蛋白质结构与功能ppt课件.ppt

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1、第一节第一节 蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构第三节第三节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系第四节第四节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质 及其分离纯化及其分离纯化第二章第二章 蛋白质结构与功能蛋白质结构与功能蛋白质的主要生理功能蛋白质的主要生理功能 蛋白质（蛋白质（proteinprotein）是生活细胞内含量最丰富、功能最）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本程。因此，研究蛋白质的结构

2、与功能始终是生命科学最基本的命题。的命题。 生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：的体现者，具有以下主要功能：催化功能；结构功能；调节功能；催化功能；结构功能；调节功能；防御功能；运动功能；运输功能；防御功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能信息功能；储藏功能 碳碳(C) 50% 55%氢氢(H) 6% 8%氧氧(O) 19% 24%氮氮(N) 13% 19%16%；N(g)6.25= 样品样品Pr含量含量硫硫(S) 0% 4%少量的少量的磷磷(P)、铁、铁(Fe)、铜、铜(Cu)、锌、锌(Zn)和碘和

3、碘(I)等等第一节第一节 蛋白质蛋白质( (protein) )的化学组成的化学组成元素组成元素组成生物体内的氨基酸类别生物体内的氨基酸类别 蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的蛋白质中常见的20种氨基酸种氨基酸 稀有的蛋白质氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟羟脯氨酸、脯氨酸、5-羟赖氨酸等。羟赖氨酸等。 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨生物体内呈游

4、离或结合态的氨基酸。基酸。CRH2NHCOOHCRH3N+HCOO-或构成蛋白质的构成蛋白质的20种氨基酸种氨基酸(aa)的结构特点的结构特点:1. 均为均为L氨基酸，各种氨基酸，各种aa的的R侧链各不相同侧链各不相同2. 碳原子上均连有一个氨基碳原子上均连有一个氨基(脯氨酸脯氨酸除外除外)3. -碳原子为不对称碳原子为不对称(手性手性)碳原子碳原子(甘氨酸甘氨酸除外）除外）一一 氨基酸氨基酸(amino acid)蛋白质的基本构成蛋白质的基本构成氨基酸结构通氨基酸结构通式式（一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类根据氨基酸侧链基团根据氨基酸侧链基团()的结构和理化性的结构和理化性质，将其分为质，

5、将其分为 ：1.非极性非极性 氨基酸氨基酸2.极性氨基酸极性氨基酸 酸性氨基酸酸性氨基酸 碱性氨基酸碱性氨基酸中性中性氨基酸氨基酸1. 非极性非极性 氨基酸氨基酸包括包括7个：个：甘氨酸（甘氨酸（Gly）、丙氨酸（）、丙氨酸（Ala）、）、缬氨酸（缬氨酸（Val）、亮氨酸（）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（）、苯丙氨酸（Phe）和脯氨酸（）和脯氨酸（Pro）2. 极性氨基酸极性氨基酸R-基含有基含有极性基团；极性基团；中性中性酪氨酸酪氨酸( (TyrTyr) )生理生理pH条件下不解离。条件下不解离。色氨酸色氨酸( (TrpTrp) )、丝氨酸丝氨酸( (SerS

6、er) )、半胱氨酸半胱氨酸( (CysCys) )、蛋氨酸蛋氨酸( (MetMet) )、天冬酰胺天冬酰胺( (AsnAsn) )、谷氨酰胺谷氨酰胺( (GlnGln) )、苏氨酸苏氨酸( (ThrThr) ) 、包括包括8个：个：3. 酸性氨基酸酸性氨基酸R-基有基有COOH(COO-)带负电荷带负电荷4. 碱性氨基酸碱性氨基酸R-基有基有NH2(NH3+)赖氨酸赖氨酸(Lys)、精氨酸、精氨酸(Arg)、组氨酸、组氨酸(His)带正电荷带正电荷精氨酸（精氨酸（Arg）组氨酸（组氨酸（His）胍基胍基咪唑基咪唑基CHCHCH2CHNH3+COO-NHNH+CHCNH2NH2+NHCH2CH

