基于纳米孔的四环素检测技术的研究_张月川.docx

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1、 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得电子科技大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 作者签名： 細 丨丨 . 曰期： 年 i月曰 论文使用授权 本学位论文作者完全了解电子科技大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国象有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权电子科技大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有

2、关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后应遵守此规定 ） 作者签名： MA 导师签名 ： ilkA 曰期： 2以年；月卩曰 分类号 _ 密级 _ UDC 注 _ 学位论文 _ 基于纳米孔的四环素检测技术的研究 (题名和副题名） 张月川 (作者姓名） 指导教师 _ 付永启 _ 教授 电子科技大学 成都 (姓名、职称、单位名称） 申请学位级别 页士 学科专业 _ _ 提交论文日 期 2016.4 论文答辩日 期 2016.5.17 学位授予单位和日 期 电子科技大学 2016年 6月 答辩委员会主席 _ 评阅人 _ 注 1:注明国际十进分

3、类法 UDC 的类号。 Nanopore-based Tetracycline Detection A Master Thesis Submitted to University of Electronic Science and Technology of China Major: Optics Author: _ Yuechuan Zhang _ Supervisor: _ Prof. Yongqi Fu _ School: _ School of Physical Electronics 摘要 摘要 四环素作为抗生素家族中的一员被广泛应用在人类和动物医学中。抗生素类 药物的广泛应用带来了

4、诸多的环境问题。例如，残留在环境中的抗生素能够渗透到 土壤和水源中，不仅能够引起超级细菌的发展，也能够对人类的健康产生许多未知 的影响。现在，对抗生素类物质的检测主要有以下几种：酶联免疫吸附测定法、液 相色谱法 (LC)、表面等离子体共振生物传感器、液相色谱 -串联质谱法 (LCMS/MS)。 但是这些方法的一些缺点，如，成本高、测试时间长以及需要对样品进行预处理等 阻碍了他们真正的走向应用。因此找到一种低廉、高效、的方法意义重大。 人们对纳米孔传感器的研宄从库尔特计数器的发明就已经开始，距今已经有 几十年的时间了。随着纳米技术的发展，以纳米孔为基础的分子分析技术越来越受 到人们的青睐。纳米孔

5、传感器能够在单分子层面对生物分子进行检测，不仅不需要 对样品进行分子标记，而且也更加直接灵敏。纳米孔传感器的发展经历了两个阶段 : 生物纳米孔传感器和固态纳米孔传感器。这两种类型的传感器都有各自的优点和 缺点， 如：生物纳米孔直径很小拥有较高的空间分辨率，但是纳米孔的尺寸很难调 节。固态纳米孔的尺寸比较好调节，但是空间分辨率却相对较低。纳米孔通常是在 氮化硅或二氧化硅薄膜上制备，通常采用聚焦离子束 (FIB )、透射电子显微镜 (TEM) 或电介质击穿方法制得。纳米孔传感器因其独特的特性通常被用来检测核苷酸聚 合物的形态、 DNA序列、离子、生物小分子等。 在这篇文章之中，我们用纳米孔技术与生

6、物机制相结合的方法对四环素浓度 进行了检测。反向四环素反式激活因子 （ rtTA)和四环素反应元件 （ TRE)在四环 素的作用下会相互结 合并生成一个复合体。当这个复合体通过纳米孔时就会产生 阻塞电流信号。通过对阻塞电流信号的检测就能够分辨出 rtTA、 TRE和这个复合 体。我们用了两种不同的方法对这些生物分子进行检测，一个是凝胶电泳，另一个 是纳米孔生物传感器。在凝胶电泳试验中，我们成功的分辨出了 rtTA、 TRE以及 它们之间存在的弱相互作用。在纳米孔实验中，首先，我们用电击穿法在 l nm氮 化硅薄膜上制备了 l nm以下的纳米孔，然后我们对 rtTA和 TRE进行了检测，并 且成

