PCR的经验与教训ppt课件.ppt

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1、PCRPCR的经验总结的经验总结 中心实验室中心实验室内容提要：内容提要： PCRPCR的简介的简介 PCRPCR的原理的原理 PCRPCR的操作步骤的操作步骤 PCRPCR的结果分析的结果分析 相关相关PCRPCR技术简介技术简介PCRPCR的简介：的简介：19831983年年 KaryKary Mullis Mullis发明发明19851985年年 开始有文章发表开始有文章发表19931993年年 获诺贝尔奖获诺贝尔奖广泛用于分子生物学领域广泛用于分子生物学领域PCRPCR的简介：的简介：聚合酶链式反应，简称聚合酶链式反应，简称PCRPCR（Polymerase Chain Reactio

2、nPolymerase Chain Reaction），指在引物指导下由酶催化），指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组的对特定模板（克隆或基因组DNADNA）的扩增反应，是模拟体）的扩增反应，是模拟体内内DNADNA复制过程，在体外特异复制过程，在体外特异性扩增性扩增DNADNA片段的一种技术，片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用在分子生物学中有广泛的应用，包括用于，包括用于DNADNA作图、作图、DNADNA测序测序、分子系统遗传学等。、分子系统遗传学等。PCRPCR的的原理原理：PCRPCR的操作步骤的操作步骤 标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系 1010扩增缓冲液

3、扩增缓冲液1010l l 4 4种种dNTPdNTP混合物各混合物各200200molmol/L/L 引物引物1010100pmol100pmol 模板模板DNA 0.1DNA 0.12 2g g TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶2.5u2.5u Mg2+ 1.5mmol/LMg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至100l100l PCRPCR的反应流程的反应流程： 温度与时间的设置：温度与时间的设置： 变性温度与时间变性温度与时间：一般：一般93939595，1min1min足以使足以使模板变性，若低于模板变性，若低于9393则需延长时间，但温度过则需延长时间，但温

4、度过高对酶的活性有影响。引物高对酶的活性有影响。引物1010100pmol100pmol 退火退火( (复性复性) )温度与时间温度与时间：取决于引物的长度、碱：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，对于基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，对于2020个核苷酸，个核苷酸，G+CG+C含量约含量约50%50%的引物，的引物，5555作为选作为选择最适退火温度的起点较为理想。择最适退火温度的起点较为理想。 按下公式计算：按下公式计算：TmTm（解链温度）（解链温度）4(G+C)+2(A+T) 4(G+C)+2(A+T) 复性温度复性温度=Tm=Tm值（值（5 51010） 在

5、在TmTm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCRPCR反应反应的特异性。一般为的特异性。一般为303060s60s。 延伸温度与时间：延伸温度与时间： A.A.延伸温度延伸温度：一般选在：一般选在70707575之间，常用温度为之间，常用温度为7272，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：延伸反应时间： 1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min；3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需

6、3 34min4min；扩增；扩增10kb10kb需延伸至需延伸至15min15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增，但是对低浓度延伸时间过长会导致非特异性扩增，但是对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。模板的扩增，延伸时间要稍长些。 B.B.循环次数循环次数：循环次数决定：循环次数决定PCRPCR扩增程度，主要取决扩增程度，主要取决于模板于模板DNADNA的浓度，一般选在的浓度，一般选在30304040次之间循环次数次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCRPCR的结果分析的结果分析目的基因目的基因star PCRstar PCR扩扩增产物的片

7、段长度大增产物的片段长度大小为小为187bp,187bp,电泳的条电泳的条带也在带也在187bp187bp左右，表左右，表明扩增产物是我们的明扩增产物是我们的目的条带，并且没有目的条带，并且没有非特异性条带，无引非特异性条带，无引物二聚体。物二聚体。PCRPCR常见问题与对策常见问题与对策PCRPCR反应的关键环节有：反应的关键环节有： 模板核酸的制备模板核酸的制备 引物的质量与特异性引物的质量与特异性 酶的质量及纯度酶的质量及纯度 PCRPCR循环条件循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。问题一：问题一：酶失活酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时

8、使用，：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加需注意的是有时忘加TaqTaq酶或溴乙锭。酶或溴乙锭。引物引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是是否对称，是PCRPCR失败或扩增条带不理想、容易弥失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。散的常见原因。 Mg2+Mg2+浓度浓度: Mg2+: Mg2+浓度过低影响浓度过低影响PCRPCR扩增产量甚至扩增产量甚至 PCRPCR扩增失败而不出扩增条带扩增失败而不出扩增条带变性：退火温度太高，延伸时

9、间太短变性：退火温度太高，延伸时间太短靶序列变异靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其物与模板失去互补序列，其PCRPCR扩增是不会成功的。扩增是不会成功的。 问题二：无扩增产物问题二：无扩增产物现象：现象：对照有条带，而样品无对照有条带，而样品无原因原因: :1 1、模板、模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2 2、BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3 3、引物设计不当或者发生降解、引物设计不当或者发生降解4 4、反应条件：退

10、火温度太高，延伸、反应条件：退火温度太高，延伸 时间太短时间太短对策对策: :1 1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2 2、更换、更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3 3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4 4、降低退火温度、延长延伸时间、降低退火温度、延长延伸时间 问题三：问题三：PCR PCR 产物量过少产物量过少现象：现象：有条带，但产物量过少有条带，但产物量过少原因原因: :1 1、退火温度不合适、退火温度不

11、合适2,2,、DNA DNA 模板量太少模板量太少3 3、PCR PCR 循环数不足。循环数不足。4 4、引物量不足、引物量不足5 5、延伸时间太短、延伸时间太短6 6、DNA DNA 模板中存在抑制剂模板中存在抑制剂对策：对策：1 1、以、以 2 2 为梯度设计梯度为梯度设计梯度 PCR PCR 反应优化退火温度反应优化退火温度2 2、增加、增加 DNA DNA 模板量模板量3 3、增加反应循环数、增加反应循环数4 4、增加体系中引物含量、增加体系中引物含量5 5、以、以 1 kb/1 kb/分钟的原则设置延伸时间分钟的原则设置延伸时间6 6、确保、确保 DNA DNA 模板干净模板干净 问

12、题四：非特异性扩增问题四：非特异性扩增现象：现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：原因：1 1、引物特异性差、引物特异性差2 2、模板或引物浓度过高、模板或引物浓度过高3 3、酶量过多、酶量过多4 4、Mg2+Mg2+浓度偏高浓度偏高5 5、退火温度偏低、退火温度偏低6 6、循环次数过多、循环次数过多对策：对策：1 1、重新设计引物或者使用巢式、重新设计引物或者使用巢式PCRPCR2 2、适当降低模板或引物浓度、适当降低模板或引物浓度3 3、适当减少酶量、适当减少酶量4 4、降低镁离子浓度、降低镁离子浓度5 5、适当提高退火温度或使用二阶段

13、温度法、适当提高退火温度或使用二阶段温度法6 6、减少循环次数、减少循环次数阳性对照marker 问题五：拖尾问题五：拖尾现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈SmearSmear状态状态原因：原因：1 1、模板不纯、模板不纯2 2、BufferBuffer不合适不合适3 3、退火温度偏低、退火温度偏低4 4、酶量过多、酶量过多5 5、dNTPdNTP、Mg 2+Mg 2+浓度偏高浓度偏高6 6、循环次数过多、循环次数过多对策：对策：1 1、纯化模板、纯化模板2 2、更换、更换BufferBuffer3 3、适当提高退火温度、适当提高退火温度4 4、适量用酶、适量用酶5 5、适当降低、适当降

14、低dNTPdNTP和镁离子的浓度和镁离子的浓度6 6、减少循环次数、减少循环次数 问题六：杂带问题六：杂带现象：现象：扩增产物出现多条带扩增产物出现多条带原因：原因：1 1、引物用量偏大或引物的特异性不高、引物用量偏大或引物的特异性不高2 2、模板量过多、模板量过多3 3、酶的用量偏高或酶的质量不好、酶的用量偏高或酶的质量不好4 4、退火温度偏低，退火及延伸时间偏长、退火温度偏低，退火及延伸时间偏长5 5、外源、外源 DNA DNA 污染污染对策：对策：1 1、应降低引物的使用量或调换引物、应降低引物的使用量或调换引物2 2、质粒、质粒 DNA DNA 的用量应的用量应 50 50 ngng，

15、而基因，而基因组组 DNA DNA 则应则应 200 200 ngng3 3、应降低酶量或调换另一来源的酶、应降低酶量或调换另一来源的酶4 4、应提高退火温度，减少变性与延伸时、应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的间，也可采用二种温度的 PCR PCR 扩增。扩增。5 5、确保操作的洁净、确保操作的洁净 问题七：扩增产物在凝胶呈弥散状问题七：扩增产物在凝胶呈弥散状现象：现象：扩增产物在凝胶呈弥散状扩增产物在凝胶呈弥散状原因：原因：1 1、酶量过高或酶的质量差、酶量过高或酶的质量差2 2、dNTPdNTP 浓度过高浓度过高3 3、模板量过多、模板量过多4 4、引物浓度不够优化、