7、2CH2CHNH3+COO-1. 两性解离及等电点两性解离及等电点（二）（二） 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质R CHNH2COOHRCHNH3+COO-RCHNH3+COOHRCHNH2COO-+ OH+ H+ OH+ H+pHpIpH=pI等电点等电点(pI)：氨基酸酸性解离和碱性解离的程度相等，氨基酸酸性解离和碱性解离的程度相等，分子所带的净电荷为零，此时溶液的分子所带的净电荷为零，此时溶液的pH值就值就称为该氨基酸的等电点。称为该氨基酸的等电点。除碱性氨基酸外，其余氨基酸的等电点均除碱性氨基酸外，其余氨基酸的等电点均小于小于pH7pI=1/2（pK1+pK2）若一个若一个aa有有3个

8、解离基因，则其个解离基因，则其pI为兼性离子为兼性离子两边两边pK的平均值的平均值2. 紫外吸收性质紫外吸收性质色氨酸和酪氨酸在色氨酸和酪氨酸在280nm波长附近对紫外波长附近对紫外光有最大吸收峰。光有最大吸收峰。据此可以通过测定蛋白质溶液据此可以通过测定蛋白质溶液280nm的吸光的吸光值快速测定其蛋白质含量。值快速测定其蛋白质含量。3. 茚三酮反应茚三酮反应aa与水合茚三酮一起加热，生成蓝紫色的化与水合茚三酮一起加热，生成蓝紫色的化合物，在合物，在570nm处有最大吸收。据此亦可用作处有最大吸收。据此亦可用作aa含量分析。含量分析。 构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基种氨基酸在可见光区都

9、没有光酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区吸收，但在远紫外区(220nm)(220nm)均有光吸收。均有光吸收。 在近紫外区在近紫外区(220-300nm)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能和色氨酸有吸收光的能力。力。 酪氨酸的酪氨酸的 maxmax275nm275nm， 275275=1.4x10=1.4x103 3; ; 苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax257nm257nm， 257257=2.0 x10=2.0 x102 2; ; 色氨酸的色氨酸的 maxmax280nm280nm， 280280=5.6x10=5.6x103 3; ;

10、氨基酸与茚三酮反应氨基酸与茚三酮反应+3H20水合茚三酮水合茚三酮(无色无色)NH3CO2 RCHO+还原性茚三酮还原性茚三酮紫色化合物紫色化合物(弱酸弱酸)加热加热水合茚三酮水合茚三酮+ 2NH3 +还原性茚三酮还原性茚三酮氨基酸与苯异硫氰酯（氨基酸与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应）的反应（EdmanEdman反应）反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）弱硷中弱硷中(400 C)(硝基甲烷硝基甲烷 400 C)H+氨基酸与氨基酸与2,42,4一二硝基氟苯一二

11、硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反应的反应（sangersanger反应）反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色黄色)+ HF弱硷中弱硷中氨基酸氨基酸（一）（一） 肽与肽键肽与肽键脱去一分子水缩合形成的键脱去一分子水缩合形成的键二、二、肽肽一个氨基酸的一个氨基酸的-羧基与羧基与另一个氨基酸的另一个氨基酸的-氨基氨基肽键的概念：肽键的概念：称称肽键肽键(peptide bond)肽肽氨基酸借肽键相连而形成的化合物称氨基酸借肽键相连而形成的化合物称肽肽(peptide)MetPhe二肽二肽LysMetPhe三肽三肽CysThrLysMetPhe五肽五肽寡肽寡

12、肽(oligopeptide)由由10个以内氨基酸连成的小肽个以内氨基酸连成的小肽多肽多肽(polypeptide)由许多氨基酸连成的肽由许多氨基酸连成的肽又称多肽链或肽链又称多肽链或肽链其形状为一条没有分支的长链，其形状为一条没有分支的长链，氨基末端氨基末端(端端)羧基末端羧基末端(C 端端)CysMet Phe LysSer ThrValNH2COOHCOHOCH3NH2HC+HOCOCH2NH2HC丙氨酸丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸COHOCH3HCCH2NH2HC肽键肽键NCOH二肽二肽苯丙氨丙氨酸苯丙氨丙氨酸肽和肽键的形成肽和肽键的形成肽单位肽单位肽键肽键肽平面肽平面在肽键中，与相连的氧原

13、子和在肽键中，与相连的氧原子和氢原子呈反式构型氢原子呈反式构型（反式）（反式）（顺式）（顺式）CNOHCNOH肽键的特点：肽键的特点：肽键的特点：肽键的特点：CN单键为0.149nmC=N双键为0.127nm具有部分双键性质具有部分双键性质不能自由旋转不能自由旋转肽键中键长为肽键中键长为0.132nmCNOH氨基酸在形成肽链时丢失了一分子水，氨基酸在形成肽链时丢失了一分子水，肽链中的氨基酸分子已不完整，肽链中的氨基酸分子已不完整，氨基酸残基氨基酸残基称为称为氨基酸残基氨基酸残基(amino acid residue)。蛋白质与多肽的区别：蛋白质与多肽的区别：Protein空间构象相对稳定空间构

14、象相对稳定氨基酸残基数较多氨基酸残基数较多Peptide空间构象不稳定空间构象不稳定氨基酸残基数较少氨基酸残基数较少（二）生物活性肽（二）生物活性肽1. 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione，GSH)构成第一个肽键的羧基是谷氨酸的构成第一个肽键的羧基是谷氨酸的羧基羧基由谷氨酸由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸和甘氨酸(Gly)组成的三肽组成的三肽GluCysGly(1)组成组成(2) 功能功能GSH是体内重要的还原剂是体内重要的还原剂谷胱甘肽谷胱甘肽 谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶

15、，或防止过氧化物积累。原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。 由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺素甲状腺素(调节糖代谢调节糖代谢)。2.促甲状腺素释放激素促甲状腺素释放激素(1) 组成组成pyro-GluHisPro-NH2(2) 功能功能焦谷氨酸焦谷氨酸组氨酸组氨酸脯氨酰胺脯氨酰胺三、蛋白质的分类三、蛋白质的分类1. 根据组成成分分为：根据组成成分分为：单纯蛋白质单纯蛋白质全部由全部由aa组成；组成；结合蛋白质结合蛋白质除蛋白部分外，除蛋白部分外， 还含非蛋白部分。还含非蛋白部分。结合蛋白质中的非蛋白部分称为结合蛋白质中的非蛋白部分称

16、为辅基辅基，常以共价键与蛋白部分相连。常以共价键与蛋白部分相连。辅基辅基：包括色素、寡糖、脂类、磷酸、金属：包括色素、寡糖、脂类、磷酸、金属 离子、核酸等离子、核酸等2. 根据其形状分为：根据其形状分为：纤维蛋白质纤维蛋白质分子状如纤维，其长轴分子状如纤维，其长轴 比纵轴大于比纵轴大于10：1球状蛋白质球状蛋白质分子状如球形或椭圆形分子状如球形或椭圆形常难溶于水，常作为细胞支架和细常难溶于水，常作为细胞支架和细胞连接，如大量存在于结缔组织中胞连接，如大量存在于结缔组织中常可溶于水，如酶、转运蛋白、常可溶于水，如酶、转运蛋白、免疫球蛋白等免疫球蛋白等第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构

17、一、一、 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构二、二、 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构三、三、 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构四、四、 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构高级结构高级结构或或空间结构空间结构蛋蛋白白质质结结构构的的主主要要层层次次一级结构一级结构四级结构四级结构二级结构二级结构三级结构三级结构primary structureprimary structuresecondary structuresecondary structureTertiary structureTertiary structurequariernaryquariernary structure struc