7、功的将他们区别出来。之后，我们在不同浓度的 Tet下探测了 rtTA和 TRE的 相互作用，并且成功将他们之间的结合过程表示了出来。与凝胶电泳相比，纳米孔 传感器能够在单分子层面上对生物分子进行探测，更直接、更清晰、更灵敏。 关键词： rtTA、 TRE、 四环素、纳米孔、单分子、探测 I ABSTRACT Abstract Tetracycline (Tet) is one kind of the antibiotics, which is widely used in both human and animal medicine. The use of antibiotics may br

8、ing many environment problems. For example, the antibiotics residue in environment may mobile into the ground and surface water, and then cause the development of antibiotics-resistant bacteria and some unknown chronic disease. There are many approaches have been developed for antibiotics residue: e

9、nzyme-linked immunosorbent assay, liquid chromatography (LC), surface plasmon resonance biosensor, and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LCMS/MS). But each of them has its own disadvantages. For instance, high cost, time consuming, simple operating, and so on. These shortcoming prevent

10、 all these kinds of methods developing. So it is important to find a simple, efficient method. Nanopore sensor has been studied for several decades since the development of coulter counter. Because the development of nano technology, nanopore-based analysis attract more and more attention. Nanopore

11、sensor could detect biomolecule at single molecular level, which is not only a lab-free recognition approach needing low sample volume, but also more direct, clear and sensitive. The development of nanopore sensor include two stages: biological nanopore and solid-state nanopore. Both two kinds of na

12、npore has its own advantage and disadvantage. For example, the smaller biological channel size improve the spatial resolution, but their size is hard to adjust. The size of solid-state nanopore is tunable, but they do not have high spatial resolution. Nanopores are often fabricated in Si3N4 or Si02

13、membranes by using focused ion beam (FIB), transmission electron microscope (TEM) or dielectric breakdown method. Nanopore sensor is often used in sensing nucleic acid polymer structure, ion detection, DNA sequencing, biomolecule identification, and so on. In this article, we adapt nanopore techniqu

14、e combined with biological mechanism to monitor Tet. rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) and TRE (tetracycline responsive element) could bind with each other and form a complex under the action of Tet. When this complex passes through a nanopore with appropriate size, it will gener

15、ate a block ionic current. Then we can identify rtTA, TRE and their complex through detection of their ionic current. We used two different method to detect rtTA, TRE fragment, and their complex in vitro, one is electrophoretic mobility shift assays (EMSA), ABSTRACT the other is nanopore sensor. Fro

16、m EMSA, we successfully identify these different kinds of biomolecules. In the nanopore experiment, we firstly fabricate solid-state nanopore at sub-10 nm diameter in Si3N4 membranes with 10 nm thick by using dielectric breakdown. Then we test rtTA and TRE at the single molecule level, which identif

17、ied them successfully. Moreover, we detected that there is some interaction even with the absence of Tet, which their ionic signals were different from both rtTA and TRE fragment. To further study how the rtTA interact with Tet, we detected this interaction under different concentration of Tet and v

18、isualized the process that rtTA bind to TRE fragment. Compare to EMSA, the namopore sensor could distinguish these different kinds of molecule and their interactions at the level of single molecule, which is more direct, clear and sensitive. Key words: rtTA, TRE, tetracycline, nanopore, single-molec

19、ule, detection HI 目录 目录 m-n mt . 1 u弓丨言 . i 1.2纳米孔生物传感器技术概述 . 1 1.3论文的主要内容和章节安排 . 2 第二章四环素类抗生素及四环素调控系统 . 4 2.1四环素抑制细菌生长的生物机制 . 5 2.2 四环素调控系统 （ Tet-off/Tet-on system) . 5 2.2.1 Tet-off 系统 . 5 2.2.2 Tet-on 系统 . 6 2.3本章小结 . 7 第三章纳米孔单分子传感器的研究 . 8 3.1纳米孔技术简介 . 8 3.2纳米孔探测技术的基本原理 . 8 3.3不同类型的纳米孔传感器 . 9 3.3

20、.1生物纳米孔 . 9 3.3.2固态纳米孔 . 11 3.3.3不同类型纳米孔之间的比较 . 14 3.4纳米孔生物传感器的应用 . 15 3.4.1对核苷酸聚合物结构及其动态传输过程的探测 . 15 3.4.2 DNA 测序 . 15 3.4.3研宄病毒 DNA包装机制 . 16 3.4.4研究共价键或非共价键之间的相互作用 . 17 3.4.5医学诊断 . 17 3.4.6多肽和蛋白质的探测 . 17 3.5本章小结 . 18 第四章纳米孔的制备 . 19 4.1聚焦粒子束溅射 . 19 4.1.1 FIB设备简介 . 19 4.1.2离子束溅射形成纳米孔 . 20 4.2电子束溅射 .

