香菇菌种生产的方法与步骤.doc

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1、.-香菇菌种生产的方法与步骤 (一)母种生产培养基的配方选择一是马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂1623克，水1 000毫升。氢离子浓度1 00010000纳摩升(pH56)，用于分离、培养菌种。二是PDA改良培养基(甲)：马铃薯(去皮)200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾(KH2PO4)2克，硫酸镁(MgSO4)05克，维生素B110毫克，琼脂20克，水1000毫升，灭菌后氢离子浓度316310000纳摩升(pH5055)，用于培养、分离菌种。 三是PDA改良培养基(乙)：马铃薯(去皮)200克，麸皮或米糠50克，硫酸镁0.5克，维生素B110毫克，

2、琼脂20克，灭菌后氢离子浓度31633981纳摩升(pH5455)。 四是PDA改良培养基(丙)：心材木200克，细米糠(或麸皮)100克，硫酸铵1克，麦芽糖(或葡萄糖)20克，琼脂20克，水1 000毫升，灭菌后氢离子浓度316310000纳摩升(pH5.05.5)，用于分离菌种。 五是麦芽浸膏、酵母浸膏、琼脂培养基(MYD)：麦芽浸膏3克，葡萄糖10克，酵母浸膏3克，琼脂20克，蛋白胨5克，水1 000毫升(用于菌种培养)。 六是麦芽浸膏、蛋白胨培养基(MPA)：麦芽浸膏2025克，蛋白胨10克，琼脂20克，水1 000毫升(用于分离、培养、保存菌种)。 上述6个培养基配方中，马铃薯、葡萄

3、糖、琼脂(PDA)配方应用最普遍。在此着重介绍PDA培养基的配制方法与步骤： 1制备培养基的操作程序 选择优质马铃薯，去皮或挖去发芽眼，削去发青皮，切成薄片，称取200克，置于钢精锅，加水1 000毫升，煮沸后小火保持30分钟，趁热用8层纱布过滤后放人有1 000毫升刻度的量杯(或量筒)中，补充水到1 000毫升，倒回钢精锅，加琼脂继续加热，待琼脂溶化后，再加葡萄糖，再补水至1000毫升，用玻璃棒搅均匀，趁热分装试管，或装入三角瓶备用。 2分装试管 将配制好的PDA培养基，趁热(60)倒人事先准备好的量杯或玻璃漏斗，分装试管。每支试管装培养基为管长的14，培养液不可贴附管口内壁，如有沾附物必须

4、揩拭干净。 3做棉塞 取适量棉花做成较紧实的棉塞，塞入试管约2厘米左右，外留1厘米，紧贴试管内壁，松紧度以用手指提起棉塞而不脱掉为宜，光圆不起皱(如图31)，尔后将试管放入铁丝筐内。 4灭 菌 将装有培养基的试管放人灭菌锅的铁丝筐内，上面盖上牛皮纸或聚丙烯塑料薄膜，包扎好，以防棉塞受潮。加热灭菌时，排尽锅内的冷气，当温度升到121时，维持30分钟后停止加热。待指针回到零点，先打开锅盖的110开度，等到无直冲蒸气时，再打开全部锅盖，取出试管。 5在斜面上摆放试管 将取出的试管冷却到5060后，放到用木架或木条摆成一定角度的斜面上，小试管斜面长2厘米，大试管(18200)斜面长6厘米左右。待完全凝

5、固后，收取备用。 6灭菌效果检查 随机取3管斜面，放在28下进行空白培养57天后，检查斜面上有无细菌和霉菌菌落。如果发现有杂菌，说明灭菌不彻底，要重新灭菌。 (二)接种与培养 1接 种 在无菌室(接种室)或接种箱内，酒精灯火焰旁进行无菌操作。具体程序如下：左手拿菌种管和待接种的斜面试管，右手拿接种耙，在火焰上来回烧红，拔去菌种管的棉塞，将管口在火焰上烧一下，再把接种耙烧一下，迅速插入种管，稍加冷却，切取米粒大小菌丝块(一定要带培养基)，迅速放入待接种管斜面中心位置(为争取时间，在斜面接两点以上为宜)，拿出接种耙后，再把管口烘烤一下，烧一下棉塞，迅速塞好棉塞，灼烧一下接种耙。到此即完成了一个接种