18、ture超二级结构超二级结构结构域结构域 supersecondary supersecondary structure structureStructure Structure domandoman一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构 蛋白质一级结构的概念：蛋白质一级结构的概念： 蛋白质分子中所有氨基酸的排列顺序，称蛋白质分子中所有氨基酸的排列顺序，称 一级结构中的主要化学键：一级结构中的主要化学键： 肽键，二硫键肽键，二硫键 氨基酸序列书写：氨基酸序列书写： 以氨基末端开始以氨基末端开始羧基末端结束，依次编羧基末端结束，依次编1、2、3蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺蛋白质多肽链中氨基

19、酸残基的排列顺序称为蛋白质的一级结构序称为蛋白质的一级结构CysMet Phe LysSer Thr ValNH2COOH胰岛素的一级结构胰岛素的一级结构各种蛋白质的根本差异在于一级结构的不同各种蛋白质的根本差异在于一级结构的不同一级结构测定一级结构测定基本战略基本战略：片段重叠法氨基酸顺序直测法：片段重叠法氨基酸顺序直测法 要点：要点：a a. .测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分 b.b. 测定肽键的测定肽键的N N末端和末端和C C末端末端 c.c. 应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；

20、也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段。位点，从而得到一系列大小不等的肽段。 d.d. 分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序顺序 e.e. 将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。蛋白质顺序测 定基本战略将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨

21、基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质二、蛋白质二级结构二、蛋白质二级结构 概念：概念： 是指蛋白质分子中一段多肽链的局部空是指蛋白质分子中一段多肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及到对空间位置，并不涉及到aa侧链侧链R基团基团的构象。的构象。 肽单元（肽平面）：肽单元（肽平面）： 肽键的肽键的6个原子个原子C1 、C、N、O、H、 C 2位于同一平面，构成所谓的位于同一平面，构成所谓的肽单元肽单元肽单位肽键中的和均不能自由旋转肽键中的和均不能自由旋转肽键肽键(-CONH- ) 中的个原子中的个原子个个碳原子碳

22、原子( C)和和被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，构成一个肽单元构成一个肽单元(peptide unit)。酰胺平面与酰胺平面与-碳原子的二面角（碳原子的二面角（ 和和 ） 二面角二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为为定点而旋转，绕定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称键旋转的角度称角角，绕，绕C-C键旋转的角度称键旋转的角度称角。角。和和称作称作二面角，亦称构象角。二面角，亦称构象角。完全伸展的多肽主链构象完全伸展的多肽主链构象-碳原子碳原子酰胺平面酰胺平面=1800，=1800=00，=00的多肽主链构象的多肽主链构

23、象酰胺平面酰胺平面=00，=00侧链侧链非键合原子非键合原子接触半径接触半径蛋白质的二级结构类型蛋白质的二级结构类型螺旋结构螺旋结构折叠结构折叠结构-转角转角无规卷曲无规卷曲（一）（一）螺旋螺旋 (helix)helix)由肽键平面盘旋由肽键平面盘旋形成的螺旋状构象形成的螺旋状构象1.概念概念2.2.螺旋的结构特征螺旋的结构特征(1)(1)以肽键平面为以肽键平面为单位单位, ,以以碳原碳原子为转折盘旋形成子为转折盘旋形成右手螺旋右手螺旋(2) 每每3.63.6个氨基酸残基个氨基酸残基 绕成一个螺圈绕成一个螺圈(360(3600 0) )螺距为螺距为0.54nm0.54nm每个氨基酸上升每个氨基

