生物工程下游技术第二章-(动物细胞大规模培养和专用生物反应器)ppt课件.ppt

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1、我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物上节课我们学了什么？上节课我们学了什么？问题问题我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物生物反应器生物反应器 生物反应器的一些概念生物反应器的一些概念 生物反应器的基本类型生物反应器的基本类型我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第二章第二章 动物细胞大规模培养和专用动

2、物细胞大规模培养和专用生物反应器生物反应器 学时：学时：2 2节课节课 主要内容：主要内容： 常用培养方法常用培养方法 动物细胞培养的操作方式动物细胞培养的操作方式 细胞培养过程的放大细胞培养过程的放大 动物细胞培养生物放大器动物细胞培养生物放大器我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 动物细胞培养动物细胞培养开始于开始于上世纪初上世纪初19621962年年, , 其其规模逐渐扩大规模逐渐扩大, , 发展至今已成为生物、医发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法学研究和应用中广泛采用

3、的技术方法( (生产生产酶、生长因子、疫苗和单抗酶、生长因子、疫苗和单抗等等) )。相关知识介绍相关知识介绍利用动物细胞培养技术生产的利用动物细胞培养技术生产的生物制品生物制品已占已占世界生物高技术产品市场份额的世界生物高技术产品市场份额的50% 50% 。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 发展：发展：在过去几十年来，从使用转瓶在过去几十年来，从使用转瓶(roller (roller bottle) bottle) 、CellCubeCellCube等贴壁细胞培养，发展为生等贴壁细胞培养，

4、发展为生物反应器（物反应器（BioreactorBioreactor）进行大规模细胞培养。）进行大规模细胞培养。 一是在工艺生产时不能大规模制备产品；一是在工艺生产时不能大规模制备产品； 二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性 三是难以对同批生产进行生产和质量控制。三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 第一代细胞培养技术核心问题：难以产业化！第一代细胞培养技术核心问题：难以产业化！我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 随着生物技术的发展，随着生物技术的

5、发展，迫切需要大规模的细胞迫切需要大规模的细胞培养培养，以便获得大量有用的细胞表达产物。，以便获得大量有用的细胞表达产物。 采用采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，方法，已不能已不能满足满足所需细胞数量及其分泌产物。所需细胞数量及其分泌产物。 自自7070年代以来，较常见的细胞培养生物反应器年代以来，较常见的细胞培养生物反应器有有空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡空气提升反应器，中空纤维管反应器，无泡搅拌反应器及篮式生物反应器搅拌反应器及篮式生物反应器等。等。 8080年代以来，人们逐渐开始年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养以生物反应器培养代替鼠腹水代替鼠腹水的方

6、法获得单克隆抗体。的方法获得单克隆抗体。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术：（large-scale culture technology）l定义：定义：指在人工条件下（设定指在人工条件下（设定pHpH、温度、温度、溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。通过大规模体外培养技术培养哺乳类通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有

7、效方法动物细胞是生产生物制品的有效方法我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞胞人二倍体细胞人二倍体细胞chocho（中华仓鼠卵巢）细胞（中华仓鼠卵巢）细胞BHK-21(BHK-21(仓鼠肾细胞仓鼠肾细胞) )VeroVero细胞细胞( (非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞赖的成纤维细胞) )等。等。l可大规模培养的动物细胞可大规模培养的动物细胞我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么

8、把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物个性化培养基是胞细培养基的发展方向个性化培养基是胞细培养基的发展方向我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物图图 8.1 细胞培养瓶细胞培养瓶图图 8.3 细胞工厂细胞工厂Spinner培养系统培养系统我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢

9、？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒疫苗、巨细胞病毒疫苗、疫苗、巨细胞病毒疫苗、及及干扰素、血纤维干扰素、血纤维蛋白溶酶原激活剂、凝血因子蛋白溶酶原激活剂、凝血因子和和、促红细胞、促红细胞素、松弛素、生长激素、蛋白素、松弛素、生长激素、蛋白C C、免疫球蛋白、免疫球蛋白、尿激酶、激肽释放酶及尿激酶、激肽释放酶及200200种单克隆抗体等。种单克隆抗体等。 目前已实现商业化的产品：目前已实现商业化的产品：我

