基于纳米孔和纳米阵列的单分子DNA测序技术基础研究_王跃.docx

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1、上海交通大学硕士学位论文 基于纳米孔和纳米阵列的单分子 DNA测序技术基础研究 上海交通大学农业与生物学院 2014年 01月 姓 名：王跃 专 业：园艺学 学 号 ： 1111509023 研究方向：单分子 DNA测序技术 指导导师：王志民研究员 Dissertation Submitted to Shanghai Jiao Tong University for the Master of Science Degree PRELIMINARY STUDIES OF SINGLE-MOLECULE DNA SEQUENCING TECHNOLOGIES BASED ON NANOPORES

2、AND NANO ARRAY Candidate: Yue Wang Speciality: Horticulture Student ID: 1111509023 Research: Single-molecule DNA sequencing Supervisor: Prof. Zhimin Wang Shanghai Jiaotong University School of Agriculture and Biology Jan., 2014 上海交通大学硕士学位论文 基于纳米孔和纳米阵列的单分子 DNA测序基础研究 摘要 纳米孔测序是最有望实现 $1 ， 000 Genome 目标的

3、技术之一。近年来，研究较 多的纳米孔有蛋白质纳米孔和硅基材料的固态纳米孔。蛋白孔寿命比较短，而基于 硅基底的固态纳米孔深度显著超过单链 DNA相邻碱基的间距，所以，无法实现 DNA 的单个碱基的分辨。作者用聚焦离子束先制造氮化硅基底，并在该基底上铺设石墨 烯，再用聚焦电子束刻蚀石墨烯，获得直径 10 nm以下的纳米孔，初步检测了 DNA 穿越纳米孔时产生的电信号，向单层石墨烯纳米孔测序 DNA迈出了一步。 此前，我们已提出外切酶 -纳米孔测序方法，即跨膜电场下外切酶在负极降解单 分子 DNA,释放的 4种带负电荷脱氧核苷 5_ 一磷酸 （ dNMPs)有序穿越纳米孔， 它们因空间结构不同，过孔

4、时的 /b (阻滞电流）各异，也能解决相邻碱基不易单独 识别的问题。通过对单壁碳纳米管 （ SWNT)的选择与纳米孔切片厚度的控制获得 实验需要的纳米孔孔径和孔深，我们检测了 dNMPs的电信号，并对其进行了初步 分析。 同时，我们设计了单分子纳米坑阵列芯片，它将使第二代测序中的多分子扩增 芯片单分子化，从而将二代测序升级为更为有效的第 3代测序技术。制备单分子芯 片的第一步是获得单根 DNA-STV复合物，带生物素 （ biotin)的 DNA与抗链霉生 物素 （ streptavidin, STV)复合会出现五种结构，通过琼脂糖凝胶电泳及电洗脱， 获取单根 DNA-STV复合物；其次，在超

5、薄平整石英 （ quartz)表面 采用离子溅射 （ ion sputter)镀金膜约 30nm厚，然后采用聚焦离子束刻蚀表面金膜，打出间距 500 nm 的直径约 30 nm的纳米坑阵列，获得设计的纳米坑基底；最后，对石英表面功能化 并将 DNA-STV复合物进行荧光染料处理之后固定进纳米坑，紧接着采用全内反射 突光显微镜 （ Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, TIRFM)进行焚光检 测。 关键词：单分子，测序，芯片，纳米孔，纳米阵列，石墨烯，单壁碳纳 米管 上海交通大学硕士学位论文 PRELIMINARY STUDIES

6、OF SINGLE-MOLECULE DNA SEQUENCING TECHNOLOGIES BASED ON NANOPORES AND NANO ARRAY ABSTRACT Nanopore sequencing is among the most convincing technologies to achieve the goals of the $1,000 genome. Two major types of nanopores， protein and silicon-based solid-state pores, have been extensively investga

7、ted. However, protein pores are short-lived and the solid-state nanopores are deeper than the distance between adjacent bases, resulting in incapability to discriminate individual bases along the single-stranded DNA (ssDNA) molecules. In this dissertation, we report X-DNA translocations through grap

8、hene nanopores. Silicon nitride substrates were first fabricated using focused ion beam (FIB), individual graphene membranes were suspended onto the substrates, and nanopores with a diameter less than 10 nm are sculpted by focused electron beam (FEB) from a transmission electron microscope (TEM). Th