24、酸上升0.15nm0.15nm肽键平面与中心轴肽键平面与中心轴平行平行(3)(3)主链原子构成螺旋的主体主链原子构成螺旋的主体, ,侧链在其外部侧链在其外部(4)(4)肽键的肽键的COCO和和NHNH 都形成都形成氢键氢键是稳定螺旋的主是稳定螺旋的主要作用力要作用力氢键的方向与中氢键的方向与中心轴大致平行心轴大致平行, ,（二）（二）折叠折叠(pleated sheet)pleated sheet)故又称故又称折叠片或折叠片或片层。片层。肽键平面呈伸展的锯齿状排列肽键平面呈伸展的锯齿状排列形成的结构称形成的结构称折叠。折叠。常为两条或两条以上伸展的多肽链常为两条或两条以上伸展的多肽链侧向聚集在

25、一起形成扇面状，侧向聚集在一起形成扇面状，1.概念概念2. 折叠结构特点折叠结构特点() 相邻肽键平面的夹角为相邻肽键平面的夹角为1100 ，呈锯齿状排列；，呈锯齿状排列；侧链基团交错地分布在片层平面的两侧。侧链基团交错地分布在片层平面的两侧。()由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴 接近垂直。接近垂直。() 条肽段平行排列构成，肽段之间条肽段平行排列构成，肽段之间 可顺向平行可顺向平行(均从均从N-C)，也可反向平行，也可反向平行 。（三）三）转角转角(turn)肽链出现肽链出现1800回折的转角处结构回折的转角处结构称为称为转角。转角。1.概念概念2.结构特

26、征结构特征*第一个残基的第一个残基的C=O与第四个与第四个残基的残基的N-H形形成氢键成氢键.*常见于球状蛋常见于球状蛋白质分子表面白质分子表面.（四）无规卷曲（四）无规卷曲(random coil)1.概念概念没有确定规律性的肽键构象没有确定规律性的肽键构象常见于球状蛋白质分子中，在其常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起调节它类型二级结构肽段之间起调节作用，有利于整条肽链盘曲折叠作用，有利于整条肽链盘曲折叠H2NCOOH无规则卷曲无规则卷曲细胞色素细胞色素C的三级结构的三级结构无无规规则则卷卷曲曲示示意意图图( (五五) ) 蛋白质的超二级结构和结构域蛋白质的超二级结构和结构

27、域(2(2) ) 结构域结构域（structure domainstructure domain）蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个螺旋或螺旋或折叠或折叠或转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构合体称为蛋白质的超二级结构基本组合方式基本组合方式：；在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的

28、三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。 形成意义：形成意义： 动力学上更为合理动力学上更为合理 蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性( () )超二级结构超二级结构（ supersecondarysupersecondary structure structure ）超二级结构类型超二级结构类型1 2 3 4 5 5 2 3 4 1 -链链 -迂回迂回回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构 -迂回迂回三三 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构称为蛋白质的三级结构

29、称为蛋白质的三级结构( trertiary structure)1.概念概念一条多肽链中所有原子在三维空间的整体一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布包含了主链构象和侧链构象的内容排布包含了主链构象和侧链构象的内容结构域结构域(structural domain)一条肽链通过盘曲折叠一条肽链通过盘曲折叠,常形成常形成2 个或多个在空个或多个在空间上可以明显区分的折间上可以明显区分的折叠实体，称为结构域叠实体，称为结构域.*类型类型*概念概念全全a-螺旋、螺旋、a / 全全-折叠、折叠、 无规则卷曲无规则卷曲卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域 -螺旋螺旋 -转角转

30、角 -折叠折叠二硫键二硫键结构域结构域1结构域结构域2噬菌体噬菌体T4全全a-螺旋结构域螺旋结构域磷酸丙糖同分异构酶磷酸丙糖同分异构酶a / 结构域结构域由这些结构域缔合成由这些结构域缔合成 具有三级结构的分子或亚基具有三级结构的分子或亚基蛋白质三级结构的意义：蛋白质三级结构的意义： 蛋白质的三级结构决定了蛋白质的蛋白质的三级结构决定了蛋白质的生物学功能生物学功能.疏水核：疏水核： 疏水区从位于分子内部，疏水区从位于分子内部， 往往往往 是与辅酶是与辅酶/基或底物结合位点。基或底物结合位点。维持蛋白质三级结构稳定的因素维持蛋白质三级结构稳定的因素亲水区：亲水区： 亲水区多位于分子表面，亲水区多

