残基上。组蛋白的磷酸化可能会改变组蛋白与DNA的结合。甲基化。仅发现于H3的9和27位和H4的20位的赖氨酸鸭红细胞组蛋白H1和H5的组氨酸。ADP-核糖基化。组蛋白H1、H2A、H2B及H3和多聚ADP-核糖的共价结合ADP-核糖基化被认为是在真核细胞内启动复制过程的扳机。其他修饰：赖氨酸的丙酰化、丁酰化、琥珀酰化、巴豆酰化、

33、丙二酸酰等在哺乳动物基因组中组蛋白则可以有很多修饰形式.一个核小体由两个H2A两个H2B两个H3两个H4组成的八聚体和147bp缠绕在外面的DNA组成.组成核小体的组蛋白的核心部分状态大致是均一的游离在外的N-端则可以受到各种各样的修饰包括组蛋白末端的乙酰化甲基化磷酸化泛素化等等。组蛋白被甲基化的位点是赖氨酸和精氨酸.赖氨酸可以分别被一、二、三甲基化精氨酸只能被一、二甲基化.在组蛋白H3上共有5个赖氨酸位点可以被甲基化修饰.一般来说组蛋白H3K4的甲基化主要聚集在活跃转录的启动子区域。组蛋白H3K9的甲基化同基因的转录抑制及异染色质有关。通常含有H1H2AH2BH3H4等5种成分。除H1外其他

34、4种组蛋白均分别以二聚体(共八聚体）相结合形成核小体核心。DNA便缠绕在核小体的核心上。而H1则与核小体间的DNA结合。因此一般认为组蛋白作为结构支持体的作用比其基因调节作用更为重要。鸟类、两栖类等含有细胞核的红细胞中含有一种叫H5的特殊组蛋白。此外在停止增殖的细胞中还含有一种叫H1的组蛋白H1的结构与H5相类似。组蛋白可受到甲基化、乙酰化、磷酸化、聚ADP核糖酰化以及与泛醌(ubiquinone）相结合等几种类型的修饰。组蛋白的修饰与染色质结构的变化及基因活性控制的相关性等等是今后的重要研究课题。组蛋白是一种位于真核生物体细胞核中的与DNA联合在一块的碱性蛋白质它与DNA联合在一起形成染色质

35、的基本小单位即核小体DNA包裹缠绕在组蛋白中组蛋白有起到支架的作用以及调节DNA的转录以及活性等方面是未来研究的热点对遗传与基因方面的研究有重要意义。染色质中除了组蛋白之外的所有蛋白质都是非组蛋白又叫酸性蛋白质与剩余蛋白质组蛋白与其他蛋白质一样可以收到各种各样的翻译后修饰以增加其功能与多样性。1.核小体中组蛋白是动态组装和解离的不是一直在DNA上不变化的。2.组蛋白的精氨酸和赖氨酸位点可被甲基化不同位点的甲基化对基因转录的调控作用不同其中你说的H3K4me3表示H3组蛋白分子上的4号赖氨酸三甲基化H3K4me3会促进基因的转录但是其他位点的甲基化一般是抑制基因的转录。所以两者不矛盾启动子区的组

36、蛋白的修饰作用是招募转录因子而不是你单纯理解的多或者少的问题（这样看问题比较肤浅不是组蛋白多就抑制转录组蛋白少就激活转录）组蛋白甲基化在promoter区作用可以是激活转录也可以抑制转录。分子生物学你需要辩证动态的看待问题没有绝对的0和1的关系是矛盾的统一体。电感耦合高频等离子体光源装置由高频发生器、雾化器和等离子炬管三部分组成。在有气体的等离子炬管外套装一个高频感应线圈感应线圈与高频发生器连接。当高频电流通过线圈时在管的内外形成强烈的振荡磁场。一旦管内气体开始电离（如用点火器）电子和离子则受到高频磁场所加速产生碰撞电离电子和离子急剧增加此时在气体中感应产生涡流。高频感应电流产生大量的热能又促