21、 21 IV 4.2.1透射电子显微镜 （ TEM)简介 . 21 4.2.2电子束溅射形成纳米孔 . 22 4.3电介质击穿形成纳米孔 . 23 4.3.1多级电压脉冲法 . 24 4.4固态纳米孔的加工制备 . 26 4.5固态纳米孔三维结构的可控性研究 . 31 4.6本章小结 . 43 第五章以纳米孔为基础的四环素检测技术的研究 . 45 5.1材料准备 . 46 5.1.1质粒构建 . 46 5.1.2蛋白质的重组和提纯 . 46 5.1.3纳米孔制备 . 47 5.2实验设计 . 47 5.3实验结果与分析 . 49 5.4本章小结 . 57 第六章总结与展望 . 58 _ . 5

22、9 参考文献 . 60 攻读硕士学位期间取得的成果 . 63 第一章绪论 第一章绪论 1.1引言 抗生素作为药物大家族中的一员在人类和动物医学中的使用一直在持续不断 的增加。抗生素在畜牧业中的应用主要集中在三个领域：家畜感染的治疗、预防感 染、生长促进剂。约 50-90%的管理药剂量在治疗后迅速排出。而我们对肥料和土 壤中抗生素的行为、浓度、和最终去向知之甚少。排出的四环素能够在土壤中扩散， 从而渗透到河流湖泊、地下水，甚至能够渗透到我们的引用水中。根据以前的研宄， 残留在环境中的抗生素可以促进耐药性细菌的发展，而耐药性细菌的衍生又会对 动物以及人类的发展构成威胁 1。他们在水中的潜在存在会使

23、人类慢性低水平的长 期接触到他们，从而对人类的健康产生不可预期的危害 2。四环素是这些应用广泛 的抗生素大家族中的一种。天然的和人工合成的四环素类药物 形成了一个比较大 的药物集团产品。他们针对不同的菌种都有较好的抑制作用：包括革兰式阳性菌、 革兰式阴性菌、衣原体以及立克次氏体等。目前对四环素环境残留的检测方式主要 由以下几种：酶联免疫法 (enzyme-linked immunosorbent assay)3、液相色谱法 (liquid chromatography ) 、液相色谱 -串联质谱法 （ liquid chromatography-tandem massspectrometry)

24、 5和表面等离子体共振生物传感器 （ surface plasmon resonance biosensor) M。 众所周知，这些检测方式具有非常强的可靠性和稳定性。但是它们 的大规模应用却受到了限制，这其中的原因包括：设备的造价较高、操作流程复杂、 样品的准备周期太长需要大量的时间、测量精度不够等。在这样的大背景下，找到 一种能够高效、快速、便捷的抗生素检测方法迫在眉睫。 纳米孔生物传感器以其独特的特点吸引着越来越多人们的注意，如：高灵敏度、 制作成本低廉、可操作性强、测试速度快以及能够在单分子层面进行检测等。随着 纳米技术的不断发展，加工精度不断提高，纳米孔的加工尺寸不断 减小加工精度不

25、 断提高。再加上如今电子信息技术高速发展，电路的集成度不断提高，使得把纳米 孔生物传感器集成到一块电路板上的可能性越来越大。随之而来，使得人们对于把 纳米孔技术应用于个体医疗的兴趣也越来越浓。 1.2纳米孔生物传感器技术概述 纳米孔生物传感器的研宄从库尔特计数的发明就已经开始了，到今天已经有 40年的历史了。多年来，纳米孔的研宄主要集中在三个领域。首先，纳米孔生物 传感器已经应用于单分子水平的研宄，这些研宄提供了有用的生物物理学机制信 电子科技大学硕士学位论文 息，如： DNA分子的折叠和半折叠状态、双链 DNA分子的解旋以及单分子蛋白 于 DNA之间的相互作用等。第二，纳米孔生物传感器可以应

