2022年细胞冻存、解冻方法与细胞计数 .pdf

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1、一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650) 、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020) 、0.4（ w/v ）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法：（1）传统方法 : 冷存管置于410 分钟 -2030 分钟 -80 16 18 小时 ( 或隔夜 )- 液氮槽 vaporphase长期储存。-20不可超过1 小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡， 亦可跳过此步骤直接放入-80 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降

2、温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3 /分钟之速度由室温降至（-80 以下）-120 ，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：（1）冷冻前24-48 小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（ DMSO）至 20% 浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液( 约 0.1ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，

3、制成细胞冻存悬液（DMSO 最后浓度为510） ，使细胞浓度为1 5106cells/ml ，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 2ml/vial ，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后， 注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase) 且存活率高之状态，约为8090致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70 度可保存数月。（3） 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级， 无菌且

4、无色(以 0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以 510ml 小体积分装， 4避光保存，勿作多次解冻。 Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO 直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO 可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10% 甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：normal human fibroblast:13106cells/ml hybridoma:1

5、3106cells/ml ，细胞浓度不要太高，某些 hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻 24 小时后死去。adherent tumor lines:5 7106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而 HeLa 只需 13106cells/ml other suspensions:510106cells/ml ，human lymphocyte须至少 5106cells/ml 。（5）冷冻保护剂浓度为5 或 10 DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用10% 90% 的血

6、清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20% 终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4 度时）， 复苏存活率在80% 90% 以上，对原代培养细胞， 以 90%名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白

7、质)。3、材料37恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管 / 培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于37水槽中回温，回温后喷以70% 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入37水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以70% 酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内( 稀释比例为1:10 1:15) ，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。取0.1ml

8、 解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如 DMSO 或 glycerol) ，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm ，5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers ，每个 chamber中细刻 9 个 1mm2 大

9、正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1mm 。当 chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2 0.1mm=1.0 x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104 ，即为每ml 中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dyeexclusion ，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整， 染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue ，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数） 100% 。计数应在台盼兰

10、染色后数分钟内完成，随时间延长， 部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)； Erythosin bluish stain ；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa+/Mg+freesaline； 血 球 计 数盘 及 盖 玻片 (Hemocytometerandcoverslip)； 计

11、数器(counter) ； 低倍倒立显微镜； 粒子计数器 (Coultercounter,CoulterElectronics)。 白细胞稀释液 （4%乙酸溶液）。3、步骤：（1）取 50l 细胞悬浮液与50l trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。（2）取少许混合液(约 15l)自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 -

12、- - - - - - - - 显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色( 或红色 -Erythrosin bluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与 trypanblue等体积混合 )，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞 (或计下线与左线之细胞)。注 ： 4大 格 细 胞 总 数 稀 释 倍 数 104/4=细 胞 数 /ml； 每 一 大 格 的 体 积=0.1cm 0.1cm 0.01cm=10-4ml 计数板计数时，最适浓度为510105 细胞 /ml ，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞

13、悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成 10ml 细胞悬浮液，取0.1ml 溶液与 0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数 / 方格： 55， 62， 49，59；死细胞数/方格： 5，3，4，6；细胞总数=243 平均细胞数 /方格 =60.75 ；稀释倍数 =2 ；细胞数 /ml ：60.751042（稀释倍数）=1.22 106 ；细胞数 /flask （10ml ） ：1.22106 10ml=12.2 106 存活率： 225/243 92.6%名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -