2022年基因工程重点复习 .pdf

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1、学习必备欢迎下载质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数） 多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，13 拷贝松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，1060 拷贝天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、 遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。优点 ; 利用大肠杆菌进行基因克

2、隆、表达 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。蓝白斑筛选的机理由 -互补产生的 Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物 X-gal(5- 溴-4氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷 )下存在下被 IPTG(异丙基硫代 - -D-半乳糖苷 )诱导形成蓝色菌落。 当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活 , 产生的氨基酸片段失去 -互补能力 , 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上， -互补产生的 Lac+细菌由于含 - 半乳糖苷酶，能分解麦康凯培

3、养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去- 互补能力，因而不产生- 半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。这样， LacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的 -半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做-互补蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液

4、溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。 （三） 蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用方法：1. 等电点沉淀法2. 盐析法（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、 盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析蛋白筛选（ SDS ）实验原理是：在电场 的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷 有关。十二烷基磺酸钠（SDS ）能

5、与 蛋白质 的结合，改变 蛋白 质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE 中， SDS-复合物的 迁移率 不再受蛋白的电荷和形状的影响， 而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线， 再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。精选学习资料 - - - - - -

6、 - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 10 页学习必备欢迎下载mRNA 翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体包涵体表达形式的优点1 能简化外源基因表达产物的分离操作：2 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定3 对宿主细胞无伤害4 外源蛋白表达高包涵体表达形式的缺点： 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变

7、性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。(以包涵体形式表达目的蛋白的操作：如果未进行特殊设计，外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上， 这种高表达率也是包涵体法的长处所在分泌型异源蛋白的表达： 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体） 状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N 端信号肽序列的存

8、在是蛋白质分泌的前提条件分泌表达形式的优点)：1 目的蛋白稳定性高2 目的蛋白易于分离3 目的蛋白末端完整分泌表达形式的缺点)：大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全，信号肽并非总是有助于蛋白质的转运，有可能形成包涵体。分泌型目的蛋白表达系统的构建：只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时， 用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。融合型异源蛋白的表达：除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并

9、作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。以融合形式表达目的蛋白的优缺点1 目的蛋白稳定性高2 目的蛋白易于分离3 目的蛋白表达率高 4 目的蛋白溶解性好5目的蛋白需要回收(缺点 ) 融合蛋白表达质粒的构建原则）：受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下， 并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件外。两个蛋白编

10、码序列应保持一致的翻译阅读框架大肠杆菌表达外源基因的优势1 全基因组测序，共有4405 个开放型阅读框架2 基因克隆表达系统成熟完善3 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定4 被美国 FDA 批准为安全的基因工程受体生物限制性内切核酸酶：是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸水解酶。1、 型限制性内切核酸酶的基本特性有哪些？只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA 分子具有严格的特异性精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 10 页学习必备欢迎下载识别序列的特异性

11、：识别序列为4-6bp 的双重螺旋对称结构的回文序列切割位点的特异性：在识别序列内或附近特异切割。3、DNA 连接酶的作用特点有哪些？了解这些特点有何利用价值？作用特点：不能连接两条单链DNA 或环化 DNA ，只能连接双链DNA 分子的单链缺口。只能连接失去一个磷酸二酯键形成的单链断裂，不能连接缺失一个或多个氨基酸缺口只作用于 3 端羟基和5 端磷酸的链连接反应需要ATP 或 NAD+ 和 Mg2+ 利用价值：可对缺口DNA ，平末端DNA ，黏性末端DNA 进行连接。载体：能携带外源基因（或DNA 片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。质粒载体：存在于多种宿主细胞中，独立于染色体外的可自主

12、复制闭合环状的DNA 分子，整合或表达的工具。噬菌体载体：应用噬菌体作为载体，广泛应用于大片段DNA克隆和文库构建的一类载体，代表有类噬菌体载体，M13 噬菌体载体。RNAi ：RNA 干扰，是双链RNA 对基因表达的阻断作用被称为RNA 干扰。VIGS ：病毒诱导的基因沉默，是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物， 植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的目的基因mRNA 降解，从而达到基因沉默的目的。1、克隆载体必须满足那些基本条件？基本条件： 具有对受体细胞

13、的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；能在宿主细胞中自主复制， 并实现外源基因的增殖；具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因的插入；具有合适的选择性标记，用于筛选。2、质粒具有那些特征？特征：独立复制性：质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区，能利用寄主细胞的DNA 复制系统进行自主复制。质粒的不相容性：两种质粒在同一宿主细胞中不能共存转移性：其含有tra 基因，能指令宿主细胞与受体细胞结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA 上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，如物

14、质抗性和物质合成。3、你认为理想的载体应该是怎样的？如何设计？理想的载体：分子较小，可携带比较大的片段；能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制；要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点，MCS ）； 有适合的标记，易于选择；有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达；从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。设计：加入合适的选择标记基因增加或减少合适的酶切位点缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量改变复制子，变严谨为松弛， 变少拷贝为多拷贝根据基因工程的要求，假装特殊的基因

15、元件精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 10 页学习必备欢迎下载基因工程定义： 在体外将外源基因进行切割并与一定的载体连接，构成重组DNA分子并导入相应受体细胞， 使外源基因在受体细胞中进行复制、表达， 使目的基因大量扩增或得到相应基因的表达产物或进行定向改造生物性状。上游技术：（狭义基因工程）外源基因重组、克隆和表达的设计与构建下游技术：（广义基因工程）含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。基本过程 ： （操作）从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出

16、带有目的基因的DNA片断。（切）用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。（接）目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。（转）把重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。（选）筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表基因工程的四大要素：目的基因、载体、工具酶、宿主细胞。限制性内切酶的概念：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并由此处切割 DNA双链结构的核酸内切酶。限制性内切酶的类型：I 型：修饰限制类型： 多功能； 蛋白质结构： 异源三聚体； 辅助因子：ATP Mg2+ SAM；识别序列：TGAN8TGCT AACN6GTG

17、C（单链） ; 切割位点 : 距识别序列1kb 处随机性切割。 II型：修饰限制类型： 单功能； 蛋白质结构： 同源二聚体； 辅助因子 Mg2+；识别序列：旋转对称；切割位点：识别序列内部，或附近特异性切割。III型：修饰限制类型： 双功能；蛋白质结构： 异源二聚体； 辅助因子：ATP Mg2+ SAM 识别序列：GAGCC CAGCAG；切割位点：距识别序列下游24-26bp 处单链切割II型限制性内切酶的特点：H.O. Smith 和 K.W. Wilcox 在 1970 年从流感嗜血菌中分离出来分离的第一个酶Hind 。每种型酶通常只有一种多肽, 并以同源二聚体的形式存在。(1) 识别并

18、切割特定的核苷酸序列，该序列称为核苷酸内切限制酶的识别序列，又称靶子序列、切割位点。(2) 不同的酶具有不同的识别序列，这些序列一般由4-8 个核苷酸组成，并成回文结构（Palindromic）即双重旋转对称的结构形式，也称二重对称结构(3) 不同的酶水解DNA双链切点处的葡萄糖磷酸二酯键，从而导致链的断裂，产生特定的酶切末端 - 粘性末端（ sticky end ，cohensive end）或平末端（ blunt end）影响酶切活性的因素（型限制性内切核酸酶酶切体系的建立）：内因： 星星活性、底物甲基化和底物的构象。 （构象的影响主要是指切割线性DNA和超螺旋DNA使得活性差异）DNA的

19、纯度、浓度 外因： 可预见，可控制的，如反应条件，底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染） 、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等。其他的原因 ：酶切反应的体积、适当的延长反应的时间、加大酶的用量、缓冲液的的选择：提供稳定的PH 、Mg2+ DDT （二硫苏糖醇）BSA （小牛血清）后两者都是保证酶切的稳定性。反应的温度， 应当在最适反应温度大部分都是在37。反应时间： 通常为一小时或者更多，适当延长反应时间可以减少酶的用量。位点偏爱： 某些限制酶对同一底物中的有些位点表现除偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现除不同的切割效率，这种现象称作位点偏爱（si