37、进气体电离维持气体的高温从而形成等离子炬。为了使所形成的等离子炬稳定等离子气和辅助气都从切线方向引入因此高温气体形成旋转的环流。同时由于高频感应电流的趋肤效应流在圆形回路的外周流动。这样感耦高频等离子炬就必然具有环状结构。环状的结构造成一个电学屏蔽的中心通道。电学屏蔽的中心通道具有较低的气压、较低的温度、较小的阻力使试样容易进入炬焰并有利于蒸发、解离、激发、电离以至观测。试样气溶胶在高温焰心区经历较长时间加热在测光区平均停留时间长。这样的高温与长的平均停留时间使样品充分原子化有效地消除了化学的干扰。周围是加热区用热传导与辐射方式间接加热使组份的改变对ICP影响较小加之溶液进样少因此基体效应小。

38、试样不会扩散到ICP焰炬周围而形成自吸的冷蒸气层。一、ImmunoglobulinsuperfamilyHomogeneityandheterogeneityareconceptsoftenusedinthesciencesandrelatingtotheuniformityinasubstanceororganism.Amaterialorimagethatishomogeneousisuniforminpositionorcharacter(i.e.color,shape,size,height,distribution,texture,language,ine,disease,tempe

39、rature,radioactivity,architecturaldesign,etc.);ohatisheterogeneousisdistinctlynonuniforminoneofthesequalities.TOF:同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上不同质荷比的离子聚焦在不同的点上将它们分别聚焦而得到质谱图从而确定其质量。电子轰击质谱EI-MS场解吸附质谱FD-MS快原子轰击质谱FAB-MS基质辅助激光解吸附飞行时间质谱MALDI-TOFMS电子喷雾质谱ESI-MS等等能测大分子量的是基质辅助激光解吸附飞行时间质谱MALDI-TOFMS和电子喷雾质谱ESI-MS有机物质谱解析

40、步骤：确认分子离子峰（或者M+H）碎片离子峰求得相对分子质量和分子式；计算不饱和度。找出主要的离子峰（一般指相对强度较大的离子峰）并记录这些离子峰的质荷比（m/z值）和相对强度。对质谱中分子离子峰或其他碎片离子峰丢失的中型碎片的分析也有助于图谱的解析。用MS-MS找出母离子和子离子或用亚稳扫描技术找出亚稳离子把这些离子的质荷比读到小数点后一位。配合元素分析、UV、IR、NMR和样品理化性质提出试样的结构式。最后将所推定的结构式按相应化合物裂解的规律确定可能的结构式。碳12元素原子质量的1/12为一个原子质量单位。1千克=1000克1克=1000毫克1毫克=1000微克1微克=1000纳克1纳克

41、=1000皮克1皮克=1000飞克1飞克=1000阿克suitableplug合适的插头connector连接器peripheralcontroloutputconnection外设控制输出连接controloutputconnectionports控制输出连接端口cable电缆autosler自动进样器analogsignal模拟信号triggercable触发电缆Theresetbutton重置按钮Thesyringecontactserialinterface注射器接触串行接口forepump前级泵fused融合Thevacuumgauges真空计Coldcathode冷阴极Foreva

42、cuum预真空configured配置safetyrelay安全继电器Ventilating通风nebulizedgases雾化气体bottomupbottomup指的是proteins先被digestion,然后对digestion后的peptides分离纯化后作MSMS.由MSMS的片断信息从底端推导出pepetide的sequence再将这些peptide按照digestion的规律推断出protein的sequence.topdown则是先对proteins分离纯化使用MS选择特定的m/z的蛋白直接对蛋白作MS2,MS3?然后由这些碎片推断蛋白的组成。两种方法的优点在于各自分析或者表征

