流式细胞仪检测细胞周期操作技巧步骤.doc

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1、.-流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）特定时间后终止培养，进行下一步的实验收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中1000rpm离心5min（短时低速离心）弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4固定30min,或-20长期保存。1000r/min,离心5min将乙醇吸除，加PBS清洗混匀1000r/min,5m

2、in再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37下孵育30min)加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管提前一天网上预约开机（先开仪器后开软件）流式细胞仪的结构一般分为5部分：流动室及液流驱动系统； 激光光源及光束成形系统； 光学系统； 信号检测、存贮、显示、分析系统； 细胞分选系统。检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上流动室内充满鞘液，细胞排成单列由

3、喷嘴中心喷出，形成细胞液柱液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析Modfit软件分析Flowjo软件分析FCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。G0/1和G2M 细胞峰的 DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布检测结果刻录光盘保存关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）正常细胞DNA含量：2n-4n凋亡细胞：核

4、内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少。PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的分布区（亚G1峰）。1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数； 2、横坐标DNA Content：即DNA含量； 3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；Annexin V-E

5、GFP/PI双染法检测细胞凋亡基本原理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素（Annexin）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。正常细胞：膜完整，PS不外翻PI-/Annexin-凋亡早期：膜完整，PS翻转PI-/Annexin+凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加PI+/Annexin+坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻PI+/Annexin+ 几乎不存在膜结构PI+/Annexin-实验步骤：取对数生长期的细胞，按1106 cells/ mL以1mL接种于培养皿内24h后，进行所需的处理

6、（比如加入药物）特定时间后终止培养，进行下一步的实验细胞用0.25%胰酶37消化5min(胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）加入PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮）将细胞悬液移入15ml离心管中2000rpm离心5min,PBS吸除用PBS 清洗细胞2次（2000rpm，离心5min收集细胞）用400ul 1Binding Buffer 悬浮细胞(浓度大约为1106 cells/ml)在细胞悬液中加入5ul Annexin V-EGFP，轻轻混匀后于2-8避光条件下孵育15 min加入10ul PI 后轻轻混匀,于2-8避光条件下孵育5 min在1 h内用流式细胞仪检测 流式细胞仪激发光波长采用Ex.= 488nm双波长激发，Em.= 510 nm检测EGFP荧光(FL1 channel)和575 nm的发射波长检测PI。细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-。