6、程序，以下依此类推。 2培 养 将接种后的试管，放入培养箱或培养室进行恒温培养(251)，或利用适宜的自然气温培养。要保证培养室空气新鲜，环境干净，无光或弱光。为此，必须保持空气相对湿度70左右，在试管上盖上纱布，或盖上薄棉毯，拉上窗帘，形成无光培养。因试管斜面长短不同，一般需经814天培养，才能长满试管斜面。 (三)母种质量检查及提高纯度对策 1斜面优质菌丝形态 在马铃薯、葡萄糖、琼脂(PDA)培养基斜面上，菌丝生长洁白，呈棉绒状，密度一致，前沿菌丝(先端)整齐，粗壮。有的棉绒状菌丝发达，如苏香1号，Cr-02；有的棉绒状菌丝不发达，如271A，271B，早生一号。后者比前者菌丝生长快，但菌

7、龄较长。 2斜面菌丝不纯现象 在斜面上菌丝灰白，棉毛菌丝不平坦不整齐，前沿菌丝不齐、有缺口，这说明有杂菌污染。如斜面上有异色，可能是镰刀菌污染。如斜面上特别是菌丝边缘出现粘稠状物即蜡状、油状，可能是细菌污染。如斜面上呈黄、绿、黑等颜色，则可肯定是霉菌污染。若斜面产生色素，也表明有杂菌污染。将斜面对着光看背面，如有小黑点遮光，说明杂菌菌落被香菇菌丝覆盖了。 3提高香菇母种纯度的措施 必须使培养基彻底灭菌，严格无菌操作，保持培养环境干燥、清洁、恒温、无光、空气流畅，从而保证菌丝健壮生长。如发现母种有异常现象，应予剔除。 二、原种生产与质量标准及保证对策 原种和栽培种的培养料配方制作技术基本相同，只

8、是装料容器大小不同。因此，本节只介绍原种生产技术，栽培种生产技术在相关章节中介绍。 (一)培养料配方选择 共有7个配方可供选择，前3个为常用配方，后4个为参考配方。木屑78，麸皮(或米糠)20，蔗糖1，石膏1。木屑63，棉籽壳20，麸皮15，蔗糖1，石膏1。木屑60，蔗渣18 %，麸皮20，蔗糖1，石膏1。稻草(麦草)58 %，砻糠30，木屑10%，糖1，石膏1。发酵松树、杉树木屑50，木屑28，麸皮20，糖1，石膏1。棉籽壳40，木屑40，麸皮18 %，糖1，石膏1。花生壳80，杂木屑19，石膏1。 上述7个配方都要求含水量在60左右，氢离子浓度(pH值)随自然情况。配方中各原料一般在3个月

9、前备好。 (二)培养料配制的方法和步骤 1时间安排 春、秋、冬季节皆可，晴天或阴天配料装瓶最为理想。夏天宜在每天早、晚配料装瓶，应在4小时内装好瓶。 2生产组织 使用一台机器，由6人操作。其中1人向斗内铲料，1人装瓶，1人洗瓶，2人做棉塞，1人运输。 3配料前的木屑处理首先过筛(23目)，用竹筛或铁筛皆可，筛除掉有棱角的木块、木条、木片等硬物。然后，按照生产计划和配方成分(百分率)，称好主料、辅料和添加剂。接着，将各种原料混合拌匀，有机器用机器拌，无机器用人工来回拌34次。最后，再加入适量的水，继续用机器拌3分钟或用人工拌34次。对出现的团块一定要拍散，或用铁筛过筛。在配料过程中，需灵活掌握以

