网织红细胞(Ret)计数ppt课件.ppt

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1、网织红细胞（Ret）计数 RBC生成过程： 多能干细胞 原红 早幼红 中幼红 晚幼红 成熟RBC Ret概念: 是介于晚幼红和成熟红细胞之间尚没有完全成熟的红细胞，因其 胞浆中尚有残存的嗜碱性物质（RNA、核糖体）经活体染色后，聚集成深染颗粒，颗粒多时形成网状，故名网织红细胞。 正常情况下，晚幼红脱核后平均需正常情况下，晚幼红脱核后平均需2 2天才能发育成完全成熟的天才能发育成完全成熟的RBCRBC。RET RET分型分型较成熟较成熟RBCRBC稍大，直径稍大，直径8.08.09.59.5m m。 0 骨髓，骨髓， 外周难见外周难见 周围血少量周围血少量 外周最多外周最多 (0.08%) (0

2、.15%) (0.08%) (0.15%) （60%60%以上）以上） 花冠型 丝球型 网型、 破网型 点粒型 有核 充满，相互连接 松散，连成网 稀疏，丝点状 散在，细颗粒 细丝状 ICSH 及NCCLS的定义：网织红细胞是已不含有细胞核的红细胞，网织红细胞是已不含有细胞核的红细胞， 故认为故认为应分四型：应分四型： 、 。 RET【器材和试剂】 1. 显微镜、Miller窥盘。 2. 新亚甲蓝染液（WHO推荐） 新亚甲蓝N 0.5g 草 酸 钾 1.6g 蒸 馏 水 100ml ，用前过滤。 WHO推荐，其对Ret染色力强且稳定，但该染液在室温下只稳定3周； 3.灿烂甲酚蓝染液： 灿烂甲酚

3、蓝 1g 柠檬酸三钠 0.4g 氯化钠 0.85 双蒸水 100ml ，用前过滤。 费用低廉，国内目前使用的主要方法；但易产生沉淀。AB13四、操作 1. 取小试管一支，加染液和血液各2滴，混匀。 2. 置37水浴箱15min，取出后微振2min，推片。 3. 将Miller 窥盘放入目镜，选择合适部位计数，油镜下 Miller 窥盘的小格A内计数所有无核红细胞，大格B （含小格面积）内计数网织红细胞。或计数1000个红 细胞中的网织红细胞数。五、计算 1. Ret% = 100 2. 绝对值计算:RBCRet%（ 109/L）大格网织红细胞总数小格红细胞总数9AB13 控制Ret计数CV=1

4、0% (ICSH推荐)需镜检的RBC数Ret（%） 窥盘小方格内镜检RBC数 相当镜检RBC总数 1000 9000 500 4500 10 200 1800 1125 100 900 【正常参考值】方 法 年龄组 相对值（%）显微镜 成人、儿童 0.51.5计数 新生儿2.06.0 【测定方法及评价】1.显微镜计数法显微镜计数法：国内的主要方法，器材价廉、作简单、费用低。 缺点：工作效率低、精密度低，操作批内重复CV在20%以上；其相对计数结果（%）显著受成熟RBC浓度的影响，使用Miller窥盘可将计数精密度控制在CV15%，可提高工作效率。2.网织红细胞网织红细胞仪仪测定法：采用流氏细胞

5、技术，将RBC经特殊荧光染料染色后，使含有RNA的RBC被计数，自动计算出RET的%及绝对数。优点：测量细胞多，避免主观因素、方法易于标准化。国外已广泛使用，国内逐步推广使用。但成本高。 近年来，新型多参数血细胞分析仪具有Ret计数功能。 【质量控制】1.抗凝血最好在4h内处理，保存在4C，可延长至8h.2.染色温度控制在37C为宜，无论何种染液，室温（25C）以下染色时，RET检出率明显减低，故要求37C恒温染色。3. 玻片法容易使血液中的水分蒸发，造成涂片困难，受染料沉淀的干扰，故已少用。4. 试管法为手工RET计数的首选方法，染液与血液的比例以1:1为宜，严重贫血时可适当增加血液比例。5

