定点突变技术ppt课件.pptx

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1、 基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等基因片断的插入与删除等 根据其特点可将基因突变技术分为两大根据其特点可将基因突变技术分为两大类：类： 位点特异性突变位点特异性突变 定点突变定点突变 随机突变随机突变 定点突变的研究意义 1 对调控区进行突变对调控区进行突变研究基因结构与功能之间的关系研究基因结构与功能之间的关系 2 对编码基因进行突变对编码基因进行突变检验特定残基在蛋白质结构、催检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用。化活性和配基结合能力中的作用。获得突变蛋白。获得突变蛋白。 位点特异性突变的类型 寡核苷酸介导的基因

2、突变寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动用下启动DNA分子进行复制。分子进行复制。 盒式突变盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。应序列。 PCR介导的基因突变介导的基因突变Kunkel 法 在在E. coli中中 dUTP dUMP 在在dUTP 酶缺失体中（酶缺失体中（dut- ） dUTP dUMP 在正常情况下，尿嘧啶糖基化酶在正常情况下，尿嘧啶糖基化酶(ung-)可以

3、去除掺入可以去除掺入DNA中的中的尿嘧啶残基。但在尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。的菌株中，此酶失活。因此因此 在大肠杆菌在大肠杆菌dut- ung-菌株中生长的菌株中生长的M13噬菌体的噬菌体的DNA中将含有中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约链遭到破坏，感染力下降约5个数量级个数量级原理原理 Kunkel 法小结 用此种方法产生的突变体不必利用核苷酸探用此种方法产生的突变体不必利用核苷酸探针标记来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列针标记来筛选阳性噬菌斑，可

4、直接通过序列分析来确定突变体，这样就免除了繁杂的杂分析来确定突变体，这样就免除了繁杂的杂交程序。交程序。 此法的成功关键，是要得到好的含单链模此法的成功关键，是要得到好的含单链模板板DNA。（可用含有目标基因的（可用含有目标基因的M13双链双链DNA 载体感染载体感染E. coli CJ236品系，其为品系，其为dut- ung- 菌株菌株）Oligo诱导突变的改进方法 武汉大学的叶林柏等人对Oligo诱导突变方法进行了改进。2-3个核苷酸替换的突变频率可达80%-85%，即使是需要有道连续4个氨基酸缺失，突变频率也高达40%。原原Kunkel Kunkel 法法改进后的方法改进后的方法DNA

5、DNA聚合酶和聚合酶和T4 T4 连接连接酶同步加入酶同步加入分级退火，冰浴稳固异分级退火，冰浴稳固异源双链再加源双链再加T4 T4 连接酶连接酶直接用反应混合物转直接用反应混合物转染染经酚经酚- -仿抽提后再进行仿抽提后再进行转染转染转染效率：转染效率：3 3个空斑个空斑转染效率：转染效率：7878个空斑个空斑PCR介导的基因突变介导的基因突变 在基因在基因5和和3末端产生突变末端产生突变 重叠延伸重叠延伸PCR 大引物大引物PCR法法 重叠延伸PCR法小结缺点：需要缺点：需要2对引物，进行对引物，进行3次次PCR，并且，并且需要对中间产物进行纯化。需要对中间产物进行纯化。优点：几乎没有特殊

6、限制，而且成功率高，优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛因此运用非常广泛 同时利用重叠延伸同时利用重叠延伸PCR机设可以对基因中机设可以对基因中心区段进行取代、心区段进行取代、插入插入、缺失缺失的突变的突变各种方法的比较寡聚核苷酸介导的突变寡聚核苷酸介导的突变 盒式突变盒式突变PCR介导的突变介导的突变优优点点保真度高保真度高简单易行简单易行突变效率高突变效率高操作简单操作简单突变成功率高突变成功率高缺缺点点操作复杂操作复杂周期长周期长合成多条引物成本合成多条引物成本高高受到酶切位点的限受到酶切位点的限制制后续工作复杂后续工作复杂TapDNA聚合酶聚合酶保真性偏低保真性偏低应用应用 一步反向一步反向PCR法法 Stratagen公司的公司的Quickchange试剂盒试剂盒一种简便快速的定点突变的方法一种简便快速的定点突变的方法 Stratagen公司研制的公司研制的Quickchange试剂试剂盒盒,可以双链可以双链DNA质粒为模板质粒为模板,只需一对只需一对引物，进行一次引物，进行一次PCR,在在12d内即可完内即可完成点突变过程。成点突变过程。