10、下3点： (1)灵活掌握含水量：对干料、细料、质松料，加水宜多一些；对粒硬、吸水差的料，加水宜少一些。在晴天、高温、秋千天气而水蒸发量较大时，加水宜多些；在阴雨、空气偏湿而水不易蒸发时，则加水宜少一些。在水泥场地拌料，加水可少一些；在干泥渗水场地拌料，加水宜多一些。在高海拔地区，加水宜多一些 (2)拌料要均匀：要做到主料、辅料、添加剂均匀，干湿均匀，酸碱度均匀，不结块。 (3)操作要敏捷快速：在气温28，如拌料灭菌时间过长，则料易变酸，接种后轻则发菌慢，重则不发菌，而且易使杂菌病毒发生。因此，必须根据机械化水平和劳动者的技术熟练程度，安排好每日的生产量，保证适时快速装袋(瓶)，及时灭菌。在高温

11、期间从拌料到灭菌，不能超过4小时；在低温期间从拌料到灭菌，要求不过夜。(4)搞好环境卫生：选用的原材料要无霉变，配料前要曝晒，拌料装瓶环境要清洁，尽量减少空气中的杂菌孢子率。(三)装瓶(袋) 使用机器装瓶，平均每人每日可装720多瓶。具体操作程序如下：装料至瓶颈，清洁瓶口，用小木棒或试管将料压实，并呈凹式，将瓶口内外壁洗净。 (四)做好棉塞 取一块完整而略大于掌心的棉絮，其大小厚薄正好适合瓶口的大小长短，平摊在左掌心，右手捏住棉絮边缘往内卷成圆形，尔后用右手的拇指和中指相对捏住棉絮，接着用左手的拇指和食指也相对捏住棉絮，再用右手趁势捏成棉球，塞人管口或瓶口23处。 (五)灭菌 常用的高压灭菌锅

12、分为立式或卧式两种。在高度密封的高压锅内，通入高压蒸气，达到彻底灭菌的方法，称为高压蒸气灭菌，又叫湿热灭菌。原种和栽培种的培养料，由于不易被蒸气穿透，灭菌时必须在150千帕即15千克厘米2。条件下灭菌2.02.5小时。在灭菌的全过程中，要严格操作规程，并注意掌握3点：料瓶和料袋排放密度要适当，使蒸气流畅，无死角。通蒸气前，检查安全阀是否灵活，有无故障。通蒸气后，打开排气阀，驱散锅内冷空气(自身发生蒸气的高压锅应加足水)，或关上排气阀，接通蒸气。待压力升至0.5千克厘米。时，开阀放气。待指针回到0位时，保持5分钟，再关上排气阀。等压力升到1.5千克厘米。时，灭菌2.02.5小时。然后让其自然冷却

13、，当压力指针回到0位时，打开锅盖或门的14开度，继续让热烘烤棉塞，防止骤冷。接着趁热取出料瓶(袋)，送入清洁消毒过的冷却室。 也可以用常压灭菌法，常用的是灭菌灶或灭菌箱。以低压蒸气进行灭菌的方法，称为常压蒸气灭菌法。这种灭菌法投资省，可自行建造，取材容易，成本低廉，适用于农村。缺点是灭菌时间长，能耗大。常压灭菌法的具体操作程序是：当点火发生蒸气时，打开放气阀排出冷空气，直至见到放出的直冲蒸气后，再排气5分钟，接着关上阀门，待气温升到100102时，开始计时，连续保持8小时以上。料瓶叠放，瓶颈朝内，瓶底朝外。料袋按品字形叠放，以求压力平衡。行间要留有间隙。点火前，将铁锅内加足水。在灭菌的全过程中

14、要注意铁锅内的水位，保持通水流畅，且水温较高。在灭菌的全过程中，火力应按猛攻恒温徐降的程序掌握。即开始升温火力宜猛，尽快达到100，防止升温缓慢，时间过长，引起原料变酸。当温度升到100时，要保持温度不变，不能时高时低，以免影响灭菌效果。当到达灭菌时间后，让仓(膛)内温度缓缓降低，直降至60，方可开门取物。(六)冷却接种 接种前必须使料瓶(袋)冷却到适宜温度，防止高温接种热死种菌。接种前半小时，将原种瓶、接种工具及用品放入接种箱(或接种室)，然后用5 %石炭酸液向上下周壁喷雾消毒，并开启紫外线灯照射灭菌半小时。启用久停不用的接种箱(室)，事先必须用高锰酸钾和甲醛薰蒸处理。接种时，操作人员进入接