6、. 推制血膜不宜太薄或太厚，否则会造成RET分布不均。6. ICSH推荐使用Miller窥盘作Ret计数，其CV=10% 【临床意义】（1 1） 评价骨髓造血功能评价骨髓造血功能： RET是红系造血功能活跃的反映。表示骨髓造血功能旺盛，见于增生性贫血，以溶贫最为显著（68%，急性溶血可达20%，严重者可达4050%）；急性失血可明显 ；缺铁和巨贫RET正常或轻度 。 RET表示骨髓造血功能减低，多见于再障，尤以急性再障最为显著，典型病例RET常低于0.5%，甚至为0，RET绝对值低于15109/L常作为再障的诊断标准之一。也可见于急性白血病时骨髓红系增生受抑制或因化疗、放疗造成的骨髓抑制。 【

7、临床意义】（2 2）贫血治疗的疗效观察：贫血治疗的疗效观察： 巨贫、缺铁经合理治疗后，RET逐渐，并先于RBC、Hb的。用药后35d开始，710d达高峰(一般为68%，高者达10%)，治疗2周左右逐渐下降，然后RBC、Hb 才逐渐 。 再障治疗有效时，RET逐渐回升甚至轻微升高。 【临床意义】（3 3）作为观察病情的指标：作为观察病情的指标： 溶血和失血性贫血在治疗过程中，连续进行RET计数，可作为判断病情变化的参考指标。 如治疗后RET逐渐降低，表示溶血或出血已得到控制； 如RET持续不减低，甚至更见增高，表示病情未能控制，甚至还在加重。 RET计数对骨髓移植后造血功能重建情况及造血功能状态

8、估计有一定价值。如Ret 15109/L ,表示无移植并发症；若Ret15109/L，说明可能失败。 血红蛋白测定 血红蛋白组成 珠蛋白肽链（4条）,每条折叠的珠蛋白肽链结合1个亚铁血红素，分子量64458（不带O2）。 血红蛋白珠蛋白肽链亚铁血红素珠蛋白肽链亚铁血红素珠蛋白肽链亚铁血红素珠蛋白肽链亚铁血红素原卟啉Fe 2+原卟啉Fe 2+原卟啉Fe 2+原卟啉Fe 2+血红蛋白特点 1. 1. 完整的完整的HbHb分子，具有四级空间结构的四聚体，只有分子，具有四级空间结构的四聚体，只有 这种四级结构才具备结合这种四级结构才具备结合O O2 2和和COCO2 2的能力。的能力。 2. 2. 珠

9、蛋白具有种属特异性珠蛋白具有种属特异性, ,每个珠蛋白分子含两条每个珠蛋白分子含两条 链和非链和非链。正常成人链。正常成人HbHb有三种有三种: : HbA(HbA(2 22 2 ),),占占90%,90%, HbAHbA2 2(2 22 2 ) ) ， 占占2 23%3%， HbF(HbF(2 22 2，2%2%）；新生儿）；新生儿HbFHbF占占70%70%， 1 1岁后降至成人水平。岁后降至成人水平。血红蛋白结构图血红蛋白特点3. 3. 亚铁血红素无种族特异性，由亚铁血红素无种族特异性，由2 2价铁离子和原卟啉组成呈扁平型。价铁离子和原卟啉组成呈扁平型。4. Hb4. Hb状态状态 氧合

10、氧合Hb(HbOHb(HbO2 2 ） -与与O O2 2结合，结合， 还原还原Hb(HbredHb(Hbred）- -脱氧脱氧 碳氧碳氧HbHb（HbCOHbCO）- -与与COCO结合，结合， 高铁高铁Hb(Hi)-Hb(Hi)-被氧化成。被氧化成。 硫化硫化HbHb（SHbSHb）- -病理情况病理情况 HbHb及衍生物因结构不同具有不同的吸收光谱。及衍生物因结构不同具有不同的吸收光谱。 5.5.HbHb功能功能 运输运输O O2 2和和COCO2 2, ,结合可逆。结合可逆。1 1分子分子HbHb结合结合1 1分子分子O O2 2 ，在标准，在标准状况下，每克状况下，每克HbHb能结合