20、te preference）星星活性： 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性（ star activity）DNA 聚合酶的定义： DNA聚合酶 (DNA polymerase) 的主要活性是催化DNA的合成 ( 在具备模板、引物、 dNTP等的情况下 ) 及其相辅的活性DNA聚合酶所具有的活性：（1） DNA聚合酶的5 3 聚合活性DNA聚合酶最主要的活性 （2）精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 10 页学习必备欢迎下载DNA聚合酶的3 5外切核酸酶活性：从3 5方向识别并切除

21、DNA生长链末端与模板 DNA不配对而游离的核苷酸，这种校对功能是保证其聚合作用的正确性不可缺少的，因此对于 DNA复制中极高的保真性是至关重要的（3）DNA聚合酶的5 3 外切核酸酶活性：从DNA链的 5 端向 3 末端水解已配对的核苷酸，本质是切断磷酸二酯键，每次能切除10 个核苷酸。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用，对完成的DNA片段去除5端的 RNA引物也是必须的。噬菌粒载体：由质粒载体和单链噬菌体载体结合而发展成的一种载体系列。考斯质粒（ COS ） ： 一类人工构建的含有-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体酵母人工染色体载体：利用酵母的染色体的复制元件

22、构建的载体。分子杂交的概念：分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量Southern 杂交 的操作步骤：一、预处理 1. 用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。 2. 将酶切后的 DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。3. 将电泳出来的那块凝胶泡在强碱溶液中，使双链解旋变成单链DNA 。4. 用酸中和，使单链DNA维持其状态。二、原位转移：将凝胶上的dsDNA转移到滤膜上。三、固定：在真空烤箱里，80下烤 12个小时将核酸样品进一步固定在滤膜上。四、杂交：将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，

23、溶液上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。五、漂洗：将滤膜上没有和单链 DNA样品结合的右利的探针分子漂洗下来，滤膜上只剩下杂交分子。六、放射自显影：在X光曝射下进行放射自显影形成的自显影照片。七、比较鉴定：将放射自显影图片上的谱带进行比较。确定与分子探针接合的DNA分子是凝胶上DNA链上的哪个片段。Northern杂交： 将 RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法Western 杂交 ：是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出50ng 的特异性表达蛋白PCR技术及

24、其应用：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR):简称 PCR ，是一种在体外扩增特定DNA序列的技术程序。包括 DNA的变性、 复性及多核苷酸合成三个步骤组成的多次反复的循环。成分包括：模板DNA 、引物、高温DNA聚合酶、 dNTP 、Mg2+ 基本原理 ：模板 DNA变性引物与DNA复性引物DNA延伸，进入下一个循环，再到模板DNA变性。模板 DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备模板 DNA与引物的退火( 复性 ) ：模板 DNA经加热

25、变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸： DNA模板 - 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。PCR的特点 ：1. 高灵敏度性。2. 性扩增。 3. 操作简单易行 4 应用范围广泛。基因文库 ：一种载体分子上随机克隆着某种生物的组织、器官、 细胞类型的所有DNA片段而构成的一种克隆复合体，理论上它应该包括该生物全部的遗传信息，它分为基因文库和cDNA文库。基因组文库 ： 指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力切割成一定长度范围的的 DNA

26、片段，再与合适的载体在体外重组并转化成相应的宿主细胞获得所有阳性菌落，这个群体就称为该生物的基因文库。基因组文库的构建：1. 基因组 DNA的制备 2. 基因组 DNA的片段化与分级分离3. 载体与受体的选择与制备4. 载体与外源片段的连接形成重组DNA分子 5. 重组 DNA导入受体细胞6. 重组精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 10 页学习必备欢迎下载克隆的挑选与保存7. 从基因文库中筛选目的基因。cDNA基因文库 ：将生物的某一组织细胞中的总的mRNA 分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA然后连接