15、种室前，先用肥皂洗手，换工作服，戴上口罩和工作帽，穿上工作鞋，手在12来苏儿液或0.25新洁尔灭液中浸泡2分钟。尔后，用5石炭酸液，对接种室上下及四壁、工作台、凳等喷雾消毒，边喷边后退到缓冲室，关上接种室的门。待5分钟后，将菌种带入室内进行接种操作。接种前1分钟，用75酒精擦手，严格无菌操作(同母种无菌操作法)，要求有序不乱，操作敏捷快速，减少室内空气流动。接种时，将种管用脱脂棉蘸上75酒精，进行种管外壁消毒。接着，拔取棉塞，用火焰烧一下管口(或瓶口)，把烧过的接种耙迅速插入种管内冷却。尔后将斜面前端1厘米长的菌丝块挖去，剩余斜面分成46段，分别取出接人原种瓶的穴位中心。一管母种可接46瓶原种

16、。 (七)接种结束后的工作 接种完成后，立即将台面收拾干净，将各种剩余物，如种管、洒落的培养基、消毒用过的棉花等均拿出室外，照前述方法进行第二轮接种前处理。 (八)培养管理 第一，对培养室必须进行清洗、消毒处理后，方可使用。 第二，将接种后的原种瓶(袋)搬人培养室，保持温度在241，调节空气湿度在70左右。垂吊黑色窗帘，进行无光培养。待菌丝吃料15后，加强通风换气，保持室内空气新鲜。一般培养4050天，菌丝即可长满种瓶(250毫升瓶装)。 第三，培养期间可能出现的异常现象：一是在原种瓶内的不同部位滋生杂菌。二是菌种块不萌发。三是菌丝不吃料。 第四，异常现象发生原因及防治对策： 一是由于棉花塞受

17、潮，易滋生粉红链孢霉菌。瓶周壁发生分散杂菌落，可能是瓶子破裂，也可能是灭菌有死角。若到处有杂菌发生，肯定是灭菌不彻底，应重新灭菌。少数原种瓶发生杂菌，应及时清除。接种块四周发生杂菌，是接种工具消毒灭菌不严或空气污染造成的。种块滋生杂菌，可能是母种块带杂菌，或接种工具烧灼灭菌不严。发现上述杂菌危害后，必须密切注视，及早清除，以防蔓延。大批发生杂菌感染，应及早重新彻底灭菌，重新接种，不可延误。 二是种块不萌发的原因很多，主要有以下几种情况：接种工具烧灼后未冷却就挖取菌丝块，菌丝被烫死；菌丝被火焰烧死；母种干涸老化，失去萌发力；消毒熏蒸过头，使菌丝受毒害；培养温度不适宜。针对上述情况，可采取如下防治

18、对策：加强计划性，培养适龄母种，不用老化母种，以提高萌发力；熏蒸消毒要适量，避免过量，防止将菌丝杀死；接种工具烧灼后，冷透后方可取种菌丝；菌丝离火焰稍远一些，以防烧死菌丝。 三是菌丝种块虽能萌发，但不吃料，其原因主要是：接种块与培养料结合不紧密；培养料含水偏少；培养料中有抑制菌物存在，使菌丝不能生长；培养室控温失灵，高温热死菌丝。针对上述情况，可采取如下防治对策：接入种块时，应将种块向料内揿一下，使其与培养料紧密结合；坚持随拌料，随装瓶，及时灭菌，防止培养料变酸；购买木屑要严格选择，不要购买有抑制菌丝生长的木屑；时常检查温控是否失灵，发现问题及时修理，以防高温烧死菌丝；配料时不要随意添加或过量