11、能结合1.39 1.39 ml Oml O2 2 。血红蛋白测定血红蛋白测定 测定血液中各种血红蛋白的总浓度。测定血液中各种血红蛋白的总浓度。 方法有多种方法有多种 血红蛋白计法血红蛋白计法 氰化高铁血红蛋白法（氰化高铁血红蛋白法（HiCNHiCN） 十二烷基硫酸钠血红蛋白测定法（十二烷基硫酸钠血红蛋白测定法（SLS-HbSLS-Hb） 其他方法其他方法血红蛋白计法步骤步骤 1 1 加盐酸加盐酸 比色方管内加入比色方管内加入1.101.10当量盐酸到刻度当量盐酸到刻度20%20%（蓝色）（蓝色） 2 2 采血采血 采血采血20l,20l,擦去管外余血加入，清洗擦去管外余血加入，清洗2-32-3

12、次，混匀次，混匀, ,使血使血液与盐酸混合，成均匀黄褐色，将方管插入比色架，无刻度液与盐酸混合，成均匀黄褐色，将方管插入比色架，无刻度面放前后面。面放前后面。 3 3 稀释稀释 1010分钟后滴加蒸馏水稀释，同时不断搅动混合，边滴边观察分钟后滴加蒸馏水稀释，同时不断搅动混合，边滴边观察色泽是否与标准黄褐色相同。接近时，慢慢加入直到颜色完色泽是否与标准黄褐色相同。接近时，慢慢加入直到颜色完全相同，停止滴加蒸馏水。全相同，停止滴加蒸馏水。 4 4读数读数 此时观察方管内凹最低处刻度即每此时观察方管内凹最低处刻度即每100ml100ml血液中含血红蛋白血液中含血红蛋白克数（红色）。克数（红色）。一、

13、氰化高铁血红蛋白法【原理】除SHb外，其他Hb均可被高铁氰化钾氧化成高铁Hb(Hi)，再与试剂中的CN-结合，生成稳定棕红色的HiCN，在540nm处比色，求得Hb的克数。【器材和试剂】 1.分光光度计或血红蛋白比色计 2.血红蛋白转化液：WHO和国家卫生部临床检验中心 推荐 (文-齐氏液) 高铁氰化钾 K3Fe(CN)3(AR) 200 mg氰化钾 KCN 50 mg磷酸二氢钾 KH2PO4 140 mg Triton X-100 0.51.0 ml 加水至 1000 ml。【操作操作】2020l l血加入血加入5ml5ml转化液转化液, ,冲洗吸管冲洗吸管2 23 3次次 混匀混匀, ,室

14、温置室温置min min 后，转化液作空白，于后，转化液作空白，于540nm540nm（1cm1cm光径）光径）比色。比色。【计算计算】Hb(gHb(g/L) = A/L) = A540540 64458/( 64458/(44441000)1000) 251=A251=A367.7367.7 也可用市售也可用市售HbHb标准品（标准品（5050、100100、150150、200g/L200g/L）作标）作标准曲线。也可用校准后得血红蛋白仪直接测定。准曲线。也可用校准后得血红蛋白仪直接测定。【注意事项注意事项】 本试剂中含有少量本试剂中含有少量KCNKCN，废液必须无害化处理。，废液必须无害

15、化处理。 废液处理废液处理：用水按：用水按1:11:1稀释稀释, ,再按每升液体加再按每升液体加35ml35ml次氯次氯酸钠，充分混匀，敞开容器口，过夜，使酸钠，充分混匀，敞开容器口，过夜，使CN-CN-氧化成氧化成N N2 2和和COCO2 2 ，或水解成，或水解成COCO3 32-2-和和NHNH4 4+ +，然后倒入下水道。，然后倒入下水道。氰化高铁血红蛋白法【方法学评价】 1.1.氰化高铁血红蛋白（ HiCNHiCN ）法： 特点：特点： WHO和ICSH推荐的标准方法， 540 具有操作简单、 结果稳定可靠， 504 参考品保存时间长，便于质控， 读取光密度后可直接定值等优点。 缺点