10、吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物6.6.原代培养细胞一般繁殖原代培养细胞一般繁殖5050代即退化死亡代即退化死亡 第一节第一节 常用的培养方法常用的培养方法动物细胞生长特性：动物细胞生长特性：1.1.细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素2.2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差 3.3.需氧少，不耐受强力通风与搅拌需氧少，不耐受强力通风与搅拌 4.4.群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）群体生长效应，贴壁生长

11、（锚地依赖性） 5.5.培养过程产品分布细胞内外，成本高培养过程产品分布细胞内外，成本高 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物非贴壁依赖型细胞：非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。多肿瘤细胞及某些转化细胞。 依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类：动物细胞可分为两类： 贴壁依赖型细胞：贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷需要附

12、着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。胞均属于这一类。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物“贴壁单核贴壁单核”细胞培养细胞培养贴壁的单核细胞贴壁的单核细胞贴壁细胞贴壁细胞细胞培养的人参愈伤组织细胞培养的人参愈伤组织我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物知识

13、回顾知识回顾一般步骤：一般步骤： 无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净 以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块 将小组织块置解离液（含蛋白酶类）离散细胞。将小组织块置解离液（含蛋白酶类）离散细胞。低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养 动物细胞培养步骤动物细胞培养步骤 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物植物细胞（组织）培养流程植物细胞（组织）培养流程悬浮细

14、胞培养悬浮细胞培养提取纯化提取纯化产物产物脱分化：脱分化：离体植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间离体植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织（细胞排列疏松而无后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织（细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）。规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）。 收集细胞收集细胞药物制剂药物制剂通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、紫草素、人参皂甙等紫草素、人参皂甙等我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，

15、证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物大规模动物细胞培养工艺流程图大规模动物细胞培养工艺流程图细胞培养反应器细胞培养反应器提取提取细胞细胞诱生剂诱生剂细胞细胞产品（肿瘤抗原）产品（肿瘤抗原）纯化纯化产品（干扰素）产品（干扰素）纯化纯化提取提取产品（单克隆抗体）产品（单克隆抗体）浓缩纯化浓缩纯化79865432110我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物大规模培养动物细胞的方法：大规模培养动物细胞的方法： 贴壁培养贴壁培养 悬浮培养悬浮培养 固定化培养固定化培养 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的

16、东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物一、贴壁培养（一、贴壁培养（attachment cultureattachment culture）细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。 1 1、生长特性生长特性：贴壁依赖型细胞在：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成一般数天后就铺满培养表面，并形成致

17、密的细胞单层。致密的细胞单层。 贴壁培养细贴壁培养细胞转瓶机胞转瓶机我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 2 2、贴壁培养的优点：、贴壁培养的优点： 容易更换培养液：容易更换培养液：细胞紧密黏附于固相表面，细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。 容易采用容易采用灌注培养灌注培养，从而达到提

18、高细胞密度的，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。 当细胞贴壁于生长基质时，当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效很多细胞将更有效的表达一种产品的表达一种产品。 同一设备可采用不同的培养液同一设备可采用不同的培养液/ /细胞的比例细胞的比例。 适用于所有类型细胞适用于所有类型细胞。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物灌注培养灌注培养我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜

19、测没有错：表里边有一个活的生物 3 3、贴壁培养的、贴壁培养的缺点：缺点： 与悬浮培养法相比，与悬浮培养法相比， 扩大培养比较困难，投资大；扩大培养比较困难，投资大； 占地面积大；占地面积大； 不能有效监测细胞的生长；不能有效监测细胞的生长； 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 4 4、细胞贴壁的表面：细胞贴壁的表面： 要求具有要求具有净阳电荷和高度表面活性净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲度；若为有机物表面，必须

20、具有亲水性，并带阳电荷。水性，并带阳电荷。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 5 5、贴壁培养系统：贴壁培养系统： 主要有主要有转瓶转瓶、中空纤维中空纤维（后面专题介绍）、（后面专题介绍）、玻璃珠玻璃珠、微载体系统微载体系统（后面介绍）等。（后面介绍）等。 贴壁培养细贴壁培养细胞转瓶机胞转瓶机细胞转瓶培养器细胞转瓶培养器我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 转瓶培养系统：转瓶培养系统： 为为最