26、用在单分子诊断上， 如 DNA的甲基化，特定短链 miRNA的识别以及对不同大小尺度的生物分子进行 识别。第三，应用纳米孔生物传感器直接对 DNA分子进行测序。 纳米孔既可以嵌入在生物膜中，也可以在固态膜中形成，即纳米孔生物传感器 包括两种：生物孔纳米传感器和固态孔生物传感器。最早的生物孔传感器是由 KaS1an wiCZ课题组报道的在磷脂双分子层中嵌入的 a溶血素。其后几年，很多课 题组陆续报道了在氮化硅 （ Si3N4)或二氧化硅 （ Si02)薄膜上形成纳米孔的方法， 并分析了固态纳米孔取代生物纳米孔的可能性及趋势。对于如何提高纳米孔传感 器系统性能的研宄主要集中在以下几个方面： （ 1

27、)纳米孔的制作方法； （ 2)纳米 孔测量技术； （ 3)数据分析方法； （ 4)更详细的阐明分子相互作用的模型； （ 5) 纳米孔自我修复的化学方法。近几年来，随着对石墨烯、氮化硼及二硫化钼等二维 材料的研宄，已经找到了制备原子级厚度的薄膜和电极的方法。同样的，对于生物 纳米孔传感器的研究也取得了长 足的进步，如细菌噬菌体 plu29接头蛋白的使用提 高了生物孔对双链 DNA的特征识别率。所有这些进步都使离实现纳米孔生物传感 器真正走向医学应用的目标越来越近。总之，纳米孔生物传感器测试技术正处在飞 速发展的时期。相信在不远的将来纳米孔生物传感技术能在生物分子探测、单分子 诊断、 DNA测序以

28、及其他传感领域做出巨大贡献。 本文以四环素为切入点致力于研究利用纳米孔生物传感技术研宄抗生素与蛋 白质或 DNA分子的相互作用，找到抗生素能够有效抑制并消灭病菌的生物机制， 并利用他们之间的相互作用对抗生素类药物在环境中的残 留以及活性变化进行检 测监控。 1.3论文的主要内容和章节安排 针对上述科学问题，本文将对四环素与 DNA和蛋白质的相互作用在单分子 层面进行详细的研究。本文共分为五章，各章节安排如下： 第一章：绪论。简要介绍四环素及各种抗生素在环境中残留的危害和纳米孔 生物传感器的发展现状。明确本文的研宄目的。 第二章：四环素类抗生素及四环素调控系统。介绍四环素抗菌抑菌的药理过 程，然

29、后对四环素调控系统进行讨论。 第三章：纳米孔单分子生物传感器的研宄。介绍纳米孔单分子生物传感器的 分类及工作原理。 第四章：纳米孔的形成与制备。介绍聚焦粒子束加工技术、透射电子显微镜加 2 第一章绪论 工技术及电解质电击穿加工技术。 第五章：以纳米孔为基础的四环素检测技术的研宄。介绍实验的原理并分析 实验结果。 第六章：总结与展望。对本文的内容进行全面总结。 3 电子科技大学硕士学位论文 图 2-1四环素类基本化学结构图 第二草四环素类抗生素及四环素调控系统 四环素类抗生素 (Tetracyclines)是抗生素家族中的一种，它由放线菌产生， 其基本的化学结构如图 2-1所示。根据 R基的不同

30、四环素类抗生素又可分为金霉 素 (CTC)、土霉素 (OTC)、 四环素 (TC)及强力霉素卬 ( )等 71、，具体对应关系如表 2- 1所示。四环素类抗生素具有非常广泛的抗菌作用，他们对几乎所有的医学相关 的好氧菌、厌氧菌以及革兰式阳性菌和阴性菌都有较好的抑制作用。正是因为四 环素类抗生素具有广谱的抗菌作用，对治疗细菌感染有特殊的效果，所以才会被 广泛应用于人类和动物医学中。然而，事物的发展都具有两面性，四环素类抗生 素的广泛应用 确实给人类的健康事业带来了成功，却也带来了严峻的环境问题。 如， 50% 90%的四环素类药物在使用后被排到环境中，而我们对残留在环境中四 环素的行为、浓度、最