27、到合适的载体上，并转入宿主细胞，这种方法形成的所有克隆的集合体叫做cDNA文库cDNA基因文库的构建：1. 细胞总的RNA的提取和mRNA 的分离 2. 第一条 cDNA的合成 3. 第二条 cDNA的合成 4. 双链 cDNA克隆进如质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。cDNA文库的特点 : 不含内含子序列， 可以在细菌中直接表达，包含了所有编码蛋白质的基因，比 DNA文库小的多容易构建。质粒的拷贝数： 指质粒在复制时与宿主的繁殖相结合，致使每个细胞中只有一个或几个质粒，质粒在细胞中的拷贝数为10200 个。转化 ：是指将外源DNA引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，感受态细胞 ：是

28、指具有吸收裸DNA分子能力的细胞，通常经一系列的处理方式可使得细胞膜的通透性发生改变，而使细胞成为感受态细胞。受体细胞 ： 是指转化的对象， 接受重组DNA的细胞，通常要求有高转化率，能保持质粒稳定，属某营养缺陷型，具其他选择标记等条件。S-D 序列 ：细菌 mRNA 翻译起点上游与16SrRNA相结合的序列。退火 ：是指 PCR等核酸分子重组过程中，即DNA加热变性后逐渐冷却的过程，基因工程的研究内容1特定目的基因的分离或合成2构建重组DNA分子 3转化宿主细胞 4筛选重组DNA菌落 5目的基因的有效表达制备外源DNA片段可以有以下5 个途径：第一，从生物基因组群体中分离目的基因（鸟枪法即限

29、制性内切酶法、反转录法）第二，人工合成第三， PCR反应合成DNA 第四， mRNA 差异显示法获得目的基因第五，机械的方法如超声波把基因组打成片段。工具酶 ：基因工程中进行基因的剪切、拼接、组合所需的酶统称为工具酶工具酶按功能分为剪切酶、修饰酶、连接酶影响限制性内切酶活性的主要因素：1.酶的纯度2.DNA样品的纯度3.DNA的甲基化程度4.酶切反应的温度与时间5.DNA分子的构型6.反应缓冲常用的聚合酶有三种：即依赖 DNA的 DNA聚合酶；依赖RNA的 DNA聚合酶；依赖DNA 的 RNA聚合酶。质粒的三种构型：共价闭合环状DNA （ cccDNA)、开环 DNA （ocDNA)、线形 D

30、NA （LDNA) 为什么要质粒质粒载体的构建？1、天然质粒的局限性（1）分子量大，拷贝数低（2）筛选标志不理想质粒载体必须具备的基本条件（1）具有复制起点（ORI）（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子质量和较高的拷贝数核酸的提取与纯化的三大步骤: 1.细胞破碎2.去除与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质, 3.除去其他杂质核酸精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 10 页学习必备欢迎下载SDS法的基本原理：利用高浓度SDS在较高温度（ 55-65 ）条件下裂解细胞，使染色体离析、 蛋白质变

31、性， 释放出核酸， 然后用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖沉淀（通常是加入5M的乙酸钾于冰上保温，在低温条件下乙酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物）。离心除去沉淀后，对上清液中的核酸进行反复抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的核酸。基因组文库与cDNA文库的区别：从定义上看，基因组文库指某种细胞内的某个基因组按一定长短要求被酶切成若干片段，与合适的载体分子重组，引入相应的细胞，形成的一大批含DNA重组体的细胞克隆群体，这样的细胞克隆群体称为基因组文库cDNA文库指以生物体RNA通常是 mRNA 为模板， 经逆转录酶作用形成cDNA再予以克隆而形成的一种基因文库。就真核生物的基因而言，mRNA

32、 前体经加工，去除内含子，且加尾polyA 成为成熟mRNA ，故 cDNA文库与基因组文库对照可用于研究内含子在基因中的位置及功能。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 10 页学习必备欢迎下载理想的分子标记： 1.高多态性 2.共显性遗传 3.能明确辨别等位基因 4.遍布整个基因组 5.无基因多效性 6.检测手段简单快速 7.成本低廉 8.重复性好原位杂交内容将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交，即菌落杂交。具体过程：将菌落或噬菌斑转移到溶菌液中的硝酸纤维素滤膜上，使溶菌变性的DNA 同滤膜杂交。 这