16、引物浓度不够优化5 5、循环次数过多、循环次数过多对策：对策：1 1、减少酶量或调换另一来源的酶、减少酶量或调换另一来源的酶2 2、减少、减少 dNTPdNTP 的浓度的浓度3 3、质粒、质粒 DNA DNA 的用量应的用量应 50 50 ngng，而基，而基因组因组 DNA DNA 则应则应 200 200 ngng4 4、对引物进行梯度稀释重复、对引物进行梯度稀释重复 PCR PCR 反应反应5 5、减少循环次数、减少循环次数 问题八：假阳性问题八：假阳性现象：现象：空白对照出现目的扩增产空白对照出现目的扩增产物物原因：原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染对策：对策：

17、1 1、操作时应小心轻柔，防止将靶、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管序列吸入加样枪内或溅出离心管外；外；2 2、除酶及不能耐高温的物质外，、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。次性使用。3 3、各种试剂最好先进行分装，然、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。后低温贮存。 相关相关PCRPCR技术技术逆转录逆转录PCRPCR（RT-PCRRT-PCR）：以由：以由mRNAmRNA逆转录而来的逆转录而来的DNADNA为为模板，由此产生出来的模板，由此产生出来的-D

18、NA-DNA不带有内含子，常应用不带有内含子，常应用于分子克隆技术。于分子克隆技术。- -荧光定量荧光定量PCR PCR （qRTqRT-PCR-PCR）：）：PCRPCR过程中利用荧光探过程中利用荧光探针或染料定量检测，利用荧光信号积累实时监测整个针或染料定量检测，利用荧光信号积累实时监测整个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法析的方法RT-PCRRT-PCRTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTReverse TranscriptionmRNAAAAAAAAAAAAAADNA水平水平RNA水

19、平水平基因基因cDNAmRNAmRNART-PCRRT-PCR一般步骤：一般步骤：RNARNA提取（提取（-70-70保存）保存）1 1、组织剪碎加入、组织剪碎加入1ml 1ml TrizolTrizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停），冰上匀浆（边匀浆边暂停）2 2、转入一新、转入一新EPEP管中（管中（1.5ml1.5ml），室温保存），室温保存5min5min3 3、加氯仿、加氯仿0.2ml0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min5min4 4、10000 rpm 410000 rpm 4离心离心15min15min5 5、转移上层水相（吸、转移上层水

20、相（吸70%70%）到一新）到一新EPEP管中，加异丙醇管中，加异丙醇0.5ml,0.5ml,振荡混合，室温保存振荡混合，室温保存10min10min，12000rpm 4 12000rpm 4 离心离心15min15min6 6、倒掉上清，加、倒掉上清，加1ml 75%1ml 75%无水乙醇（无水乙醇（44保存），振荡混保存），振荡混合，合，10000rpm 4 10000rpm 4 离心离心5min5min7 7、倒掉上清，室温或、倒掉上清，室温或3737放置放置20min(EP20min(EP管倒置在滤纸上管倒置在滤纸上) )使使RNARNA沉淀干燥沉淀干燥8 8、加、加20ul DEP

21、C20ul DEPC水至水至EPEP管中管中9 9、在、在6060孵育孵育3-5min(3-5min(或手握或手握3-5min),3-5min),使使RNARNA充分溶解充分溶解测测RNARNA浓度浓度 调零：调零：750ul DEPC750ul DEPC水水 测量：测量：745ul DEPC745ul DEPC水水 + 5ul RNA+ 5ul RNA 总总RNARNA浓度浓度= OD260= OD2604040稀释倍数（稀释倍数（150150倍）倍）ugug/ml/ml = OD260 = OD2604040150 150 ugug/ml/ml = OD260 = OD2606 6 ugu

22、g/ /ulul A1/A2 A1/A2应在应在1.8-2.01.8-2.0之间之间反转录：反转录： 在微量离心管中加入模板在微量离心管中加入模板RNA 2ugRNA 2ug，OligOlig( (dTdT)18(0.1ug/)18(0.1ug/ulul) 5ul) 5ul，10mmol/L 10mmol/L dNTPdNTP 2ul 2ul，DEPCDEPC水补足体积至水补足体积至14ul14ul，6565水浴水浴5min5min，立即放到冰上，立即放到冰上，顺序依次如下：顺序依次如下： 5 5* *M-MLVM-MLV反应缓冲液反应缓冲液 4ul4ul 核酸酶抑制剂（核酸酶抑制剂（25U/

23、25U/ulul） 1ul1ul M-MLV M-MLV反转录酶（反转录酶（100U/100U/ulul） 1ul1ul 37 37孵育孵育60min60minPCRPCR反应：反应： 反转录产物（模板）反转录产物（模板） 2ul2ul 10 10* *PCRPCR反应缓冲液反应缓冲液 5ul5ul 10mmol/L 10mmol/L dNTPdNTP 4ul 4ul 引物（引物（50umol/L50umol/L） 1ul1ul TaqTaq酶（酶（50U/50U/ulul） 0.5ul0.5ul DEPC DEPC水水 37.5u37.5u设置扩增程序：设置扩增程序： 94 5min 94