31、终去向知之甚少。这些排到环境中的四环素能够渗透到江 河湖泊、土壤、地下水中甚至饮用水中。根据以前的研宄，残留在环境中的抗生 素可以促进耐药性细菌的发展，而耐药性细菌的衍生又会对动物以及人类的发展 构成威胁 1。此外，长期低水平接触四环素也可能给人类的健康带来不可预知的 影响。 4 第二章四环素类抗生素及四环素调控系统 表 2-1 R基与不同种类四环素类抗生素的对应关系 Ri R2 R3 TC H OH H OTC H OH OH CTC Cl OH H DOX H H OH 2.1四环素抑制细菌生长的生物机制 小亚基，或 30s核糖体亚基共有三个特定的结合位点 ： A (aminoacyl)结

32、合位 点 、 P (peptidyl)结合位点和 E (exit)结合位点。其中小亚基的一个最主要的作用 就是通过 A结合位点从众多转运 RNA (tRNA)中识别出与之匹配的 tRNA以确保 蛋白质翻译的过程顺利进行。而核糖体又是很多抗生素的重要靶点，这些抗生素通 过核糖体上的某些特定位点与之结合从而影响蛋白质的合成。四环素能够与 30s核 糖体亚基上的 A结合位点结合并阻止转运 RNA (tRNA)与之结合从而阻断蛋白 质的合成。 2.2 四环素调控系统 （ Tet-off/Tet-on system) 四环素调控系统可能是在哺乳动物基因调控表达系统中应用最为广泛的。四 环素调控表达系统分

33、为 Tet-off系统和 Tet-on系统。这两套系统在不同的实验中都 能高效的控制基因的表达。本文所研宄的主要问题就是建立在 Tet-on系统上的（具 体细节将在后面章节介绍）。下面将对 Tet-oflf和 Tet-on系统做详细的讨论。 2.2.1 Tet-off 系统 tet-off调控系统是由人们在研宄大肠杆菌抗药机制时发现的。四环素阻遏物 (TetR)能够调控四环素耐药蛋白 （ TetA)的表达在没有四环素时， TetR与 TnlO 区域四环素耐药操纵子 TetO结合从而阻止 TetA的合成 9。人们从大肠杆菌的抗 药机制里得到启发从而设计出了四环素调控系统。最初， Tet调控系统只

34、包括两部 分：四环素反式激活因子 (tTA)和四环素反应元件 (TRE)。 前者是由 TetR和 P16(V 5 电子科技大学硕士学位论文 P16)(人类单纯疱毒病毒）的 C-末端构成，后者是人巨细胞病毒启动子 RhCMV*- 1的上游插入七个头尾相连的 TetO序列。其中 TetR引导 tTA与 TetO结合， VP16 则具有转录激活作用；TRE本身启动转录的能力很低，当 tTA存在并与 TetO结合 后，可大幅度提高基因的表达水平。而当四环素存在时，就会阻止 tTA与 TetO的 结合，从而抑制基因的表达，如图 2-2所示。由于四环素的存在阻止了 tTA与 TRE 的结合并抑制基因的表达

35、，所以将此系统称为 Tet-off系统。 2.2.2 Tet-on 系统 Tet-off系统的构建使得人类能够控制特定基因的表 达，但是它也存在着很大 的弊端，如四环素在使用后会存留在组织当中，会影响下一次激活转录的过程从而 降低灵敏度。在某些情况之下需要只在需要的时候开启基因的表达，这就需要在加 入四环素时才能对整个系统起作用。这引发了人们对 TetR系统的研宄热潮，随着 人们对 TetR 了解的不断加深， Tet-on系统迎刃而生。 Tet-on系统的构成基本相同， 不同的是，四环素反式激活因子 （ tTA)换成了反向四环素反式激活因子 （ rtTA)。 rtTA是由 tTA突变而来，如表