33、些带 DNA 印记的滤膜烤干后，再与放射性同位素标记的特异性DNA 或 RNA 探针杂交。漂洗除去未杂交的探针，同X 光底片一道曝光。根据放射自显影揭示的同探针序列有同源性的DNA 印迹位置，对照原来的平板，即可挑选出含插入序列的菌落或噬菌斑。差异杂交（ differential hybridization）是将基因组文库的重组噬菌体DNA 转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。3如何选择分离纯化重组蛋白的方法？要针对外源基因表达目标蛋白的形式和性质来选用不同的分离纯化策略和方法。主要根据蛋白质的性质和在

34、受体细胞中的位置制定分离纯化策略。如分泌型表达重组蛋白需要先沉淀浓缩再进行纯化，而天然蛋白则用层析较好。1PCR出现假阳性原因1. 引物设计不合适；选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的 PCR产物。靶序列太短或引物太短导致特异性不强。解决方案：选择特异性强的区段设计引物2. 靶序列或扩增产物的交叉污染。（1）整个基因组或大片段的污染；操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染环境。 除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离心管及枪头均应一次性使用。必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（2）空气中的小片断核酸污

35、染。这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出PCR产物，导致假阳性出现。解决方案：运用巢式PCR来减轻或消除2. 出现非特异扩增带原因1. 引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；2.Mg2+浓度过高， 退火温度过低，PCR循环次数过多；3. 酶的质量不过关，或加Taq 酶的量过多。解决方案： 1. 必要时重新设计合成引物；2. 减低酶量或调换另一来源的酶；3. 降低引物量，适当增加模板量， 减小循环次数； 4. 适当提高退火温度或采用二温度点法（94 变性， 65 左右退火与延伸）。3.PCR出现假阴性原因分析及解决方案模板因素： 1. 模板中含有杂蛋白；

36、2. 模板中含有Taq 酶抑制剂； 3. 模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋白残留；4. 提取制备模板时丢失过多；5. 模板核酸变性不彻底。解决方案： 1. 配制有效而稳定的消化处理液;2. 提取程序固定 , 不随意改动； 3. 模板 DNA的溶解液应固定不变。酶失活： 1. 酶本身的质量问题( 供应商的问题）；2. 酶存放时间太长；3. 酶存放方式不当，或其他意外原因4. 忘记添加Taq 酶。解决方案： 1. 检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq 酶； 2. 更换新的Taq 酶;3. 新旧两种Taq 酶同时使用引物： 1. 引物质量； 2. 引物浓度； 3. 两条引物的浓度是否对称等。

37、解决方案 :1. 选定一个好的引物合成单位;2. 引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度； 3. 引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装；4. 引物设计不合理，如长度不够， 引物本身或两条引物之间形成二聚体等。Mg2+ 浓度： Mg2+ 浓度对 PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性； 浓度过精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 10 页学习必备欢迎下载低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。解决方案：设置一组反应，其

38、中每一反应中的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl等），而 MgCl2 浓度不同（由0.56mmol/L, 每次增加 0.5mmol/L) ，由此来摸索最佳Mg2+ 浓度。反应体积的改变：做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。靶序列变异： 靶序列变异导致假引性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。解决方案：根据已知序列重新选择区段设计引物。物理原因： 1. 变性温度低，变性时间短；2. 退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率； 3. 延伸时间过短等。假阴性解决方案：

39、1. 提高变性温度， 延长变性时间， 特别是首次循环， 必要时可设为95 ，10min，或 PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。2. 退火温度应根据Tm值来设定， 也可首先将退火温度设为45 ，然后再逐次提高 （以 2 / 次为宜） 。 3. 延伸温度以1000bp/min 足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延伸10min。4. 基因文库与CDNA 文库有何区别？基因文库包含该生物的全部遗传信息，包括基因组间隔序列。CDNA 文库只反映着MRNA 的分子结构，不含内含子基因文库以DNA片段为材料。 CDNA 文库以 MRNA 为材料基因文库大，不易构建，筛选较难，假阳性高。CDNA