9、e signals of DNA translocation through nanopores had been recorded, leading a step toward single-molecule DNA sequencing using graphene nanopores. We have previously designed an single-molecule DNA sequencing method using nanopores made of single-walled carbon nanotube (SWNT) assisted with exonuclea

10、ses. The four kinds of enzymatically released 2-deoxyribonucleoside 5 monophosphates, or dNMPs dAMP， CMP， dGMP， and dTMP which are negatively charged in a solution under neutral to higher pH, will sequentially pass through the nanopore while migrating from the cathode to the anode, when they are dri

11、ven by an applied electric field. Different kinds of dNMPs will leave a distinct signature because of their distinctive spatial configurations. We used SWNT nanopores to control the two dimensions (diameter and length) of the nanopores. The advantages of such pores includes as high as thousand times

12、 of aspect ratio, which, in combination with atomic smoothness of the inside wall of the pore, would pomise a high detection accuracy, and resovle the incapability of base-by-base discrimination in DNA sequencing by threading with solid-state nanopore, which is too deep for individual base identific

13、ation . We have obtained some preliminary results in this experiment. Another part of this dissertation, fabrication of single-molecule chips was performed -VI- 上海交通大学硕士学位论文 in order to upgrade chips used in second-generation sequencing into those in the third-generation. Biotinylated DNA molecules

14、were conjugated to streptavidin (STV). Conjugates containing single DNA molecule were separated from the mixture through electrophoresis in agarose gels, and were labeledd with DNA dyes. Nanowell arrays with diameter of about 30 nm to hold single DNA-STV conjugates were fabricated on quartz substrat

15、es, which was covered with a layer of ion-sputtered gold film (around 10 nm of thickness), by using FIB to drill nanoholes through the gold film till quartz substrate with a center-to-center periodic distance of 500 nm. Then, bottom quartz in nanowells were functionalized with biotin. Conjugates wer

16、e loaded onto the nano well array followed by characterization by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM). KEYWORDS: Single-Molecule, Sequencing, Chip, Nanopore, Nanoarray, Graphene, Single-Walled Carbon Nanotube (SWNT) 上海交通大学硕士学位论文 目录 第 1 章绪论 . 1 1.1弓丨 W . 1 1.2 DNA测序技术进展 . 2 1.2.

17、1 Sanger双脱氧终止法测序技术 . 2 1.2.2第二代测序技术 . 4 1.2.2.1基于边合成边测序的二代测序技术 （ sequencing by synthesis, SBS) . 4 1.2.2.1.1 Illumina 公司的 Solexa 技术 . 4 1.2.2.1.2罗氏公司的焦磷酸测序技术 （ 454) . 5 1.2.2.1.3基于公式一的其他 SBS测序方法 . 7 1.2.2.1.4基于可逆染料的 SBS测序方法 . 8 1.2.2.2 基于连接法的二代测序技术 （ sequencing by ligation, SBL) . 9 1.2.2.3 基于杂交法测序的

18、二代测序技术 （ sequencing by hybridization, SBH) .11 1.2.3第二代测序技术 . 11 1.2.3.1单分子合成测序技术 . 11 1.2.3.1.1分步合成测序 . 11 1.2.3.1.2实时检测测序 . 13 1.2.3.2纳米孔测序技术 . 15 1.2.3.2.1纳米孔直接测序 . 15 1.2.3.2.2结合纳米孔的其他测序技术 . 20 1.2.3.3显微镜类单分子测序 . 23 1.3研究内容 . 26 第 2章基于纳米孔的单分子 DNA测序基础研究 . 28 2.1材料与仪器 . 28 2.1.1实验材料与试剂 . 28 2.1.2实

19、验仪器 . 29 2.2 施 . 30 2.2.1氮化硅基底的制备 . 30 2.2.2石墨烯的制备与转移 . 31 VIII _上海交通大学硕士学位论文 _ 2.2.3石墨烯纳米孔的制备 . 31 2.2.4半导体单壁碳纳米管 （ S-SWNT)纳米孔的制备 . 31 2.2.5纳米孔膜片钳检测装置 . 33 2.2.5.1膜片钳装置搭建 . 33 2.2.5.2 DNA穿越石墨烯纳米孔实验 . 34 2.2.5.3 dNMPs穿越 SWNT纳米孔实验 . 34 2.3结果与分析 . 34 2.3.1 DNA穿越石墨烯纳米孔 . 34 2.3.1.1氮化硅基底的制备与表征 . 34 2.3.