31、位于分子表面， 故球故球 形蛋白质水溶性较好。形蛋白质水溶性较好。维持蛋白质分子构象的作用力维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键盐键 b.氢键氢键 c.疏水键疏水键 d.范得华力范得华力 e.二硫键二硫键多肽链多肽链维系蛋白质结构的作用力维系蛋白质结构的作用力1. 肽键肽键共价键共价键2. 二硫键二硫键共价键共价键3. 次级键次级键非共价键非共价键维系蛋白质空间结构维系蛋白质空间结构维系蛋白质一级结构维系蛋白质一级结构维系蛋白质三级结构维系蛋白质三级结构次级键的种类：次级键的种类：氢键、疏水相互作用、离子键和范德华力氢键、疏水相互作用、离子键和范德华力氢键氢键负电性很强的原子（如氧或氮）负电性很

32、强的原子（如氧或氮）和与氧或氮共价结合的氢原子相和与氧或氮共价结合的氢原子相互吸引，这种作用力称为氢键。互吸引，这种作用力称为氢键。疏水相互作用疏水相互作用由非极性由非极性基团受到基团受到水分子排水分子排斥相互聚斥相互聚集在一起集在一起的作用力的作用力疏水作用示意图疏水作用示意图离子键离子键由异性电荷间的静电吸引形成的键。由异性电荷间的静电吸引形成的键。 四四 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构(quaternary structure)是指亚基间的空间排布、亚基间相互作是指亚基间的空间排布、亚基间相互作用与接触部位的布局，不包括亚基本身用与接触部位的布局，不包括亚基本身的空间结构。的空间结构。

33、亚基间以次级键相连，绝亚基间以次级键相连，绝无共价键。无共价键。1.概念概念蛋白质分子由两条或两条以上肽链组蛋白质分子由两条或两条以上肽链组成，每条肽链各自形成了独立的三级成，每条肽链各自形成了独立的三级结构结构，分子中的每一个具有独立三级分子中的每一个具有独立三级结构肽链结构肽链,称为亚基称为亚基亚基亚基(subunit)2.维持蛋白质四级结构的作用力维持蛋白质四级结构的作用力主要是疏水作用主要是疏水作用次级键次级键盐键、氢键盐键、氢键第三节第三节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系（一）（一） 一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白

34、质一级结构与功能的关系 以以124个氨基酸残基组成的牛胰核糖核个氨基酸残基组成的牛胰核糖核酸酶（酸酶（4对二硫键）为例说明对二硫键）为例说明牛胰核糖核酸酶的变性与复性牛胰核糖核酸酶的变性与复性-巯基乙醇巯基乙醇尿素或盐酸胍尿素或盐酸胍透析透析有活性有活性无活性无活性1.一级结构相似的蛋白质功能相似一级结构相似的蛋白质功能相似一级结构不同的蛋白质功能不同一级结构不同的蛋白质功能不同胰岛素的一级结构及种属差异胰岛素的一级结构及种属差异（二）一级结构与功能的关系（二）一级结构与功能的关系ACTH 促肾上腺素皮质激素促肾上腺素皮质激素MSH 促黑激素促黑激素一级结构不同的蛋白质功能不同一级结构不同的蛋

35、白质功能不同HbS与与HbA的区别的区别-亚基第亚基第6位氨基酸位氨基酸正常人：正常人：Glu患者：患者：Val正常红细胞与正常红细胞与镰刀形红细胞镰刀形红细胞的扫描电镜图的扫描电镜图镰刀形镰刀形红细胞红细胞正常红正常红细胞细胞 -链链N端氨基酸排列顺序端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患（患 者）者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys不同生物与人的不同生物与人的CytcCytc的的AAAA差异数目差异数目生物生物 与人不同的与人不同的AAAA数