24、5min热启动，热启动， 94 45s94 45s， 57 30s57 30s， 72 1min72 1min， 72 10min72 10min30cycle30cycleqRTqRT-PCR-PCRTaqManTaqMan法法 SYBR Green 1SYBR Green 1法法 TaqManTaqMan法法TaqManTaqMan法反应体系：法反应体系：总总RNA RNA 根据实验根据实验qPCRqPCR mix mix（包含（包含MLVMLV、Hot-start Hot-start TaqTaq、dNTPdNTP等等 ） 终浓度为终浓度为1 1 TaqmanTaqman Probe P

25、robe 根据实验根据实验上游引物，上游引物，1010M M 终浓度：终浓度：200 200 nMnM 下游引物，下游引物，1010M M 终浓度：终浓度：200 200 nMnM MgCl2 MgCl2 根据实验根据实验RNaseRNase-Free H2O To 25.0 -Free H2O To 25.0 l l设置程序：设置程序： PCR PCR 反应条件如下：反应条件如下：步骤步骤 循环数循环数 步骤步骤 温度温度 时间时间逆转录逆转录 1 1 42 30 min 1 1 42 30 min 失活失活 MLVMLV，激活激活 TaqTaq 实时荧光实时荧光定量定量 PCRPCR1 1

26、 951 1 95 10 min10 min4040 1 95 1 95 15 sec15 sec 2 60 2 60 1 min1 min SYBR Green 1SYBR Green 1法法 SYBR Green 1 SYBR Green 1是一种与双链是一种与双链DNADNA小沟结合的荧光染料。小沟结合的荧光染料。 SYBR Green 1 SYBR Green 1 只与只与DNADNA双链结双链结合才能发出荧光。合才能发出荧光。荧光信号强弱与双链荧光信号强弱与双链DNADNA分子数分子数成正比，随着扩增产物增加而增成正比，随着扩增产物增加而增加加未结合未结合SYBRSYBR Green

27、Green 1 1 染料染料SYBR GreenSYBR Green法反应体系：法反应体系：总总RNA RNA 根据实验根据实验qPCRqPCR mix mix（包含（包含MLVMLV、Hot-start Hot-start TaqTaq、dNTPdNTP等等 ） 终浓度为终浓度为1 1 SYBRGreenSYBRGreen I solution I solution 终浓度为终浓度为1 1 上游引物，上游引物，1010M M 终浓度：终浓度：200 200 nMnM 下游引物，下游引物，1010M M 终浓度：终浓度：200 200 nMnM MgCl2 MgCl2 根据实验根据实验RNas

28、eRNase-Free H2O To 25.0 -Free H2O To 25.0 l l设置程序：设置程序： PCR PCR 反应条件如下：反应条件如下：步骤步骤 循环数循环数 步骤步骤 温度温度 时间时间逆转录逆转录 1 1 42 30 min 1 1 42 30 min 失活失活 MLVMLV， 激活激活 TaqTaq 实时荧光实时荧光定量定量 PCRPCR 2 X 2 X 30 sec 30 sec 40403 723 72 30 sec 30 sec 1 1 951 1 95 10 min10 min 1 95 1 95 15 sec15 secTaqManTaqMan法与法与SYB

29、R SYBR Green 1Green 1法的比较法的比较定量与普通定量与普通PCRPCR的差别的差别PCRPCR的小技巧的小技巧 模板：纯度要高，完整性要好，浓度要适当模板：纯度要高，完整性要好，浓度要适当 引物：一次多设计几组，同时引物：一次多设计几组，同时PCRPCR；拿到的引物一；拿到的引物一般是干粉，尽量用其中一管，避免反复冻融；前般是干粉，尽量用其中一管，避免反复冻融；前期引物设计多花心思，提高引物质量期引物设计多花心思，提高引物质量 聚合酶：有条件者全程用聚合酶：有条件者全程用PfuPfu高保真酶，防止突变高保真酶，防止突变；严格放置冰盒，防止失活；严格放置冰盒，防止失活 操作操作细节：全程严格无菌；所有东西现配现用；细节：全程严格无菌；所有东西现配现用；动作轻柔；有针对性地做温度梯度、引物梯度、动作轻柔；有针对性地做温度梯度、引物梯度、模板浓度梯度模板浓度梯度实验室现有的实验室现有的PCRPCR仪仪 细节细节决定成败决定成败公用平台的维护，人人有责公用平台的维护，人人有责 谢谢大家！谢谢大家！