21、初采用最初采用系统，一般用系统，一般用于小量培养到大规模培养的于小量培养到大规模培养的过过渡阶段渡阶段，或作为生物反应器接，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。细胞种细胞准备的一条途径。细胞接种在旋转的圆筒形培养器接种在旋转的圆筒形培养器转瓶中，培养过程中转瓶不转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。质和传热条件。 转瓶机转瓶机我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物转瓶培养的优、缺点转瓶培养的

22、优、缺点劳动强度大，占地空间大，单劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制。监测和控制环境条件受到限制。 优点：优点：结构简单，投资少，技术结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只成熟，重复性好，放大只需简单的增加转瓶数量等。需简单的增加转瓶数量等。 缺点：缺点：我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 二、二、悬浮培养悬浮培养（suspension culturesuspensi

23、on culture） 指细胞在反应器中自由悬浮生长的过指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等，是在微生物发酵的基如杂交瘤细胞等，是在微生物发酵的基础上发展起来的。础上发展起来的。 小规模悬浮培养小规模悬浮培养悬浮培养瓶悬浮培养瓶我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 用用已知人源或动物来源的蛋白或激素代已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清替动物血清的一种细胞培养方式，它能的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高

24、产品质量，正减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的新方向。逐渐成为动物细胞大规模培养的新方向。 无血清悬浮培养无血清悬浮培养我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物三、固定化培养三、固定化培养（immobilization cultureimmobilization culture）： 将将动物细胞与水不溶性载体结合起来动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。上述两大类细胞都适用，具再进行培养。上述两大类细胞都适用，具有有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能细胞生长密度高，

25、抗剪切力和抗污染能力强力强等优点，细胞易与产物分开，有利于等优点，细胞易与产物分开，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附吸附法、共价贴附法、离子法、共价贴附法、离子/ /共价交联法、包共价交联法、包埋法、微囊法埋法、微囊法等。等。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 1 1、吸附法、吸附法: : 用用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化细胞固定化的方法称为吸附法（的方法称为吸附法（adhesionadhesion）。）

26、。操作简便、条件温和、是动物细胞固定化中操作简便、条件温和、是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。最早研究使用的方法。 缺点：缺点：载体的负荷能力低，细胞易脱落载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表，微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表，稍后专门介绍。稍后专门介绍。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 2 2、共价贴附法、共价贴附法: : 利用利用共价键将动物细胞与固相载体结合共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法的固定化方法称为共价贴附法称为共价贴附法（a

27、ttachment by covalent bondingattachment by covalent bonding）。）。此法可减少细胞的泄漏，但须此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试引入化学试剂，对细胞活性有影响剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。扩散限制小，细胞得不到保护。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物3 3、离子、离子/ /共价交联法共价交联法: : 双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生

28、交联作用胞间形成桥而絮结产生交联作用，此固定，此固定化细胞方法称为离子化细胞方法称为离子/ /共价交联法共价交联法（cross-linking by covalent cross-linking by covalent bondingbonding）。交联试剂会使一些细胞死亡，）。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。也会产生扩散限制。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物4 4、包埋法、包埋法: : 将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包

29、埋法（的方法称为包埋法（entrapmententrapment）。）。 优点优点：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。泄漏少，抗机械剪切。 缺点缺点：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白胶和血纤维蛋白。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，

30、为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物石蜡切片中底部薄层软蜡包埋法石蜡切片中底部薄层软蜡包埋法甲基丙烯酸甲酯包埋标本甲基丙烯酸甲酯包埋标本微囊型包埋法微囊型包埋法我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物5 5、微囊法（、微囊法（microencapsulationmicroencapsulation）: : 用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质的微囊里，细胞不能逸出，但小分子

31、物质及营养物质可自由出入半透膜及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径控制在微囊直径控制在200-400m200-400m为宜。为宜。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第二节第二节 大规模培养技术的操作方

32、式大规模培养技术的操作方式 深层培养可分为深层培养可分为: :l分批式分批式l流加式流加式l半连续式半连续式l连续式连续式l连续式连续式l灌注式灌注式 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物一、分批式培养（一、分批式培养（batch culturebatch culture） 较早期较早期的方式，采用的方式，采用机械搅拌式生物机械搅拌式生物反应器反应器，将细胞扩大培养后，将细胞扩大培养后，一次性转入一次性转入生物反应器内进行培养生物反应器内进行培养 一次性收获一次性收获细细胞、产物、培养基。胞、产

33、物、培养基。 特点特点: :操作简单，培养周期短，染菌和细胞突变的风险小操作简单，培养周期短，染菌和细胞突变的风险小直观反映细胞生长代谢的过程。直观反映细胞生长代谢的过程。可直接放大。可直接放大。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 细胞的生长分：延滞期、对数生长期、减细胞的生长分：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期速期、平稳期和衰退期五个阶段五个阶段。 分批培养的分批培养的周期多在周期多在3-53-5天天，细胞生长动力细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期（学表现为细胞先经历对数生长

34、期（48-72h48-72h）细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗细胞密度达到最高值后，由于营养物质耗竭或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰竭或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长周期。退期进而死亡，表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行死亡后进行。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物二、流加式培养二、流加式培养（feeding culturefeeding culture） 细胞初始接种的培养基体积一般

35、为细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的终体积的1/21/21/31/3，在培养过程中根据，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，加浓缩的营养物或培养基，通常在细胞通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白缩、纯化目标蛋白。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1、流加培养物的方式、流加培养物的方式 流加的时

36、间通常在流加的时间通常在指数生长后期指数生长后期，细胞进入衰退，细胞进入衰退期之前，添加高浓度的营养物质。期之前，添加高浓度的营养物质。流加的总体原则是维持细胞生长相对稳流加的总体原则是维持细胞生长相对稳定的培养环境定的培养环境，营养成分既不过剩营养成分既不过剩而产生大量的而产生大量的代谢副产物造成营养利用效率下降而成为无效的代谢副产物造成营养利用效率下降而成为无效的利用；利用；也不缺乏也不缺乏导致细胞生长抑制或死亡。导致细胞生长抑制或死亡。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2 2、流加工艺

37、中的营养成分（三大类）：、流加工艺中的营养成分（三大类）： 葡萄糖葡萄糖：供能物质、碳源物质供能物质、碳源物质，浓度较高则产浓度较高则产生大量的代谢产物乳酸，因而需要控制浓度，以生大量的代谢产物乳酸，因而需要控制浓度，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳。浓度为佳。 谷氨酰胺谷氨酰胺：供能物质、氮源物质供能物质、氮源物质，需要控制浓度。需要控制浓度。 大规模培养中细胞凋亡，大规模培养中细胞凋亡，。氨基酸、维生素及其他：氨基酸、维生素及其他：必需氨基酸、非必需氨必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨基酸、一些特殊的

38、氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱、生长刺激因子。碱、生长刺激因子。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物三、三、半连续式培养半连续式培养（semi-continuous culturesemi-continuous culture） 1 1、又称重复分批式培养或换液培养。、又称重复分批式培养或换液培养。采用机采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，在

39、细胞增长和产物形成过程中，每间隔一每间隔一段时间，段时间，从中取出部分培养物从中取出部分培养物，再用新的再用新的培养液补足到原有体积培养液补足到原有体积，使反应器内的总，使反应器内的总体积不变体积不变。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 2 2、半连续式特点：、半连续式特点： 培养物的体积逐步增加；培养物的体积逐步增加； 可进行多次收获；可进行多次收获； 细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。一较高的浓度水

40、平，培养过程可延续到很长时间。 优点：优点：操作简便，生产效率高，可长时期进行生操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。产中被广泛应用。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物四、连续式培养四、连续式培养（continuous culturecontinuous culture） 1、常见的悬浮培养模式：常见的悬浮培养模

41、式：采用机械搅拌式采用机械搅拌式生物反应器系统生物反应器系统。在细胞达最大密度之前，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基养基（）；同时，）；同时，含有细含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，。理论上讲，该过程可无限延续下去。该过程可无限延续下去。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 2 2、连续式培养的、连续式培养的特点特点： 细胞维

42、持持续指数增长；细胞维持持续指数增长； 产物体积不断增长；产物体积不断增长； 可控制衰退期与下降期。可控制衰退期与下降期。 连续式培养连续式培养我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 3、优点：优点：l 培养状态恒定培养状态恒定，细胞在稳定状态下生长。，细胞在稳定状态下生长。l 稳定状态可有效的延长稳定状态可有效的延长分批培养中的分批培养中的对数生长期对数生长期。l 在稳定状态下在稳定状态下细胞所处的环境条件可维持不变细胞所处的环境条件可维持不变（如如营养物质浓度、产物浓度、营养物质浓度、产物浓度

43、、pHpH值可保持恒定，细胞浓度以值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率）及细胞比生长速率）。l 细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响，特，特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺，维持在一个较低的水平，从而使他们的利用胺，维持在一个较低的水平，从而使他们的利用效率提高，有害产物积累有所减少。效率提高，有害产物积累有所减少。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 4 4、不足不足： 由于是开放式操作，加上培

44、养周期较长，由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易容易造成污染造成污染； 在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物分泌产物容易变异容易变异； 对设备、仪器的对设备、仪器的控制技术控制技术要求较要求较高高。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物五、灌流式培养五、灌流式培养（perfusion cultureperfusion culture） 1 1、把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞、把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中

45、，增长和产物形成过程中，不断地将不断地将部分条件培部分条件培养基取出养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 一种是用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，一种是用搅拌式生物反应器悬

46、浮培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞截留系统开始多采用截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜微孔膜过滤或旋转膜系统系统，最近开发的有各种形式的沉降系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。或透析系统。 如：中空纤维生物反应器如：中空纤维生物反应器灌流式培养用生物反应器主要有两种形式：灌流式培养用生物反应器主要有两种形式：我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 中空纤维半透膜中空纤维半透膜可透过小分子量的产物和底物可透过小分子量的产物和底物，截流细

47、胞和分子量较大的产物截流细胞和分子量较大的产物，在连续灌流过程，在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年中空纤中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年中空纤维生物反应器被广泛用于产物分泌性动物细胞的维生物反应器被广泛用于产物分泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。 中空纤维反应器示意图中空纤维反应器示意图细胞细胞培养基出口培养基出口空气与空气与CO2出口出口空气与空气与CO2入口入口培养基入口培养基入口我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有

48、一个活的生物 固定床固定床是在反应器中装配固定的篮筐，是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。较大，细胞在载体中高密度生长。流流化床生物反应器化床生物反应器是通过流体的上升运是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应，适

49、合于固定化细胞的培养。应，适合于固定化细胞的培养。 另一种形式是固定床或流化床生物反应器另一种形式是固定床或流化床生物反应器我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物轴向绝热式轴向绝热式 径向绝热式径向绝热式 列管式列管式固定床反应器固定床反应器：气体流经固定不动的催气体流经固定不动的催化剂床层进行催化反应化剂床层进行催化反应的装置的装置流化床反应器：流化床反应器：固体颗粒被流体吹起呈悬浮状态，可作上下左固体颗粒被流体吹起呈悬浮状态，可作上下左右剧烈运动和翻动，好象是液体沸腾一样，故右剧烈运动和翻动，

50、好象是液体沸腾一样，故流化床反应器又称沸腾床反应器。流化床反应器又称沸腾床反应器。1旋风分离器旋风分离器2筒体扩大段筒体扩大段3催化剂入口催化剂入口4筒体筒体5冷却介质出口冷却介质出口6换热器换热器7冷却介质进口冷却介质进口8气体分布板气体分布板9催化剂出口催化剂出口10反应气入口反应气入口 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 2 2、灌流式培养的优点：、灌流式培养的优点： 细胞截流系统可使细胞截流系统可使细胞或酶细胞或酶保留在反应器保留在反应器内，内，维持较高的细胞密度维持较高的细胞密度，一