40、 文库则相反。5、PCR引物设计的原则有哪些？引物与模板要紧密互补。引物与模板之间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应。长度： 15-30bp 常用为 20mei 左右。引物碱基：G+C含量一般为40%-60% 为佳两个引物之间不应发生互补，特别应避免形成“引物二聚体”，如果无法避免，其3 端互补不应大于 2 个碱基。 应尽量避免数个嘌呤或嘧啶连续排列，避免同源序列。 引物内部避免形成次级机构，尤其发卡结构。引物的延伸从3 端开始， 3 端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能，3 末端最后1 个碱基最好是G 或 C。引物的5端限定着PCR产

41、物的长度， 它对扩增特异性影响不大。引物 3端不要终止于编码区域密码子的第3位，因密码子的第3 为易发生简并会影响扩增特异性与效率。1、什么是简并引物？设计简并引物时怎样降低简并度？简并引物： 由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以由多个可能的编码序列，称之为简并序列。相应合成这一段序列作PCR扩增体系的引物即为。简并度与选取氨基酸序列的长度和这一序列氨基酸对应密码子的多寡相关。优先选取对应密码子较少的残基，选取氨基酸序列的长度一般为5 个，对应一段15 个碱基的核苷酸序列。 放弃最后一个氨基酸放弃其密码子的第3 位碱基，因此合成14 个碱基的简并性引物，可降低简并度。4

42、、目前利用基因差异表达获得目的基因的技术主要有哪些？技术原理是什么？它们各有什么优点和缺点？答：差异显示PCR ：根据绝大多数真核细胞mRNA3 端具有的多聚腺苷酸尾（polyA ） 结构，可用含 oligo （dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA 反转录成cDNA 优点： 速度快， 操作简单， 灵敏度高而且样品需要量少，一定程度上克服了差减杂交和扣除杂技技术的不足。缺点：假阳性率高，获得的cDNA片段很短，且其3 末端含有非翻译区，使基因分类或功能预测的难度增大。cDNA代表性差异分析优点：假阳性低、特异性强、灵敏度高和重复性好缺点：操作复杂、实验周期长以及费用高抑制性消减杂交优点：假阳

43、性率低、 灵敏度高、 表达效率高、 操作简便。 缺点：只能用于两组样品对照处理，不能提供基因表达数量上的差异。RNA任意引物PCR 原理：先从样本中提取总RNA ，用随机引物合成cDNA的第一链，再用同样或者不同的引物精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 10 页学习必备欢迎下载进行 PCR 合成第二链， 凝胶电泳可以显示全部的PCR 产物， 再从中回收差异表达的基因片段，进行克隆、测序。优点：有利于处理较短的cDNA片段。缺点：假阳性率较高限制性内切核酸酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA

44、双链结构的核酸水解酶。限制 - 修饰系统：是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。同切点酶：又称同裂酶， 是一类来源于不同的微生物、识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。同尾酶：是来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的粘性末端。酶的星号活性： 限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性的现象。3、DNA连接酶的作用特点有哪些？了解这些特点有何利用价值？作用特点：不能连接两条单链DNA或环化 DNA ，只能连接双链DNA分

45、子的单链缺口。只能连接失去一个磷酸二酯键形成的单链断裂，不能连接缺失一个或多个氨基酸缺口只作用于 3 端羟基和 5 端磷酸的链连接反应需要ATP或 NAD+ 和 Mg2+ 利用价值：可对缺口DNA ，平末端DNA ，黏性末端DNA进行连接。4、为什么说反转录酶是一种特殊的DNA聚合酶，其主要用途是什么？答：反转录酶是依赖于RNA的 DNA聚合酶。反转录酶普遍存在于含RNA的反转录病毒中，它以 RNA为模板，催化合成互补的DNA单链，进而合成DNA第二条链。用途：以mRNA 为模板合成其互补DNA ，用于构建cDNA文库和基因克隆；对具5端突出的DNA片段的3端进行补平和标记，制备杂交探针；代替大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow 片段或测序酶，用于DNA序列分析。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 10 页