19、添加有害物质，以防菌丝生长受到抑制。 (九)原种的质量标准 1优良原种的主要标准 从外观看，菌丝浓白呈棉绒状，木屑培养料变为淡黄色，菌丝粗壮，双核有锁状联合，菌丝长满瓶后10天左右表面分泌褐色水珠，有少量菌丝扭结或有原基出现，或菌丝将培养料包成块状(结合相当牢)。这种原种应视为良种，无疑可用于生产。 2劣势原种的主要表现菌丝表面出现拮抗线，菌丝纤细，生长速度缓慢，单核无锁状联合，菌丝脱壁、萎缩、发黄、老化，这种原种不能用于生产，更不能用于转接生产种(或再生原种)。受热害后，恢复生长原种，可以用于生产。香菇菌种质量退化现象及预防 一、菌种质量检验及标准 菌种质量的优劣，直接关系到栽培的成败及香菇

20、的品质。菌种质量检查主要包括两个方面：一是菌株纯度识别；二是菌种质量优劣识别。 (一)菌种质量标准 一个好的菌种，应具备自身的质量标准，包括标名、菌丝形态、菌丝长势、菌丝纯度、特种香味等主要指标。 1标 名 相当于商品的标牌。菌种生产单位应在种管(瓶)上标明名称、编号、温型、接种日期，购买者亦应检查有无标名。 2纯 度 一是指菌株菌丝的纯度；二是指杂菌污染程度。菌株的纯度通过培养菌丝形态特征来识别。在多级(一、二级)菌种培养基中，凡是发现有其他生物体存在，都可认为是菌种不纯，这种菌种不可使用。反之，在多级菌种培养基中，只有香菇菌株生长，无其他生物体存在，则认为是高纯，可以用于生产。 3香味 当

21、打开棉塞(或其他包扎物)闻到有独特的芳香味，而无异味，应认为是优良菌种。反之，当打开棉塞闻到霉味，这是霉菌滋生感染；如有恶心味，并在培养基边缘和管壁交界处出现淡黄色或乳白色糊状物，这是细菌感染，均应淘汰。 4长势 是指菌丝形态正常，生长旺盛，而无抑制线、无吐水、无萎缩现象。优良菌丝生长形态呈绒毛状，浓密，粗壮，均匀齐整，生长速度快，分解培养料能力强，出菇快，出菇适时，出菇多，转潮快，产量高。反之，生活力差的菌株，菌丝生长缓慢，分解培养料能力弱，出菇迟，产量低。 5活力 从原种瓶(袋)中随机挖取一块菌种，感觉到有韧性，不松散，培养料呈淡黄色。将样块置于新的培养基上，在291下培养，观察菌种块四周

22、新菌丝萌发快慢。萌发快者可使用，恢复活力差者不宜采用。 (二)菌种质量检验方法 在生产中通过直接观察和出菇试验，判断菌种优劣，确定其能否使用。 1直接观察 不管是自己选育还是引进的菌株，都必须仔细观察菌株的性状，如色泽、味道、长势，活力恢复，生长速度及均匀度等，并确认有无其他生物体存在。 2显徽镜检查 选取小量菌丝制片，观察菌丝有无分枝、有无细胞横隔、有无锁状联合及其他细胞结构特征，这些均与出菇多少有关。 3菌丝生长速度测量在一般情况下，用斜面或平板培养菌株，测量菌丝生长速度，要求菌丝表面平坦，扩殖均匀，菌丝前沿整齐。4耐高温试验 菌株经斜面培养l周后，分出1组试管置于3033下培养24小时，

23、再放回适温下培养，观察菌株的生活力和适应环境变化的能力。 5吃料能力观察 将菌株接人最佳原种培养料中，适温培养1周后，观察接种块菌丝萌发和吃料的情况。这种方法也是选择培养料配方的一种手段。 6出菇试验 这是选择优良菌株最基本的方法，即菌株用于生产前，必须作出菇试验。可采用瓶(袋)栽培的方法作出菇试验，以当家菌株为对照，每个菌株栽培的瓶(袋)不少于10个，最好50个。在试验过程中，观察记载某菌株的出菇期、出菇数量、菇形大小、肉质厚薄、菌柄长短及菌盖颜色等，最后进行产量和质量分析。 (三)母种原种质量标志 1母 种采用马铃薯、葡萄糖、琼脂(PDA)培养基，在斜面25培养1014天后进行观察。优良母