36、 2-2所示。其功能作用也与 tTA完全相反：当四环 素存在时 ，促进 rtTA与 TetO的结合从而启动下游基因的表达，而当 四环素不存在时， rtTA与 TetO不结合不启动下游基因的表达，如图 2-3所示。 相对于 Tet-off系统，我们将其称之为 Tet-on系统。本文所研究的的问题就是基 于 Tet-on系统，利用在四环素存在的条件下， rtTA与 TRE的反应来间接达到检 测四环素的目的。 6 第二章四环素类抗生素及四环素调控系统 表 2-2 tTA突变氨基酸 反向四环素反 式激活因子 突变的氨基酸 rtTA EK71 DN95 LS101 GDI 02 rtTA-S2 EG19

37、 AP56 DE148 HR179 rtTA-M2 SG12 EG19 AP56 DE148 HR179 2.3本章小结 四环素类抗生素因其光谱的抗菌作用而被广泛应用于人类和动物医学中。同 时也因其广泛的应用而造成了四环素在环境中的大量残留。这些残留的四环素不 仅能引起抗药菌的发展，同时也在缓慢的影响着人类的身体健康。本章介绍了四环 素类抗生素的作用机理及 Tet-off和 Tet-on系统。该系统主要应用在转基因表达方 面，由于本文只研宄四环素作用下 rtTA与 TRE的结合方式，所以对它在转基因表 达调控方面的应用并没有做过多的介绍。 7 电子科技大学硕士学位论文 第三章纳米孔单分子传感器

38、的研究 敏感度和特异性是影响分子检测、化学探测及疾病诊断的两个重要方面。理想 的敏感度是能够达到单分子检测的水平，而理想的特异性分辨是能够在众多干扰 物质中分辨出目标物质。幸运的是纳米孔技术能够达到这样的检测水平。在有机生 命中，各种不同的生物驱动力和细胞毛孔执行各种生物学功能。这类有效的传输机 制激起了人们对以阻塞调制电流为基础的单分子检测技术的研宄热潮。近十年来， 纳米加工技术和纳米生物技术的发展使得纳米孔技术在单分子检测领域的发展迅 速崛起。这项传感技术己经扩展到医学诊断和第三代高通量测序技术的研宄领域。 3.1纳米孔技术简介 不同离子、 DNA、 RNA、 多肽及其他生物大分子的跨膜运

39、输是一种普遍存在 的现象。这种传输过程包括被动通道运输、离子通道运输以及病毒侵入宿主细胞时 遗传物质的注入过程。这些先进复杂的传输机制引起了人们对纳米孔单分子检测 技术的兴趣。目前，基于纳米孔的检测分析技术因其在多个方面存在着难以置信的 潜在应用而在不同学科当中引起了广泛的兴趣。这些应用包括对小分子物质如离 子、核苷酸、对映异构体等的探测和对大分子物质如 DNA、 RNA和多肽的探测。 纳米孔传感技术是一种不需要生物标记的单分子分辨技术，它不需要对生物分子 进行标记和预处理也不需要信号放大的过程，而且只需要极少的样品即可。纳米孔 的类型包括生物纳米孔和固态纳米孔，他们虽然各有优劣，但是高灵敏度

40、和高分辨 率是他们的共同特征。 3.2纳米孔探测技术的基本原理 纳米孔探测技术的基本原理与库尔特计数器相似。纳米孔的实验装置如图 3-1 (a) 所示，带有纳米孔的薄膜被放置在两个充满缓冲液的腔体之间，这两个腔体 之间的唯一通道就是薄膜上的纳米孔，我们称这两个腔体分别为顺腔体和反腔体。 将带电荷的生物分子放置在 顺腔体之中，在两个腔体之间施加一定的电压就会在 纳米孔中形成一定的离子电流，当生物分子被电场驱动通过纳米孔是就会产生电 流阻塞信号，如图 3-1 (b)所示。不同的生物分子具有不同的构象信息，其与纳米 孔的相互作用力也不相同。因此，当不同的生物分子通过纳米孔的时候就会产生不 同的振幅 （ Amplitude)和阻塞时间 （ Dwelltime)。 因此，通过对堵塞电流信号的振 幅和阻塞时间的分析就可以分辨出不同的生物分子和其构象信息。 8 第三章纳米孔单分子传感