20、1.2石墨烯纳米孔表征 . 35 2.3.1.3 1-DNA穿越石墨烯纳米孔的初步信号检测 . 36 2.3.1.4 DNA穿孔噪音分析 . 38 2.3.2 dNMPs 穿越 SWNT 纳米孔 . 39 2.3.2.1 SWNT的结构表征 . 39 2.3.2.2 dNMPs 穿？ L检测 . 41 第 3章基于纳米阵列的单分子 DNA测序基础研究 . 44 3.1材料与仪器 . 44 3.1.1实验材料与试剂 . 44 3.1.2实验仪器 . 45 3.2 施 . 46 3.2.1纳米坑阵列的制备 . 46 3.2.1.1石英基片的清洗 . 47 3.2.1.2表面镀金膜 . 47 3.2

21、.1.3表面金膜粗糙度表征 . 47 3.2.1.4纳米坑阵列的制备 . 47 3.2.2 DNA-STV复合物的制备 . 47 3.2.2.1 biotin-dsDNA 的制备 . 48 3.2.2.2 DNA-STV 的结合 . 48 3.2.2.3 DNA-STV 的分离 . 49 3.2.3 DNA-STV的初步穿孔实验 . 49 3.2.4纳米坑固定 DNA-STV的化学处理 . 49 3.2.5纳米坑固定结果的检测 . 50 IX _ 上海交通大学硕士学位论文 _ 3.2.5.1AFM 检测 . 50 3.2.5.2TIRF 检测 . 50 3.3结果与分析 . 50 3.3.1

22、dsDNA产物纯化及浓度测定 . 50 3.3.2 dsDNA-STV结合物的琼脂糖电泳与 AFM检测 . 51 3.3.3 dsDNA-STV复合物的电泳分离 . 53 3.3.4 DNA-STV的初步穿孔数据及分析 . 54 3.3.5纳米坑的表征 . 55 3.3.6纳米坑 dsDNA-STV固定结果 . 56 第 4 章结论 . 59 4.1总结与分析 . 59 4.2进一步工作研究 . 61 参考文献 . 63 甜射 . 77 攻读学位期间的学术成果目录 . 78 上海交通大学硕士学位论文 第 1章绪论 1.1引言 当前， DNA测序技术种类繁多，包括业已商用的一代 Sanger测序

23、技术、二代 经扩增的整体信号测序技术和第三代单分子测序技术。 广义的讲，新一代测序技术通量的大幅度提高，其关键也是采用了生物芯片技 术。当前所有的二、三代测序仪所 采用的并行化技术，包括光纤微阵列（罗氏 454)、微米珠阵列 （ SOLiD)、 DNA 纳米球阵列 （ Complete Genomics)、 半导体微米坑阵列 （ ion torrent)、 分子簇阵列 Ollumhia)和零模波导阵列 （ PacBioRS II)等，都属于生物芯片技术。因此，才使 测序通量在基于毛细管阵列基础上提高了 4-5个量级，费用降低了 约 5个量级。但 迄今为止，二代测序技术都还不能同时满足测序界提出

24、的四项黄金标准，即测序结 果的高精度、高通量、长片段和低费用。准确率决定可靠性，读长决定序列组装的 难易程度及其完整性，通量决定临床测序可行性，费用决定临床测序能否大众化， 所以，评价任何测序技术需同时采用这 4项黄金标准。 单分子测序即第三代测序，是利用不同的技术手段实现对逐条 DNA中单个碱 基的识别，包括单分子合成测序技术、单分子直接测序技术、纳米孔测序技术以及 纳米孔辅助测序技术等，有望满足上述的黄金标准，具有广泛的潜在应用前景。 DNA测 序的一大应用即在医学领域， DNA测序是检测 DNA变异的最基本手段， 如 SNPs、CNVs、 Indels等都与遗传疾病相关联。因此，利用 D