16、： 不能测SHb； 对HbCO转化速度慢（需100min）； 高球蛋白或高白细胞血样，试剂易浑浊； 含剧毒药品KCN.应作减毒处理。两种方法比较 HiCN法 比色法 定体积定体积 定吸光度定吸光度 测吸光度计算测吸光度计算 测体积计算测体积计算 精度高精度高 精度低精度低 仪器试剂要求高仪器试剂要求高 仪器试剂要求低仪器试剂要求低【方法学评价方法学评价】3.十二烷基硫酸钠血红蛋白（十二烷基硫酸钠血红蛋白（SDS-HbSDS-Hb）测定法）测定法： 原理：原理：除除SHbSHb外，其他外，其他HbHb均可与低浓度均可与低浓度SDSSDS生成生成SDS-Hb SDS-Hb 棕红棕红色化合物。最大吸

17、收峰色化合物。最大吸收峰538nm,538nm,波谷波谷500nm,500nm,其摩尔消光系数不其摩尔消光系数不确定，不能用吸光度值直接计算。确定，不能用吸光度值直接计算。 特点：特点：试剂无毒、结果准确、重复性好，试剂无毒、结果准确、重复性好， 缺点缺点：其依赖其依赖HiCNHiCN法间接得出结果，该试剂可破坏法间接得出结果，该试剂可破坏WBCWBC，不适于血细胞分析仪不适于血细胞分析仪4.4.叠氮高铁血红蛋白（叠氮高铁血红蛋白（HiNHiN3 3）测定法）测定法： 试剂毒性较低，较准确、重复性较好，但仍存在公害问题，试剂毒性较低，较准确、重复性较好，但仍存在公害问题， 对对HbCOHbCO

18、转化慢（转化慢（2020minmin）。）。5.5.碱羟血红蛋白（碱羟血红蛋白（AHDAHD575575）测定法）测定法： 优点：优点：准确度、精密度均较高，参比标准为氯化血红素。准确度、精密度均较高，参比标准为氯化血红素。 缺点：缺点：参比标准纯度不达标，不便自动分析。参比标准纯度不达标，不便自动分析。【方法学评价方法学评价】6.血细胞分析仪法 逐渐替代手工， 优点：操作简单、快速，同时可获得多项血细胞参数。 缺点： 不同的仪器使用的溶血素不同，形成不同的Hb衍生物，某些溶血剂形成的衍生物稳定性差，故应严格控制溶血剂的加入量及溶血时间。 有些溶血剂虽加入KCN,但衍生物并不是HiCN,而是氰

19、化血红蛋白仪器需经过校正后才能进行Hb测定。 低色素性贫血、某些肝病等，由于RBC具有抵抗溶血剂的作用，导致RBC溶血不完全而影响Hb测定。【正常参考值】 成人男：成人男： 120120160 160 g/L g/L 成人女成人女: 110: 1101 150 g/L 50 g/L 新生儿新生儿: 170: 170200 g/L200 g/L【临床意义】 贫血诊断优于贫血诊断优于RBC. Hb120120 g/L, g/L, （女，（女，110110 ）轻度，）轻度， Hb90 0 g/L, g/L, 中中度度 Hb60 0 g/L,g/L, 重度重度 Hb30 0 g/L,g/L, 极重度极重度【质量控制】1.1.技术误差技术误差：稀释倍数尽量准确，分光光度计波、比色杯 光径要经常校正，以减少技术误差。2.2.HiCNHiCN转化液转化液：应置棕色瓶中，不得使用塑料容器，以防 CN-丢失。3. 3. HiCNHiCN参考液参考液：是制备标准曲线、计算K值、校正仪器及 其他测定方法的关键物质，ICSH公布严格的 规格和制备方法。国产标准品已有供应