36、目数目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、猪、羊、狗牛、猪、羊、狗 11马马 12鸡、火鸡鸡、火鸡 13响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21角饺角饺 23小蝇小蝇 25蛾蛾 31小麦小麦 35粗早链孢霉粗早链孢霉 43酵母酵母 44 不不同同生生物物来来源源的的细细胞胞色色素素c c中中不不变变的的AAAA残残基基14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr70

37、7580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素血红素细胞色素细胞色素c c分子的空间结构分子的空间结构不变不变的的AAAA残基残基 35个不变的个不变的AA残基，是残基，是Cyt C 的生物功能所不的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与可能参与电子传递；有的可能参与“识别识别”并结合并结合细胞色素还原酶和氧化酶。细胞色素还原酶和氧化酶。例例2由由4个亚基组成个亚基组成血红蛋白血红蛋白功能功能:运输运输O2二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关

38、系（一）肌红蛋白（一）肌红蛋白（Mb）与）与 血红蛋白结构（血红蛋白结构（Hb）蛋白质的空间结构决定生物学功能蛋白质的空间结构决定生物学功能肌红蛋白（肌红蛋白（1个亚基）与血红蛋白（个亚基）与血红蛋白（4个亚基）个亚基）且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地结合的能力。结合的能力。其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合O2血红蛋白输氧功能和构象变化血红蛋白输氧功能和构象变化O2HbHb- O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细活动肌肉毛细血管中的血管中的PO20 20 40

39、 60 80 100肺泡中的肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobinO2（二）血红蛋白构象变化与结合氧的能力（二）血红蛋白构象变化与结合氧的能力变构效应变构效应蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化,其功能也随之变化的现象其功能也随之变化的现象,称为称为变构效应变构效应协同效应协同效应蛋白质分子中的蛋白质分子中的1个亚基与其的配体结合后个亚基与其的配体结合后,能影响其它亚基与配体的结合能影响其它亚基与配体的结合,称为称为协同效应协同效应促进促进 正协同效应正协同效应抑制抑制负协同效应负协同效应血红蛋白与氧结合的正协同效应血红蛋白与氧结合的正协同

40、效应氧氧饱饱和和度度静脉血静脉血动脉血动脉血氧分压氧分压P50100% - HbMb第四节第四节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质 及其分离纯化及其分离纯化一一 、蛋白质的理化性质、蛋白质的理化性质（一）两性解离和等电点（一）两性解离和等电点蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的主要取决于溶液的pH值。值。PrCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2+OH-+H+OH-+H+pH=pIpHpI此时溶液的此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点值称为蛋白质的等电点(pI)。等电点（等电点（pI）：）：在某一在某一pH值溶液中，值溶液中

41、，蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零蛋白质分子颗粒大小蛋白质分子颗粒大小1100nm之间之间,属胶属胶体颗粒范围，体颗粒范围，蛋白质的胶体原因：蛋白质的胶体原因：表面形成水化层表面形成水化层表面同种电荷的斥力表面同种电荷的斥力（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质在溶液中能形成稳定的胶体在溶液中能形成稳定的胶体（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固1. 蛋白质的变性作用蛋白质的变性作用在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，蛋白质的构象被破坏，失

42、去其原有的蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，性质和生物活性，称为蛋白质的称为蛋白质的变性作变性作用用(denaturation)。变性后的蛋白称为变性蛋白质。变性后的蛋白称为变性蛋白质。概念概念:常见的变性因素：常见的变性因素：强酸、强酸、强碱、强碱、 有机溶剂、有机溶剂、尿素、尿素、 胍、胍、重金属重金属生物碱、生物碱、化学因素化学因素物理因素物理因素剧烈振荡剧烈振荡热、热、紫外线、紫外线、超声波、超声波、变性蛋白质的主要特征变性蛋白质的主要特征:一级结构不变。一级结构不变。（2） 生物活性丧失。生物活性丧失。粘度增加而扩散系数减小。粘度增加而扩散系数减小。（4） 变性蛋白质容