25、NA测序技术对遗传 疾病进行早期诊断，了解人类遗传疾病的机制，并为诊断和治疗提供依据。 2009年， 测序用于先天性氯腹泻的诊断 1,标志着个性化测序遗传诊断时代的到来； 2010年 测序用于指导癌症治疗方案的制订 2，标志着个性化测序临床应用时代的到来。 对于第三代纳米孔单分子测序技术，由于单分子水平、实时检测、价格低廉、 无须扩增转化等优点，除了直接与测序相关的医学应用 ，还能有其他应用 。 Dmdh 小组对 miRNA的纳米孔检测就发现其灵敏度要显著高于传统方法 3，这会使 miRNA 表达谱分析更快。Timp小组还将纳米孔分析应用到了 SNP分析上 4，采用限制性内 上海交通大学硕士学

26、位论文 切酶与 DNA复合物穿孔状态分析阈值电压变化可以获取 SNP信息。 Meller小组则 试图采用PNA与基因组 DNA结合分析病毒与人类病原体的基因型 5，当与 PNA结 合后， DNA穿孔事件会导致二级信号的产生，这种信号将来可用在各种不同基因组 的识别上。不仅如此，纳米孔还可以作为其他分子的检测平台，即使用纳米孔的检 测物范围也不断扩大，从传统的碱基同聚物 6_8、到多肽 9、蛋白质 1()_12、金纳米颗 粒 1314、有毒分子 15等。 DNA测序技术的另一重要意义即其经济价值。仅癌症测序，目前的市场已达几 十亿美元 16; Pacific BioSciences发起人 S.

27、Turner估计 2019年前全球测序仪市场将 达 500亿美元 17，华大基因估计中国测序市场有 Y1万亿、 2011年 7月，剑桥健康 研究所 （ Cambridge Healthtech Institute, CHI)专业市场服务部市场研究组对 1400 多人做的测序市场调查分析显示，大多数人认为， 5-10年内测序市场将增加到 1000 亿美元 /年 1 2。 1.2 DNA测序技术进展 针对测序技术有不同的划分方法， 2006年 H. Bayley将传统的 Sanger测序称为 第一代测序技术，将 Sanger以外的扩增大量 DNA拷贝后测序的方法统称为第二代 测序技术，而单分子测序

28、则归为第 H代测序技术 18，这是目前比较公认的分类方法 19, 20 O 1.2.1 Sanger双脱氧终止法测序技术 第一代 DNA测序方法主要有 Sanger法 21， 221和 Maxam-Gilbert法 23。后来在应 用上，由于 Maxam-Gilbert法要过多地使用有毒化学物且无法很好的提高通量导致 其发展受限。 Sanger双脱氧终止法测序技术由 F. Sanger发明 21， 22,其主要依据是 DNA在复 制过程中由于随机加入 DNA聚合酶的双脱氧三磷酸核苷酸 （ ddNTP)缺少 3 -OH, 因而不具有与DNA链末端的脱氧三磷酸核苷酸 （ dNTP)反应生成磷酸二酯

29、键的能 力，故而会终止 DNA链的延伸。将每个 ddNTP都连接上放射性同位素（后来发展 为荧光标记分子 )，就可以在 Sanger法中设置 4个平行的 DNA复制反应， DNA链 会随机在 A、 G、 C、 T四个位置终止；随后在不同的泳道中，这些终止反应的大小 1http:/ 2http :/www.ddn. com/pdfs/Future-of-NGS-Study-2011 pdf 上海交通大学硕士学位论文 不一的 DNA片段可被具有单核苷酸分辨率的凝胶区分，从而获取放射自显影凝胶 图像。如此，就可总体读取原 DNA链的序列了，其基本原理如图 1-1: 图 1-1 Sanger法 DNA

30、测序技术 3 Figure 1-1 Sanger (dideoxy) sequencing3 Sanger测序法后来逐渐替代了之前使用的凝胶自显影系统而改为采用毛细管电 泳法 24，大大降低了试剂的消耗并使得自动化程度大幅度提高 25。第一代 Sanger 测序法现在还逐渐引入了微流控系统 26，从而能把热循环、样品纯化、毛细管电泳 集成到硅基芯片上并使用纳升样品。这相对于自动化 DNA测序仪又大大前进了一 步。 虽然第一代测序技术使人类基因组计划得以实现 27, 28，但总结起来有如下缺 点：费用高、读长短、速度慢，限制了在多个领域的推广应用，比如很难大规模筛 查致病基因。因此，很多科研院校