43、的重点不一样“bottomup”是在peptidelevel“topdown”是intactproteinlevel。“topdown”可用来研究proteinconformations,甚至proteinplexes这些都有利于研究或发现疾病的mechanism探索某些疾病的biomarker.“topdown“优点是高通量筛选简化了样品的制备过程和省略digestion过程。”bottomup”就是分辨性高可以同时分析多个蛋白。缺点是实验步骤繁琐数据分析量大直接研究clinicsle不如topdown.“topdown“对MS仪器的分辨率要求高。MALDI-TOF的PSD模式Bottom-

44、upproteomics：Bottom-upproteomicsisamonmethodtoidentifyproteinsandcharacterizetheiraminoacidsequencesandpost-translationalmodificationsbyproteolyticdigestionofproteinspriortoanalysisbymassspectrometry.Theproteinsmayfirstbepurifiedbyamethodsuchasgelelectrophoresisresultinginoneorafewproteinsineachprot

45、eolyticdigest.Alternatively,thecrudeproteinextractisdigesteddirectly,followedbyoneormoredimensionsofseparationofthepeptidesbyliquidchromatographycoupledtomassspectrometry,atechniqueknownasshotgunproteomics.Byparingthemassesoftheproteolyticpeptidesortheirtandemmassspectrawiththosepredictedfromasequen

46、cedatabaseorannotatedpeptidespectralinapeptidespectrallibrary,peptidescanbeidentifiedandmultiplepeptideidentificationsassembledintoaproteinidentification.Thereisbetterfront-endseparationofpeptidesparedwithproteinsandhighersensitivitythanthetop-downmethod.Thereislimitedproteinsequencecoveragebyidenti

47、?edpeptides,lossoflabilePTMs,andambiguityoftheoriginforredundantpeptidesequences.在GC-MS中全扫描主要用于定性选择离子扫描主要用于定量而且选择离子扫描检测限要比全扫描检测限要低。检测限：仪器的检测限反应仪器的灵敏度一般是按照噪音的三倍算的也就是说确定仪器的检测限时把某种物质配制成不同的浓度测当某一最低浓度的的峰值是噪音的三倍时此最低浓度就是该种物质在这个仪器上的检测限。灵敏度（Sensitivity）：仪器的响应量与对应的待测物浓度的比值通俗地讲就是仪器的反应能力是否灵敏。灵敏度是指仪器测量最小被测量的能力。当

48、然所测的最小量越小一般灵敏度就越高。也不是越高越好灵敏度过高测量稳定性就越差比如用精度为0.0001g的电子或者分析天平测有任何一点的风吹草动都会引起测量值变化即不稳定性。在保证测量准确性的前提下灵敏度也不易要求过高。仪器的精密；指仪器的最小分度值。如米尺的最小分度为1mm其精密度就是1mm正常情况下仪器的精度高准确度也高灵敏度也越高。仪器的精度是准确度的前提但是仪器的精度并不完全反映准确度。例一台电压表内部的附加电压变质使其实际准确度下降了但精度却不变。精度与准确度是有区别的。分辨率：假设称黄豆天平的灵敏度高黄豆可以一个一个称(可以分辨）但是你放磅秤上就不能一个个称（无法分辨）。色谱图和质谱

49、图的关系实际上我们在色谱图上点开每一点便是一张质谱图而一张色谱图实际上是很多张质谱图组成的总离子流图。当采用全扫描模式时所有的碎片离子都会体现在质谱图上色谱图即总离子流图就会有更多的离子响应值就更高但基线噪声也更大。全扫描模式下提供的碎片离子信息是相当丰富的用来定性的。选择离子扫描来讲只有部分选择离子体现在谱图上响应值就小些。响应值比全扫描小但是由于杂质的碎片离子减少基线噪声也会减小实际上选择离子扫描拥有更好的信噪比。用来定量分析。扫描速度增大采样频率变小?一次全扫描时间变短（50-550）相应的每个质量数的扫描时间变短灵敏度降低分辨率也降低为什么分辨率会降低：扫描速度增大后相邻质量数的离子被扫描的时间肯定间隔很