24、种的质量标志是：菌丝长满斜面，略有爬壁现象，菌丝洁白，有光泽，粗壮，分枝多，生长浓密，呈绒毛状，平坦，紧贴管壁；培养基含水量适宜，不干缩，不黄化；转接到新培养基上，萌发吃料快，长势又快又旺。早熟菌株存放时间长会形成原基，因此必须掌握适龄使用，避免原基形成。2原 种优良原种的质量标志是：菌丝长满瓶后，菌丝洁白，粗壮浓密，生长均匀，有光泽，香味浓郁；培养3545天后，表面菌丝(即绒毛菌丝)生长旺盛，菌丝分泌棕褐色水珠，培养料变为淡黄色，且不松散，有一定弹性，菌丝聚集成白色小棉球，在此以前使用最好。如果菌丝与瓶壁脱离、萎缩，产生较厚的褐色菌膜，说明菌种已老化，要尽快使用，并去掉老化膜，取用中间菌种块

25、。如木屑培养料未变黄，说明培养时间短，可继续培养一段时间，尔后再使用。二、菌种退化现象及预防 (一)菌株退化现象 在生物的进化过程中，遗传性变异是绝对的，而稳定性却是相对的；退化性变异是大量的，而进化性变异却是个别的。因此，优良菌株种性不是永恒的，而是变化的。 1现 象 在菌株用于生产及保藏过程中，常常出现菌株渐渐丧失原来的生活力和丰产性状，如长势差了、出菇迟了、产量低了、质量劣了等现象，这通常可以认为是菌株退化了。具体地说，菌株退化的主要表现是：菌丝生长速度慢，在培养基上出现白色浓密的扇形菌落，对不良的外界环境抵抗力弱，子实体提前形成或推迟，出菇潮次不明显，菌盖菌柄畸形多，产量下降，品质变劣

26、。 2原 因 菌株种性不稳，多为杂合性，细胞核杂合，遗传上出现分离变异，丧失原有的某些种性。培养条件不适宜，长期在人工培养条件下不能满足野性要求，失去自我调节能力，失去正常生理功能，不能表现出优良性状。就某菌株而言，随着培养和使用时间的延长，个体菌龄越来越大，新陈代谢机能逐渐减退，失去抗逆能力或高产性能，严重者丧失使用价值。菌株被病毒寄生。香菇菌株退化与感染病毒的症状类似，即菌丝长势减弱，分解培养料的能力下降，导致畸形菇增多，产量及质量下降。据研究，不正常菌丝体内分离出4纳米(nm)的球状病毒颗粒，而正常菌株菌丝内没有发现这种病毒颗粒。这一结果表明，香菇感染病毒后，菌丝体内的代谢活力受到严重抑

27、制，分解木质素、纤维素和半纤维素能力下降，致使出现菌丝生长速度转慢、形态失常和退化等典型病毒感染症状。因此，可以认为病毒感染的菌丝症状，是菌株退化的一种主要表现。 (二)菌株退化的预防 将表现出退化的菌株进行种性恢复的技术过程，称为复壮，这是预防菌株退化的主要途径。 1控制传代次数 菌株退化是一个渐变过程。为了减缓或预防这种渐变的发生，应控制传代次数，最好保持传代13次为好。 2更换培养基营养成分 在生产中长期使用一种培养基，常会引起退化。因此要注意变换培养基的营养成分和配方，最好让菌株回到适宜树种段木或适宜树种木块上培养，并给予适宜的环境条件，这样可以增强菌株生活力和丰产性状。 3选用适当的分离方法 即利用有性繁殖的方法获得菌株，再以无性繁殖方法保持其优良性状，使菌株的变异遗传朝着生产需要的方向发展。 4控制病毒侵染途径 科学研究认为，病毒是通过菌丝融合而传播，控制有性杂交过程是防止病毒侵染的主要方法。因此，可采用酶标免疫技术、单克隆抗体技术或DNA探针技术，检测香菇菌株是否感染病毒，对香菇菌株退化进行监测和预防。