31、和公司试图开发 新技术来满足更高的测序要求， 特别是在美国国立卫生院 （ The National Institutes of Health, NIH)下属的人类基因 组研究所 （ The National Human Genome Research Institute, NHGRI)于 2004 年启动 了 $1 ， 000 Genome 计划，提出在大约 10年内，使哺乳动物大小的基因组测序费 http:/ 上海交通大学硕士学位论文 用降低到约 $1， ,同时保证高通量，准确率达 99.99% (后提升为每 10000个碱基 的错误率不超过 1)，基本无缺口，这就是业内所称的四项 黄金标准

32、 ，在 NIH和 许多私人公司的巨额投入下，加速了第二代高通量测序技术的诞生。 1.2.2第二代测序技术 实际上，在第一代测序技术大力发展自动化的同时，很多大规模并行化的第二 代测序技术的基础研究就已开始，包括合成法测序 （ sequencing by sythesis,简称 SBS,它包括 Solexa公司的荧光标记末端终止测序 29和 454 Life Sciences的焦鱗酸 测序 pyrosequencing) 3，哈佛大学 Church课题组的连接法测序 （ sequencing by ligation, SBL) 31、 杂交测序法 （ sequencing by hybridiz

33、ation, SBH) 32 33、 质谱法 34，等。这些前期的技术发展为后来广为应用的二代测序技术奠定了基础。 本节除了简要综述市场 上广泛应用的三款第二代测序仪之外，还将介绍其他二 代测序技术，其中有些技术经过改进升级有望转换为第三代测序技术。 1.2.2.1基于边合成边测序的二代测序技术 （ sequencing by synthesis, SBS) DNA边合成边测序技术主要依赖 DNA聚合酶和 dNTPs或其类似物，严格讲， 与 Sanger双脱氧终止法相似，关键在于通过对 DNA合成过程中的产物进行检测， 从而获得与此对应的碱基信号（公式 1-1): PoleEnerase (D

34、NA)n + dNTP * - (DNA)n+1+ PPi +AT + ApH (1-1). 1.2.2.1.1 Illumina 公司白勺 Solexa 技术 Genome Analyzer是基于 Solexa技术体系的 SBS测序产品。它的基本流程包括 文库构建、 DNA进入流室、桥式扩增 36、双链 DNA变性、使用 SBS法测序。具体 来说就是：一，将待测 DNA打断为小片段，并在两端加入接头，构建 ssDNA文库 ; 二，通过与流室中的接头反应，将 ssDNA固定到流室 channel中；三 :#加入 DNA 聚合酶和 dNTPs,使得以流室表面的接头为模板而把 ssDNA扩增为桥式

35、 dsDNA(图 l-2a);四，对于桥式扩增的结果进行变性，形成 ssDNA束（图 l-2b)， 以便达到后 期检测所需的信号强度 （ ensemble signal);五，向 channel中添加 DNA合成反应所 需的聚合酶、引物和四种不同荧光标记的 3 -OH被保护的四种 dNTPs类似物（因此 每轮 DNA聚合反应，只能添加一个 dNTP)(图 l-2c)， 然后在添加完成后，洗掉多 余反应物，采用荧光信号记录读取碱基，之后去除 3 -OH保护团，实现下一轮测序 反应。 上海交通大学硕士学位论文 图 l-2Solexa桥式扩增测序技术 36 Figure 1-2 Bridge Amp

36、lification of Solexa sequencing1361 1.2.2.1.2罗氏公司的焦磷酸测序技术 （ 454) 比较成熟的焦磷酸测序 37技术由 454 Life Technologies创始人 Jonathan Rothberg 及其同事于 2005年报道 38，后被罗氏公司收购。焦磷酸技术的基本原理是，每次 只向模板 DNA加入一种 dNTP使引物延伸，进行测序 ;只有与模板互补的一种 dNTP 可加入延伸的链上， DNA聚合反应的产物之一是焦磷酸 （ PPi,见公式 1-1),从 PPi 开始发生一系列酶促反应而发光（图 1-3),因此，配对的 dNTP的结合能通过发光 量而检测；未结合的 dNTP和 ATP被 ATP酶降解； 4种 dNTPs依次重复该反应，记 录下加入后有发光反应的 dNTP顺序，再根据 Watson-Crick配对原理，解读出模板 序列。由于高度并行化，测序通量比第一代测序仪提高了 100多倍，目前测序长度 也与第一代测序仪相当。 上海交通大学硕士学位论文 图 1-3焦