木瓜蛋白酶提取实验方案计划.doc

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1、-/实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、 实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶（papaya proteinase）、木瓜凝乳蛋白酶M（c

2、hymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般39.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为5560（一般1085皆可），耐热性强，在90时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异

3、而分离的方法。有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐析时溶液PH在木瓜蛋白酶等电点时（PI=8.75）则效果最好，盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使

4、蛋白质变性而应用最广。木瓜蛋白酶活力测定：蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯乙酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯乙酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。酶活力单位定义：在规定条件下，1min内酶水解酪蛋白释放出相当于1ug/ml

5、酪氨酸在275nm波长处的吸收度为1个活力单位。以0.1mol/l盐酸溶液做空白，在275nm波长处测定空白溶液，待测定液，对照品溶液的吸光度。饱和硫酸铵溶解曲线：二、实验材料与仪器：材料：未成熟的番木瓜，无水乙醇，0.05mol/L磷酸氢二钠; 0.1mol/L HC1，乙二胺四乙酸二钠固体；氢氧化钠固体，酪蛋白固体，半胱氨酸固体，氯化钠固体，三氯乙酸固体，硫酸铵粉末，乙酸钠固体，和冰乙酸溶液，EDTA。仪器：高速组织捣碎机，水浴箱，精确pH计，紫外分光光度计，高速冷冻离心机，精密电子天平，低温冰箱。三、技术路线四、实验步骤4.1实验前准备：所需试剂的配制以及考马斯亮蓝G-250法测蛋白含量

6、的预实验，确保试验方法的可行性。考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。标准蛋白质溶液（0.1mg/mL）:准确称取牛血清蛋白0.01g用蒸馏水溶解并稀释到100mL。现配现用。酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中

7、。500ml的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取10g的碳酸氢钠和0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。500ml的1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。酪蛋白溶液：称取酪蛋白0.6g加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液80mL（取1.433g磷酸氢二钠固体加80mL蒸馏水即得溶液），置沸水浴中煮30min，时时搅拌，冷却至室温。加1M盐酸调节PH至7.00.1 。加蒸馏水稀释到100mL。用前配置。酶稀释液：A液 称取半胱氨酸0.264g，氯化钠

8、1.17g，加蒸馏水25mL溶解 ；B液 称取乙二胺四乙酸二钠0.112g，加蒸馏水10mL溶解；合并A、B液，搅拌均匀，用4.0mol/L氢氧化钠溶液调节PH值到5.5，加蒸馏水稀释至50mL 。用前配置。三氯乙酸溶液：取三氯乙酸0.9g，加乙酸钠1.495g和冰乙酸0.95mL，加水溶解并稀释至50mL。4.2木瓜蛋白酶提取4.2.1粗酶液提取：用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为23mm，根据果实大小的不同，每个果实可以510条刀口。将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。浆液用8层纱布进行过滤

9、,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20存取10ml酶原液（编号为酶液1）。4.2.2粗酶液纯化：将粗液放入冰桶中，加入适量酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.004mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。酶液+保护剂（ml）硫酸铵粉末（至终浓度20%）（g）硫酸铵粉末（至终浓度的40%）（g）酶液+保护剂（ml）冷无水乙醇（65%）（ml）酶原液370+10148.6调节ph为6.0，4静置过夜酶原液470+10置于冰桶中20静置30min，离心4000r/min，30min，弃沉淀2

10、2静置30min，离心4000r/min，30min，取沉淀，加10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液2），-20保存9+118.6对过夜的酶液继续处理酶液+保护剂（ml）硫酸铵粉末（至终浓度20%）（g）硫酸铵粉末（至终浓度40%）（ml）酶原液34静置过夜4000r/min 离心 30 min ,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液3），-20保存9+1置冰桶中2.5静置30min,离心4000r/min,30min，弃沉淀2.7静置30min,离心4000r/min,30min，取沉淀，加入10ml蒸馏水取1ml酶液（酶液4），-20保存透析袋处理取酶液并编号酶液6，-20保存酶原

11、液4编号酶液5，-20保存透析袋处理取酶液并编号酶液7，-20保存4.2.3透析：8000-14000标号的透析袋处理：取透析袋剪成适当长度的小段。 放入大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。用蒸馏水彻底漂洗透析袋。放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套，在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。系好透析袋的一端，从另一端注入酶液4、5，将透析袋放入蒸馏水中，在摇床上震荡，时时换蒸馏水。直至向蒸馏水中加入氯化钡溶液，无沉淀产生及

12、透析除盐完成。取出蛋白质溶液。60%乙醇透析膜处理40%硫酸铵45%饱和硫酸铵60%乙醇酶液1酶液3酶液4酶液2酶液5酶液6酶液7番木瓜透析膜处理4.3木瓜蛋白酶活性及总蛋白含量测定：4.3.1酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.3ml酶液，加酶稀释液2.7ml，稀释至3mL。操作 待测液：准确量取酶液溶液各1.0mL，分别置于2支10mL带塞试管中，于50度水浴预热5分钟，准确加入50度预热的酪蛋白溶液5mL，立即振摇，置50度水浴中，精确反应10min后

13、，加三氯乙酸溶液5.0mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A。 空白对照液：再精确量取酶液1.0mL，置于10mL具塞试管中，于50度水浴预热5min，准确加入50度预热的蒸馏水5ml, 置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A0。 酪氨酸标准液：另取酪氨酸对照溶液，以蒸馏水为空白，在275nm的波长处测定吸光度An。酶活力单位定义为在测定条件下,每1 min生成1g/mL酪氨酸所需的

14、酶量。公式： 酶活力（U/g）= 式中:1酪氨酸标准液每1中含酪氨酸的量,单位为微克();10反应时间;11测定总体积;n待测液的稀释倍数;1000毫克与克的转换倍数。在上述条件下,每分钟水解酪蛋白生成1酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位。4.3.2酶含量的测量：取8支15 mL试管，按下表加入试剂管号12345678蛋白质标准溶液（ml）00.10.20.30.40.60.81.O蒸馏水（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考马斯亮蓝（ml）4.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白质含量（ug）0102030406080100A595将试管摇匀，放置2-3分钟。用分光光度计比色测定吸光值A595nm。(注意应在1小时内完成比色)，以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。对酶液进行稀释，统一酶液体积至100ml：分别取1ml 酶液1、酶液2、酶液3、酶液4、酶液5、酶液6于6支干净离心管中稀释至10ml（相当于木瓜蛋白酶溶于100ml蒸馏水中），再进行下步处理。 用倍比稀释的方法找出酶液测吸光度的最适倍数，使再重新取样测量，取1ml酶液于试管中，再加4ml考马斯亮蓝溶液，混匀，静置5min后在A595下测吸光度，再根据标准曲线算酶含量。