43、易消化变性蛋白质容易消化。（1）蛋白质分子中的次级键断裂，）蛋白质分子中的次级键断裂，（3） 变性蛋白质的溶解度常降低、变性蛋白质的溶解度常降低、构象破坏，但不涉及共价键的破坏，构象破坏，但不涉及共价键的破坏，除去变性因素后，有的变性蛋白质又可除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，这一现象恢复其天然构象和生物活性，这一现象称为蛋白质的复性称为蛋白质的复性蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturation)核糖核酸酶变性与复性作用核糖核酸酶变性与复性作用Native ribonucleaseDenative reduced ribonucleaseNative ribonu

44、clease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis变性变性复性复性当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为出，这种现象称为蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀。2. 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀(pre-cipitation)概念概念:应用应用:(1)蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化(2)解毒解毒(3)临床检验临床检验(1) 盐析法盐析法( salting out)向蛋白质溶液中加入大量中性盐使向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析蛋白质沉淀称为盐

45、析常用的中性盐：常用的中性盐：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。变性。硫酸铵、硫酸铵、 硫酸钠、硫酸钠、氯化钠等氯化钠等使蛋白质沉淀的方法使蛋白质沉淀的方法概念：概念：特点：特点：作用原理作用原理:盐离子与水亲和力极强，盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的夺去蛋白质的水化层水化层，减少分子间，减少分子间静电斥力静电斥力(2) 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层使蛋白质脱去水化层,又能降低溶又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。 必须在低温下操作必须在低温下操作

46、注意事项注意事项:尽量缩短处理的时间尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇甲醇、乙醇乙醇、丙酮丙酮缺点：缺点： 原理原理:常用有机溶剂常用有机溶剂:常会使蛋白质变性常会使蛋白质变性重金属离子如重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀性的重金属蛋白盐而沉淀。(3) 重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法此法常使蛋白质变性失活。此法常使蛋白质变性失活。若溶液若溶液pH大于蛋白质的大于蛋白质的pI，沉淀更易发生，沉淀更

47、易发生缺点：缺点：原理原理:生物碱试剂生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、如鞣酸、苦味酸、钨酸等钨酸等)，某些酸类，某些酸类(主要是指主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等等)，与带正电的蛋白质，与带正电的蛋白质 结合结合生成不溶性的盐而沉淀。生成不溶性的盐而沉淀。(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法反应溶液的反应溶液的pHpI，确保蛋白，确保蛋白质以阳离子形式存在质以阳离子形式存在 缺点：缺点： 原理原理:常引起蛋白质变性常引起蛋白质变性注意事项注意事项:3. 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变蛋白质的凝固作用实际上是蛋白

48、质变性后进一步发展的不可逆结果。性后进一步发展的不可逆结果。如加热可使蛋白质变为不再溶解如加热可使蛋白质变为不再溶解的凝块。的凝块。(四四)蛋白质主要呈色反应蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应双缩脲反应 酚试剂反应酚试剂反应 蛋白质定量、定性蛋白质定量、定性 茚三酮反应茚三酮反应 测定常用方法测定常用方法 双缩脲反应 蛋白质在碱性溶液中也蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物产生红紫色络合物红紫色络合物红紫色络合物(硷性溶液硷性溶液)Cu2+ 2.米伦氏反应米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液

49、中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸4.坂口反应坂口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸5.福林试剂反应福林试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合-Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物

50、灵敏度提高100倍6.茚三酮反应茚三酮反应灵敏度差7.黄蛋白反应黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高1-1000微克/毫升（五）蛋白质的紫外吸收光谱（五）蛋白质的紫外吸收光谱 蛋白质在远紫外光蛋白质在远紫外光区（区（200-230nm200-230nm）有较）有较大的吸收，在大的吸收，在280nm280nm有有一特征吸收峰，可利用一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。定性定量鉴定。蛋白质质量浓度蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1