外源基因在哺乳动物中的表达ppt课件.ppt

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1、外源基因在哺乳动物细胞中的表达A高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程的基本概念B 高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物的受体系统C 高等哺乳动物的载体系统高等哺乳动物的载体系统D 高等哺乳动物的基因转移高等哺乳动物的基因转移E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物的受体系统 高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受

2、体细胞常用的高等哺乳动物受体细胞高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征 锚地依赖性：锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代，且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细

3、胞系形成，此时的细胞成为细胞系细胞系。高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的条件高效表达外源基因的高等哺乳动物受体细胞应具备的条高效表达外源基因的高等哺乳动物受体细胞应具备的条件 细胞系特征细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养 遗传稳定性遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 合适的标记合适的标记 便于转化株的筛选和维持 生长快且齐生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制 安全性能好安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳动物受体细胞

4、的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞高等哺乳动物受体细胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补。 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补。高等哺乳动物受体细

5、胞的遗传标记高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记常用的高等哺乳动物受体细胞常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养耐受剪切力，便于大规模培养 被美国被美国FFDA确认为安全的基因工程受

6、体细胞确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）高等哺乳动物的载体系统高等哺乳动物的载体系统 人腺病毒人腺病毒DNA 猴空泡病毒猴空泡病毒DNA（SV40） 人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNA（BKV） 人牛痘病毒人牛痘病毒DNA人腺病毒人腺病毒DNA 腺病毒科为线状双链双链DNA病毒病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。腺病毒的生物学特性腺病毒的生物学特性 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。人腺病毒人腺病毒D

7、NA 腺病毒的基因组腺病毒的基因组DNA腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%，DNA两端各有一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.22 kb的片段，使得载体的装载量提高到4 kb以上。人腺病毒人腺病毒DNA腺病毒腺病毒DNA载体的特点载体的特点 基因重排低外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期；

8、 安全性能好不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤； 宿主范围广对受体细胞是否处于分裂期要求不严格； 使用效果好外源基因在载体上容易高效表达。猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的生物学特性的生物学特性 SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA。 SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。 SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌。猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40的基

9、因组的基因组DNAt / T基因编码病毒的小抗原和大抗原与病毒的致癌作用密切相关；SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白。猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40） 重组的SV40 DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体

10、曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔-珠蛋白.SV40 DNA-质粒质粒DNA杂合载体的构建杂合载体的构建猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40）利用利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序载体表达外源基因的程序猴多瘤病毒猴多瘤病毒DNA（SV40）SV40 DNA载体的特点载体的特点 基因表达好外源基因能高效表达 基因重排高病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象 宿主范围窄只能转染猴细胞 装载量较小人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒的生物学特性人乳多瘤病毒的生物学特性 人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发

11、生整合，独立于染色体而自主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝人乳多瘤病毒人乳多瘤病毒DNA（BKV）人乳多瘤病毒表达载体的构建人乳多瘤病毒表达载体的构建删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成穿梭载体，它不能整合，同时也不能形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。安装细胞色素P450 dioxin介导的增强子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。SV40来源的启动子控制Neor 标记基因，以G418筛选重组子。以此载体在人细胞系中表达1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。人牛痘病毒人牛痘病毒DNA人牛痘病毒的生物学特性人牛痘病毒的生物学特性 人牛痘

12、病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，能在宿主细胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。人牛痘病毒人牛痘病毒DNA人牛痘病毒人牛痘病毒DNA表达载体的构建表达载体的构建 目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒； 其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌TT77RNA聚合酶编码基因。在外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基

13、因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白； 人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法电击转化法电击转化法 将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。 电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法脂质体介导法脂质体介导法 将待转化的DNA溶解与天然或

14、人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。 将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。 利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa细胞。哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法显微注射法显微注射法 通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵； 借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄性原核内。 上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操作，所以不太适用于基因的克隆和表达。哺乳动物细胞的物理转化法哺乳动物细胞的物理转化法血

15、影细胞介导法血影细胞介导法 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受体细胞。哺乳动物细胞的病毒转染法哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷

16、，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体 利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂 利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的原理 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一

17、种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。 这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基同时被扩增。哺乳动物细胞高效表达外源蛋白原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白原理通过强化基因扩增高效表达外源基因通过强化基因扩增高效表达外源基因 GS-MSX高效表达系统高效表达系统

18、 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX， 所以在转染过程不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR- MTX系统优越之处。哺乳动物细胞高效表达外源蛋白原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白原理通过强化基因转录高效表达外源基因通过强化基因转录高效表达外源基因在载体上安装病毒或细胞来源的强启动子以及有效的翻译元件，也是使外源基因高效表达的一种手段，如：细胞巨化病毒CMV的启动子、动物珠蛋白基因的内含

19、子SV40的终止子和polyA化信号序列。绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利于翻译，有的还含有各种信号肽序列。哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的原理利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种： 干扰素 干扰素 凝血因子VIII 凝血因子IX 促红细胞生成素（EPO） 生长因子（hGH） 白介素2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原 单克隆抗体 CD4受体 组织型纤溶酶原激

20、活剂（tPA）利用哺乳动物细胞生产人源化小鼠抗体利用哺乳动物细胞生产人源化小鼠抗体大多数恶性淋巴瘤细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath用人源化的小鼠抗ampath抗体治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效果良好。重组抗体采用DHFR-MTX系统表达。利用哺乳动物细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂 第一个由重组哺乳动物细胞规模化生产的医用蛋白是治疗急性心肌梗塞的溶血栓药物：人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）。同样采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞选用CHO系统。目前，用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化。此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重

21、折叠效率低。利用哺乳动物细胞生产人凝血因子利用哺乳动物细胞生产人凝血因子VIII 凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIIIIII生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中1100%的病人最终死于爱滋病而非血友病。 早在上述情况发生之前，人凝血因子VIIIIII的ccDNA便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA相似，人凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代血友病人的大量需求。