外源基因的表达系统ppt课件.ppt

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1、第八章第八章 外源基因的表达系统外源基因的表达系统第一节 基因表达的机制第二节 外源基因表达系统表达系统表达系统克隆的基因只有通过在宿主细胞中表达才能进一步研究其功能和调控机理，同样，也只有通过其表达才能获得具有特定生物活性的目的产物。这种表达外源基因的宿主细胞就叫表达系统，它可分为原核(主要是大肠杆菌)表达系统和真核(酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞、植物细胞)表达系统两类。要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它插入带有基因表达所需要的各种元件的载体中，这种裁体就称为表达载体。对不同的表达系统，需要构建不同的表达载体。基因表达基因表达遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质的传递到蛋白质的传递过程过

2、程中心法中心法则（则（central dogma）。）。 克隆基因的表达克隆基因的表达外源基因在宿主细胞中表达。外源基因在宿主细胞中表达。外源基因外源基因表达载体表达载体重组载体重组载体导入宿主细胞导入宿主细胞在宿主细胞中在宿主细胞中 表达出蛋白质表达出蛋白质提取蛋白提取蛋白宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞。原核细胞或真核细胞。第一节第一节 基因表达的机制基因表达的机制1 外源基因的起始转录 2 mRNA的延伸与稳定性 3 外源基因mRNA的有效翻译4 表达蛋白在细胞中的稳定性 5 目的基因沉默 1 1 外源基因的起始转录外源基因的起始转录外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问

3、题，而外源基因的起始转录又是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。一般来说，理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后，在某种特定的诱导因子(如温 度、光和化学药物等)的诱导下，RNA聚合酶开始启动转录,合成 mRNA。原核生物基因表达的启动子可分为: 诱导型启动子和组成型启动子(前者如lac trp等的启动子,后者如T7噬菌体的启动子)。真核生物基因表达的启动子可分为：诱导型、组织特异型和组成型等类型。2 mRNA 的延伸与稳定性的延伸与稳定性转录后 , 保持 m

4、RNA 的有效延伸、终止及稳定是基因有效表达的关键。在转录物内的衰减和非特异性终止都可诱发转录中的mRNA提前终止。衰减子 (attenuator) 类似于简单的终止子 , 在原核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基因之间。在构建表达载体时要尽量避免该序列的存在。为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。另一方面，存在正常转录终止序列也是外源基因有效表达的重要因素，它可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。对于真核细胞来说，表达载体上含有转录终止序列和poly(A)掺入位点是外源基因表达的重

5、要条件。poiy(A) 掺入的信号序列AAUAAA对 mRNA3端的正确加工至关重要，AAUAAA位点的缺失甚至可以导致基因表达的减少。mRNA 的稳定性直接决定翻译产物的多少。对原核细胞来说 , 最佳的 方法是选择一个 RNase 缺失的受体菌。对真核细胞来说 , 则需要考虑增加 mRNA 的正确加工 , 提高成熟 mRNA 的稳定性。3 3 外源基因外源基因 mRNA mRNA 的有效翻译的有效翻译在原核细胞中影响翻译起始的因素有:起始密码子、核糖体结合位点(SD序列)、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5端非翻译序列和蛋白编码区的5端序列等。因此,

6、外源基因mRNA有效翻译须考虑下列基本原则:mRNAmRNA有效翻译须考虑有效翻译须考虑的的基本原则基本原则AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39 个碱基。 在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。 对于真核细胞mRNA的5非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列都含有共同的序列5-CCA(G)CCATGG-3，如果改变这一序列，可使翻译的起始效率大大降低。此外， 在起始密码ATG的上游区域含有另一个起始密码而又不被随后的一个符合阅读框的终止密码所

7、终止，则该起始密码会影响mRNA翻译的起始。4 表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶 所水解是基因有效表达的一个重要因素。如果表达的外源蛋白具有 相同或类似于宿主细胞天然蛋白的构象 , 则被降解的可能性就会大大降低。避免外源基因表达蛋白降解避免外源基因表达蛋白降解构建融合蛋白表达系统：在融合蛋白中外源蛋白与受体细胞蛋白能形成良好的杂合构象，它能在较大程度上封闭外源蛋白分子上的水解酶作用位点，从而增加其稳定性。 构建分泌蛋白表达系统：使外源基因表达的蛋白质分泌到细胞周质腔或直接分泌到培养基中，避免细胞内的水解酶对表达蛋白

8、的降解。构建包涵体表达系统：外源基因的表达产物以包涵体的形式存在于受体细胞中不易被宿主蛋白水解酶所降解。选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。 5 目的基因沉默目的基因沉默基因沉默(gene silencing)是导致外源基因不能正常表达的重要因素。其作用机制主要有三种：位置效应的基因沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。基因沉默现象主要表现在转基因植物和转基因动物中。5.1 位置效应位置效应是指基因在基因组中的位置对其表达的影响。在植物和动物转基因中，外源基因进入细胞核中并整合到染色体DNA上，其整合的位点与基因的表达密切相关。如果外源基因整合到甲基化程度高、转录活性低的异染色质上,

9、一般不能表达; 5.2 转录水平的基因沉默转录水平的基因沉默是在DNA水平上的基因调控，主要是由于启动子的甲基化或外源基因的异染色质化而引起的。重复序列可导致自身甲基化，外源基因若以多拷贝的形式整合到同一位点上，形成首尾相接的正向重复(direct repeat)或头对头、尾对尾的反向重复(invert repeat)序列，则外源基因不能表达，并且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。其原因可能是由于重复序列自发配对，甲基化酶特异性地识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。 5.3 转录后水平的基因沉默转录后水平的基因沉默是在RNA水平上的基因调控，比转录水平的基 因沉默更普遍。共抑制(cos

10、uppression)是转录后水平基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。转录后水平的基因沉默的特点是外源基因能够转录成mRNA，但正常的mRNA不能积累，mRNA合成后就被降解或被相应的反义RNA或蛋白质封闭，因而不能指导mRNA的翻译。第二节第二节 外源基因表达系统外源基因表达系统1 概述2 原核基因表达系统3 真核基因表达系统1 概述概述外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。基因表达系统有原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统。目前应用最广泛的是原核生物基因表达系统，如大肠杆菌表达系统、芽子包杆菌表达系统、链霉菌 表达系

11、统和蓝藻表达系统等。2 原核基因表达系统原核基因表达系统2.1原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点:原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。 多数原核生物细胞内含有质粒或噬茵体，便于构建相应的表达载体。 生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。2.2大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统2.2.1正确表达的基本条件正确表达的基本条件基因在大肠杆菌细胞中实现正确有效表达的基本条件是必须能够正常地转

12、录和翻译，在许多情况下还需进行转录后加工以及在细胞中正确定位，这些过程中的任何一步发生差错，都会导致该基因表达的失败。所以必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和SD序列、开放读码框架(open reading frame，ORF)及宿主菌调控系统等基本条件，正确表达的基本条件外源基因不能带有间隔序列(内含子)；必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达；外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架；通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。复制子

13、：复制子是一段包含复制子起始位点和反式因子作用区在内的DNA片段。大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体， 含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。 在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存，但含不同类型复制子的不同质粒载体则可以共存于同一细胞中 。（2）启动子启动子启动子与 mRNA 的合成有很大关系。在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点之间的距离为69bp,但启动子与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定。是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。合成的序列。 大

14、肠杆菌的所有启动子中都有两段一致大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（顺序（consensus sequence）。 启动子启动子-35 Box 和和 -10 Box 启动子序列启动子序列 consensus sequences5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACA TATAAT 转录起始位点转录起始位点17bp5 核糖体结合位点核糖体结合位点RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点 。 -35box原核启动子共有序列的功能原核启动子共有序列的功能核糖体结合位点（核糖体结合位点（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）

15、 sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCAS-DS-D序列距离序列距离AUGAUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译（3 3）翻译的起始位点）翻译的起始位点AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）位于位于SD序列下游序列下游 2）起始密码：）起始密码：E.coli中促使转录终止的中促使转录终止的DNA位置有一段位置有一段反向回文顺序反向回文顺序，其后紧接一串，其后紧接一串A，称为内，称为内终止子，形成终止信号。终止子，形成终止信号。终

16、止子对外源基因的表达同样起着非常重要的作用,它能有效控制目的基因 mRNA的长度,提高mRNA的稳定性,避免质粒上其他基因的异常表达。 内终止子内终止子 intrinsic terminator：启动子启动子操纵子操纵子S-D序列序列目的基因目的基因终止子终止子（4 4）转录终止子）转录终止子由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。延续。 原因：原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基环结构，使转录物与模板之间配

17、对的碱基数降低，整个减弱了数降低，整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 茎环结构茎环结构 多聚多聚A/UA/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板模板)转录转录5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠折叠mRNAmRNA折叠折叠 U CU CC C U GU GG GC CA AUUC CG GC CG GG GC CC CG GC CG GG GC CA AA A C

18、CCAC UUUUCCCAC UUUU3 3 DNARNA聚合酶聚合酶脱落脱落2.2.3 2.2.5.1. 细胞质中表达细胞质中表达（1）包涵体（）包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质不溶性蛋白质聚集聚集折叠而成的晶体结构物。折叠而成的晶体结构物。形成原理未知形成原理未知 2.2.5 外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位例：例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。回收的蛋白生物活性差。 缺点缺点 优点优点（1）周质（）周质（pe

19、riplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚机理目前不完全清楚优点：优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。被降解的少。2.2.5.2. 周质中表达周质中表达phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（内酰胺酶（lactamase）、）、 肠毒素（肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等等 （3）常用的原核信号肽）常用的原核信号肽大肠杆菌的信号肽：大肠杆菌的信号肽

20、：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。要正确切割掉。（2）信号肽（）信号肽（signal peptide）一般位于一般位于N N端。端。鼠源鼠源RNase、人生长激素信号肽。、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用。也能在细菌中起作用。（2 2）真核信号肽真核信号肽胡萝卜欧氏杆菌的胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。蛋白。金黄色葡萄球菌的蛋白金黄色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。）。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不泌

21、极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。太理想。用溶血素（用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性）基因构建分泌性融合蛋白；融合蛋白；使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分分泌到细胞外泌到细胞外的培养基中。的培养基中。或与细菌素释放蛋白（或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。共表达。2.2.5.3. 胞外表达胞外表达5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）2.2.6.1. 启动子的结构对表达效率的影响启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点

22、亚基的识别位点（1）一致顺序）一致顺序2.2.6影响外源基因表达效率的因素（2）-35区与-10区之间的距离间隔为间隔为17bp时，启动子最强。时，启动子最强。（3） -35区和区和-10区的碱基顺序区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。越接近一致顺序，启动子越强。5-TTGACA TATAAT 一致顺序一致顺序lactrp PL recAtac Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box5-AGGAGGU

23、-3 S-D序列后面的序列后面的4个碱基：个碱基： 如果是如果是A（T）, 翻译效率最高；翻译效率最高； 如果是如果是G（C）,效率只有效率只有50%或或25%。（1）S-D序列序列？2.2.6.2 转译起始序列对表达效率的影响AUG左侧的三个碱基也有影响。左侧的三个碱基也有影响。 （2）起始密码AUG -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA中：中： AUG左侧如果是左侧如果是UAU或或CUU时，最为有效；时，最为有效； 如果是如果是UUC、UCA或或AGG时下降时下降20倍。倍。2.2.6.3. 启动子与外源基因之间的距离启动子与外源基因之间的距离转录终止区的存在保证载体转录终止区的存在保证载体

24、不会转录非必须基因不会转录非必须基因，不必浪费，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。源量和能量、不会干扰正常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。数目。增加表达效率。2.2.6.5 载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响2.2.6.6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。2.2.6.4. 转录终止区对表达效率的影响2.2.7.1选择强启动子序列，如选择强启动子序列，如tac

25、 等等2.2.7.2 调整调整S-D序列与序列与AUG碱的距离碱的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。根据不同的启动子选择不同的距离。2.2.7.3 改变起始密码下面的几组密码子改变起始密码下面的几组密码子一般为一般为5-9bp。能提高翻译的起始效率。能提高翻译的起始效率。2.2.7 提高表达水平常用的方法提高表达水平常用的方法在外源基因的下游插入在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序重复性基因外回文序列列”能防止能防止mRNA受到受到35外切酶的攻击。外切酶的攻击。2.2.7.5. 减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的

26、代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达）诱导表达 一般采用温度诱导或药物诱导。一般采用温度诱导或药物诱导。2.2.7.4. 增加增加mRNA的拷贝数和稳定性的拷贝数和稳定性cI857阻遏物有活性，抑制阻遏物有活性，抑制 PL启动子，启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。外源基因不表达，宿主大量生长。32C:42C:cI857阻遏物失活，阻遏物失活，PL启动子启动，外启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限源基因高水平表达，宿主生长受到限制。制。cI8

27、57PL外源基因外源基因PO PL启动子是温度诱导型启动子是温度诱导型调节基因调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。始终产生阻遏物。无无IPTG:阻遏物与阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。源基因转录。宿主大量生长。有有IPTG:阻遏物与阻遏物与IPTG结合，结合，lac操纵基因解操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。抑制。tac启动子是药物诱导型启动子是药物诱导型（2）表达载体诱导复制）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。将宿主的生长与载体的复

28、制分开。当宿主大量当宿主大量生长后生长后，再诱导载体制粒的，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。复制，增加拷贝数。当需要宿主大量当需要宿主大量生长时生长时，抑制载体质，抑制载体质粒的复制。粒的复制。N末端：由原核基因编码一段多肽，末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。（1）设计成融合蛋白）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物质粒基因产物 目的基因产物目的基因产物NC切割切割防止被宿主的酶降解。防止被宿主的酶降解。2.2.7.6. 提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 Z系列载体：系列载体： ZUV

29、5载体载体:lac ZG AATTCCTTAA G外源基因外源基因 Z2载体载体:lac ZGGG AATTCCCCTTAA G外源基因外源基因 Z3载体载体:lac ZGG AATTCCCTTAA G外源基因外源基因提供三种融合插入阅读框。提供三种融合插入阅读框。使用次黄嘌呤核苷（使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。减少宿主菌的蛋白酶合成。 大肠杆菌的大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶基因突变也减少蛋白酶的降解作用。的降解作用。 T4噬菌体的噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把白酶。可把pin增加到载体上。增加到载

30、体上。（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。（3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白 细胞质细胞质外膜外膜内膜内膜周间质周间质质粒质粒染色体染色体“外排外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。细菌蛋白分泌的条件：细菌蛋白分泌的条件：位于位于N端，一般为端，一般为15-30aa 。真核与原。真核与原核的结构相似核的结构相似, 功能相似，可以互换。功能相似，可以互换。 碱性氨基酸碱

31、性氨基酸N疏水氨基酸核心区疏水氨基酸核心区切割位点切割位点Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶信号肽酶外源蛋白外源蛋白 有信号肽。有信号肽。 细胞内的转运机制。细胞内的转运机制。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；很好地分泌表达； 但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。信号肽酶信号肽酶I、信号肽酶、信号肽酶II等近等近20多种多种蛋白质的参与。蛋白质的参与。 蛋白质蛋白质内内有与有与分泌相关的分泌相关的aaaa 序列。序列。 为蛋白指明目的地。为蛋白指明目的地。3 真核基因表达系统真核基因表达系统3

32、.1 酵母表达系统3.2 植物表达系统3.3 动物表达系统真核或病毒启动子真核或病毒启动子 MCS PolyA信号信号 终止子终止子外源基因外源基因真核细胞表达系统表达外源基因具有下列特点真核细胞表达系统表达外源基因具有下列特点真核细胞可识别并切除外源基因的内含子，从而成功表达目的多肽，所以不必像原核细胞表达体系那样必须从mRNA制备cDNA；真核基因在真核细胞中表达时，其SD序列与细胞核糖体RNA(rRNA)16S亚基3 7末端的互补程度较高，对翻译水平的调节有利；在真核细胞内，由外源基因表达的蛋白可被糖基化，成为糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性；外源基因导人真核细胞的效率较低，其在染色体D

33、NA上的整合是随机的和自发的，目前还无法控制整合的位置和适当的拷贝数；真核细胞的培养要求较高，大量生产比较困难，成本也高。3.1 酵母表达系统酵母表达系统 能在能在E.coli中克隆和扩增。中克隆和扩增。1. 酵母克隆载体酵母克隆载体一、在酵母中表达一、在酵母中表达Leu2+ +、His+ +、Ura3+ +、Trp1+ +; 有合适的克隆位点。有合适的克隆位点。 有酵母的选择标记有酵母的选择标记Ori 有有大肠杆菌的选择标记大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。Dividing Saccharomyces cerevisiae (bakers yeast) cells由大肠杆菌质粒和酵母的由

34、大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选片断（选择标记）构成。择标记）构成。ColE1 酵母酵母Leu 2+ +如如 PYeleu10:（1）整合型载体）整合型载体(YIp) 转化率低（转化率低（1-10转化子转化子/微克微克DNA）。）。特点：特点：载体上只有细菌的复制区，没有载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。酵母的自主复制区。可与受体细胞的染色体可与受体细胞的染色体DNA同源重组，同源重组，随染色体一起复制。随染色体一起复制。不能在酵母细胞中自主复制不能在酵母细胞中自主复制整合到酵母的染色体上整合到酵母的染色体上不能从酵母细胞中提取载体。不能从酵母细胞中提取载体。由大肠杆菌质粒和酵母

35、的由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断片断(选择标记选择标记和酵母和酵母DNA自主复制顺序自主复制顺序ARS）构成。）构成。大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒 酵母酵母ARS （2）复制型载体）复制型载体(YRp) 酵母选择标记酵母选择标记 ARSARS（automously replicating sequence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守区保守区特点：特点：转化率高（转化率高（102-103转化子转化子/微克微克DNA) 。不稳定，容易丢失。不稳定，容易丢失。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母既能在大肠杆菌中复制，又能在

36、酵母细胞中自主复制。细胞中自主复制。穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector）在在YRp质粒中插入酵母染色体的质粒中插入酵母染色体的着丝粒着丝粒区区。特点：特点：YRp质粒质粒 酵母着丝粒酵母着丝粒（3）着丝粒质粒）着丝粒质粒(YCp) 不易从细胞中提取。不易从细胞中提取。行为像染色体，能稳定遗传。行为像染色体，能稳定遗传。 单拷贝存在。单拷贝存在。由大肠杆菌质粒、由大肠杆菌质粒、2 m质粒质粒及酵母染色体及酵母染色体DNA选择标记构成。选择标记构成。 大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒酵母选择标记酵母选择标记 2 m质粒质粒如如pYF92:pBR3222 m酵母酵母his 3+ +（4）附加体

37、型载体）附加体型载体(YEp) 2 m质粒：质粒：酿酒酵母的内源质粒，长度是酿酒酵母的内源质粒，长度是2 m 。含有自主。含有自主复制起始区复制起始区ori和和STB序列（使质粒在供体中维序列（使质粒在供体中维持稳定）。持稳定）。特点：特点：很高的转化活性（很高的转化活性（103-105转化子转化子/微克微克DNA）. 拷贝数多（拷贝数多（25-100分子分子/细胞）。细胞）。 比比YRp稳定。稳定。YEp24Leu- - 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、 PEG整合到染色体上，整合到染色体上， 或独立在酵母细胞内或独立在酵母细胞内转化转化Leu营养营养缺陷型缺陷型

38、 培养基培养基筛选筛选转化子克隆生长转化子克隆生长酵母载体酵母载体大肠杆菌大肠杆菌提取提取插入外源基因插入外源基因鉴定克隆鉴定克隆发酵表达发酵表达外源基因产物外源基因产物分离、纯化分离、纯化2. 酵母转化和表达的一般过程酵母转化和表达的一般过程 （1）优点）优点 对其遗传学和生理学的研究比较深入。对其遗传学和生理学的研究比较深入。 小量培养和大规模反应器中都能生长。小量培养和大规模反应器中都能生长。 已经分离出很强的启动子。已经分离出很强的启动子。 有有翻译后的加工翻译后的加工。 本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。化。 安全性高（安全性高（FDA确认的安

39、全生物），不确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。需要宿主的安全性检验。3. 酵母表达系统的特点酵母表达系统的特点 常常发生质粒丢失。常常发生质粒丢失。 重组蛋白常常超糖基化重组蛋白常常超糖基化表达量普遍低。表达量普遍低。（2）缺点）缺点每个每个N-寡糖链上含有寡糖链上含有100多个甘露糖，多个甘露糖，分泌困难。分泌困难。正常的高甘露糖寡糖链上仅有正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-138-13个甘露糖。个甘露糖。分泌型蛋白有时会留在分泌型蛋白有时会留在壁膜壁膜间隙，间隙，诊断试剂诊断试剂丙肝病毒蛋白丙肝病毒蛋白HIV-1抗原抗原种类种类名称名称疫苗疫苗乙肝病毒表面抗原乙肝病毒表面抗原疟原虫环

40、子孢子蛋白疟原虫环子孢子蛋白HIV-1外壳蛋白外壳蛋白4. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白在啤酒酵母中表达的重组蛋白人类治疗用蛋白药物人类治疗用蛋白药物上皮生长因子上皮生长因子胰岛素胰岛素类胰岛素生长因子类胰岛素生长因子血小板源生长因子血小板源生长因子胰岛素前体胰岛素前体成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子集落刺激因子集落刺激因子 1抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶 凝血因子凝血因子VIIIa24（1）细胞质内表达）细胞质内表达 例：人例：人Cu/Zn-SOD在酵母中表达：在酵母中表达：5. 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式超氧化物超氧化物H+ +H2O2H2O过氧化物酶过氧化物酶

41、表达出的表达出的SOD修饰正确：修饰正确：起始氨基酸被切掉，起始氨基酸被切掉， 第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(SOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶) )宿主：宿主： 亮氨酸合亮氨酸合成缺陷型成缺陷型酵母。酵母。GAPD： 甘油醛磷甘油醛磷酸脱氢酶酸脱氢酶（2）表达分泌型蛋白）表达分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。糖基化。 需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。方法：方法：构建载体构建载体在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子

42、配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的的前导肽，与重组蛋白的N端通过端通过Lys-Arg相连。相连。前导肽（前导肽（leader peptide）：）：蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶内切蛋白酶识别这个切点信号，把重识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。组蛋白正确切下来。信号肽的切割：信号肽的切割：前导肽前导肽 Lys-Arg 重组蛋白（水蛭素）重组蛋白（水蛭素）内切蛋白酶内切蛋白酶6.其它酵母表达系统其它酵母表达系统（1 1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达在大型发酵反应器中容易生长；在大型发酵反应器中容易生长； 以甲醇作

43、唯一的碳源和能源，成本低。以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇时，表达的有甲醇时，表达的乙醇氧化酶乙醇氧化酶高达胞高达胞内总蛋白的内总蛋白的40%！嗜甲烷酵母（嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点）的特点HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1：乙醇氧化酶基因：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。 3-aox1：整合到特定染色体的位点序列。：整合到特定染色体的位点序列。表达载体构建（整合型）：表达载体构建（整合型）：诱导物

44、：甲醇。诱导物：甲醇。产量：产量： 9106剂疫苗剂疫苗/240L发发酵罐。酵罐。整整合合到到染染色色体体中中三、外源基因在植物中表达三、外源基因在植物中表达根瘤存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（导质粒（tumor inducing plasmid）。）。1. Ti质粒质粒: Ti plasmid环状双链环状双链DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相当于细菌染色体的相当于细菌染色体的3%-5%）。）。（1）Ti质粒的结构质粒的结构 转移转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能

45、随机整，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是是Ti质粒最重要的部分。质粒最重要的部分。左边界左边界右边界右边界生长素生长素 基因基因细胞分裂细胞分裂 素基因素基因冠瘿碱冠瘿碱 合成合成T-DNA（transfer-DNA）生长素基因生长素基因:iaaM（tms1）和）和iaaH（tms2）编码合成）编码合成吲哚吲哚乙酸乙酸（植物生长激素）的酶（植物生长激素）的酶iaaM: 色氨酸色氨酸-2-单加氧酶单加氧酶色氨酸色氨酸-2-单加氧酶单加氧酶色氨酸色氨酸吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺iaaH:吲哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲

46、哚吲哚-3-乙酰胺水解酶乙酰胺水解酶吲哚吲哚-3-乙酰胺乙酰胺吲哚乙酸吲哚乙酸细胞分裂素基因细胞分裂素基因tmr（ipt）：异戊烯转移酶）：异戊烯转移酶, 催化：催化：二磷酸异戊烯（二磷酸异戊烯（IPP）异戊烯酰嘌呤单异戊烯酰嘌呤单磷酸（磷酸（IPA）5-AMP章鱼碱（章鱼碱（octopine)胭脂碱（胭脂碱（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg与丙酮酸缩合成与丙酮酸缩合成Arg与与 酮戊二醛缩合成酮戊二醛缩合成冠瘿碱（冠瘿碱（opine）的）

47、的类型和类型和化学结构化学结构农杆碱（农杆碱（agropine）冠瘿碱（冠瘿碱（opine）的作用）的作用 冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。微生物都不能利用冠瘿碱。Glu的二环糖衍生物。的二环糖衍生物。毒性基因（毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的的转移，转移， 进入和整合进入和整合。vir的产物能诱导的产物能诱导Ti质粒产生质粒产生T-DNA区域的区域的单链拷贝。单链拷贝从单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，

48、可质粒脱离后，可与与vir的产物的产物VIR D2蛋白结合，并在蛋白结合，并在VIR D4和和VIR B蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。最后整合到植物染色体上。单链的单链的5端是右边界区域，含有端是右边界区域，含有25bp重复重复序列，参与整合。序列，参与整合。章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因： 不相容性基因不相容性基因控制控制Ti质粒的不相容性。质粒的不相容性。冠瘿碱代谢基因冠瘿碱代谢基因分别编码代谢这两种冠瘿碱分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维

49、持农杆菌生长。的酶。维持农杆菌生长。（1）第一步）第一步:植物受伤植物受伤植物受伤后能分泌植物受伤后能分泌酚类化合物酚类化合物（如乙（如乙酰丁香酮、酰丁香酮、 羟基乙酰丁香酮），诱导羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的质粒上的毒性基因表达毒性基因表达。2. 农杆菌的感染和生存农杆菌的感染和生存（1）第二步）第二步 感染植物感染植物（3）第三步）第三步 毒性基因（毒性基因（vir）表达）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。在

50、茎的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步）第四步 T-DNA转移转移T-DNA被被vir基因产物切下来，并运送到植基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。物细胞核里，整合到植物基因组中。（5）第五步）第五步 诱导冠瘿瘤诱导冠瘿瘤（6）第六步）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。土壤农杆菌代谢冠瘿碱。3. Ti质粒的种类质粒的种类根据所编码的冠瘿碱（根据所编码的冠瘿碱（opine），分为），分为（1）章鱼碱（）章鱼碱（octopine)型质粒型质粒（3）农杆碱（）农杆碱（agropine）型质粒）型质粒（2）胭脂碱（）胭脂碱（nopaline）型质粒）型质粒裸子