2022年微生物实验 .pdf

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1、感受态细胞的制备与转化（一)实验目的掌握细菌感受态细胞的常规制备方法和转化方法。（二)实验原理转化率的高低与受体菌的感受态有关，只有处于感受态的细胞才能摄取外源DNA 分子。用预冷的CaCl2 溶液处理对数期的细胞培养物，可诱导细菌产生短暂的感受态， 在此期间， 它们易于接受外来 DNA 。转化混合物中的DNA 形成抗 Dnase的羟基 钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42短暂热击后，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后， 球状细胞复原并分裂繁殖，被转化的细菌中，如果外源DNA 中的基因在转化的细菌中得到表达，在选择性培养基上，可选出所需转化子。（三)实验器材(1)活材料：大

2、肠杆菌DH5 、HB101，质粒 pKS 和 pKS 加外源 DNA 的酶连产物。(2)培养基：1)SOC培养基：蛋白胨（ bacto-tryptone）20g 酵母提取物 (bacto-yeast extract) 5g NaCl 0.5g 250mmol/L KCl 10mL 2mol/L MgCL2 5mL 超纯水 950mL 用5mol/LNaOH 调 pH至 7.0， 0.1MPa灭菌 20min， 降温至 60以下， 经 0.22 m滤膜过滤除菌的 1mol/L 的葡萄糖 20mL，使糖浓度为 20m mol/L 2) 2 TY 液体培养基：胰蛋白胨 (bacto-tryptone

3、) 16g 酵母提取物 (bacto-yeast extract) 10g NaCl 5g 水 1000mL, pH7.2，121灭菌 30min 3）LB 固体培养基的配制：名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 胰蛋白胨 (bacto-tryptone) 10g 酵母提取物 (bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g 琼脂粉 15g 水 1000mL, pH7.2，121灭菌 30min (3

4、) 试剂：氨苄青霉素 (Amp)：使用前用无菌纯水配制母液，浓度为100mg/mL。X-ga1(5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖 )：用二甲基甲酰胺配成20mg/mL 溶液(不需过滤 )。1mol/L CaCl2：在 200mL 纯水中溶解 54g CaCl2.6H2O，用 0.22 m 滤器过滤除菌，分装成 1mL 小份，贮存于 -20。IPTG(异丙基硫代 - -L-半乳糖苷，相对分于质量为238.3)，在 8mL 超纯水中溶解2gIPTG，用超纯水定容至10mL，用 0.22 m 滤膜过滤除菌，分装成lmL 小份贮存于-20(4)器材：三角瓶、 1.5mL、50mL 离心管、平

5、皿、微量移液器等。（四)实验方法(1)感受态细胞制备：1)从保藏的甘油管 (-40)挑取大肠杆菌 DH5 划线于 LB 平板上，在 37恒温培养过夜 (16-18h)。2)挑取单菌落于 50mL LB 培养基中 37、200 r/min 培养 3-4h，至出现薄雾状菌悬液即可。3)将培养液置于冰上预冷15min，并间断轻轻摇动。4)将冷却的培养液倒入己在冰上预冷的50mL 离心管中。5)在冷冻离心机中离心， 4 3000r/min 5min。6)弃上清、加入 15mL 冰上预冷的 0.1mol/L CaCL2 溶液,轻轻旋转，使细胞充分重新悬浮，冰上放置20-30min。7)于 43000r/

6、min 离心 5min。8)弃上清，加入 2mL 冰上预冷的 0.1mol/LCaCl2 溶液，轻轻旋转， 使细胞充分重新悬浮， 5min 后就可以用于转化实验，或添加保护剂，低温或超低温冷冻贮藏备用。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - (2)质粒转化：1)取出制备好的感受态细胞，迅速融化放在冰上。2)将感受态细胞分装成200L/1.5mL离心管，每人 3 管，分别做阳性对照 (加入 5L pKS质粒 DNA) ，阴

7、性对照 (加超纯水 5L) 和酶连产物转化 (酶连产物 520L) ，用微量移液器轻轻吸打均匀、在冰上放置30min。3)热击将离心管放置 42水浴 60-90s(勿动离心管 )。4)冰浴快速将离心管转移到冰上，放置l-2min(时间不能太长 )。5)复苏每管加 800L ，SOC 培养基，在 37 200r/min 振荡培养 50-60min,使细菌复苏，抗性得以表达。6)涂皿将三种不同处理各取100L 左右转化液徐布在含有4L IPTG ，40L x -ga1和氨苄青霉素 (Amp 50g/mL) 的平板上。7)倒置平板于 37培养 16-18h，观察实验结果并记录结果。（五)注意事项(1)主要的转化操作都是无菌操作，并且在冰上进行。(2)配制药品、培养基等均用超纯水。(3)使用的器皿一定要清洗干净，因为痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。(4)菌体的浓度是影响感受态效率高低的主要因素，适于本法的菌体浓度应在 OD600 值 0.05-0.11之间， 一般转化效率可以达到107/mg 质粒 DNA(pUC 系列和 pKS)。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -