2022年无菌实验室操作规程 .pdf

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1、无菌实验室操作规程为无菌实验室的操作，无菌实验室的保护提供一个标准化规程，保证实验室操作顺利进行，保证实验结果的准确性。无菌实验室操作程序很重要，安徽人和净化为您提供。操作程序1、微生物检验的准备工作1.2 操作前的准备 : 1.2.1 无菌实验室使用前必须打开无菌实验室的紫外灯辐照灭菌30分钟以上，并且同时打开超净台进行吹风。以保证无菌实验室的洁净度符合要求。1.2.2 微生物检验玻璃仪器的清洗1.2.2.1按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗，可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。 洗衣粉和去污粉较难冲洗

2、干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至 10次以上充分冲洗， 或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗， 然后倒置于磁盘或木架上，在室内晾干，放烘箱烘干。1.2.2.2玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。1.2.2.3装有固体培养基的器皿应先将其弃去，然后洗涤。 带菌的器皿在洗涤前先浸在2煤酚皂溶液 （来苏尔）或 0.25 新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。1.2.2.4盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用

3、，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次， 晾干或烘干后备用。1.2.2.5准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择的培养基。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 6 页 - - - - - - - - - 1.3 消毒、灭菌微生物检验用器材及场所必须进行灭菌或消毒处理，不同的对象采用不同的处理方法。1.3.1 高压蒸汽灭菌 : 工作服、口罩、稀释液等，置高压杀菌锅内，一般采用121灭菌半小时，当然不同的培养

4、基有不同的要求，应分别处理1.3.2 火焰灭菌：接种针、接种环等可直接火焰灭菌1.3.3 高温干燥灭菌：各种玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160灭菌 2小时 。1.3.4 一般消毒 : 无菌实验室内的凳、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法进行灭菌， 必须用其他方法进行消毒处理，采用2% 石炭酸或来苏儿水溶液擦拭消毒，工作人员的手也用此法进行消毒。1.3.5 空气的消毒：开启紫外灯照射3060分钟即可。2、培养基的配制、验证及存储培养基制备的质量将直接影响微生物生长。由于各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下。2.1 根据培养基配方的成分按量称取

5、，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。2.2 PH 测定及调节：PH 测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加进碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH 值一定要正确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需留意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、往氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH 后再加进。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页

6、，共 6 页 - - - - - - - - - 2.3 培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤， 以除往沉淀物， 必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。2.4 培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要留意不因加热而降低其营养价值，一般12115min即可， 如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等， 则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC 、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50左右再加进。2.5 每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。假如是

7、生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置 4冰箱存放。2.6 目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测 PH ，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。2.7 每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作职员等应做好记录，以备查询。3、样品的采集：接到第一检查站通知后，提前30分钟到达生产现场，双方确认生产品种、下辊时间后相互签字后，检验员用75% 酒精棉球擦手两次，用灭菌刀取样，放到事先灭好菌的纸袋中，带

8、回放入无菌实验室中待检，并做好标识。4、样品的微生物检验4.1 化验员进入无菌实验室前，必须用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换专用工作服，鞋，帽子，口罩和手套( 或用 75% 的乙醇再次擦拭双手) ，方可进入无菌实验室进行操作。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 6 页 - - - - - - - - - 4.2 供试品在检查前，应保持外包装完整，不得开启，以防污染。检查前，用70的酒精棉球消毒外表面。4.3 检查酒精等内酒精体积是否在2/3 处，不足时

9、先加好无水酒精，擦干净洒在瓶外的酒精方可点燃酒精灯。4.4 用75% 的后酒精再次擦拭消毒双手，用镊子取出酒精棉球点燃，在待检样瓶口和稀释水瓶口处环绕几圈对瓶口灭菌。4.5 纸样的预处理：用无菌剪剪开信封，无菌镊子取出样品，用同样的方法将样品剪成5mm 5mm 左右的方块， 放在天平台上的灭菌纸上，称取样品无菌操作将样品置于灭菌生理盐水中，摇动 10分钟，使纸样充分湿润，完全浸泡在无菌生理盐水中，注意不可用力过猛，小心样液溅出。4.5 如果样品所含细菌较多需稀释时，应以无菌方法吸取1ml样液注入盛有 9ml灭菌生理盐水中，吸上来在轻吹下去往复2-3 次混匀成 1:10 稀释液，吸取1:10 稀

10、释液 1ml注入盛有 9ml灭菌生理盐水中混匀成1： 0:1 稀释液，如此递增西施一次，必须更换一支灭菌吸管。4.6 打开培养皿灭菌桶，取出所需的培养的培养皿并在培养皿上做好标识。4.7 吸取液体样品前，灭菌吸管在使用前下端需通过火焰灭菌（再火焰上来回灼烧三次以上）稍冷再用。4.7 移取样品前应充分混匀，再用灭菌吸管吸取1ml注入做好标识的培养皿中。4.8 每个培养皿中倒入冷却至约45的培养基 15-20ml ，立即平摇培养皿，时代测样品能够均匀分散于培养基中。4.9 样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字做好纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求具体、清楚、真实、客观、不

11、得涂改和伪造。4.10 工作完毕， 将酒精灯帽扣上，两手应用肥皂或洗手液洗净，必要时先用 2% 消毒液消名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 6 页 - - - - - - - - - 毒，然后用水冲洗。 如果菌也洒在桌面或地面上，应立即用 5% 石碳酸溶液或 3% 的来苏尔倾覆在被污染处至少30分钟，再做处理。5、培养培养基冷却后，翻转培养基，使培养皿底在下面，放入37培养箱中培养。6、样品的留存：纸样做好标识留存48小时以上， 已备待查。 检验完毕的培养基放

12、在冰箱中留存48小时以上以备待查。7、无菌检验出现异常数据时：站长在日常巡视时，发现异常时及时对生产盐水、培养基，操作空白进行排查，立即组织复测，当检验员发现菌落异常时，立即汇报给站长，进行排查，组织复检。8、废弃物处置8.1 处置程序8.1.1 检验后的废气物必须随时清除，并及时送到指定地点加以处理。检验后的废弃样品，若对环境无害，可做为垃圾处置。8.1.2 液体废物一般可加漂白粉进行氯化消毒处理。固体可燃性废物分类收集、处理、一律及时焚烧。 固体非可燃性废物分类收集，可加漂白粉进行氯化消毒处理。满足消毒条件后作最终处置。8.1.3.若经过物理、 化学方法处理后能转化为无害的或达到排放标准的

13、有害废弃物，在经过妥善处理后，克排放处理。8.1.4 一次性使用的制品如手套、帽子、工作物、口罩等使用后放入污物袋内集中烧毁。8.1.5. 应有盛装废弃物的容器，最好是防碎裂的，里面盛装适宜的消毒液，消毒液使用时新鲜配制。 把消毒液及废弃物倒入一个容器里以备高压灭菌。盛装废弃物的罐子在再次名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 6 页 - - - - - - - - - 使用前应高压并洗净。可重复利用的玻璃器材如玻片、吸管、玻瓶等可以用1000-3000mg/L有

14、效氯溶液浸泡2-6h. 然后清洗重新使用，或者废弃。8.1.6. 用来盛放的容器应用消毒液浸泡；严格与感染性生物材料区分，防止二者混放；过期的生物性试剂应废弃，禁止使用。盛标本的玻璃、塑料、搪瓷容器可煮沸15min. 或者用1000mg/L有效氯漂白粉澄清液浸泡2-6h，消毒后用洗涤剂及流水刷洗、沥干； 用于微生物培养的，用压力蒸汽灭菌后使用。8.1.7. 微生物检验接种培养过的琼脂平板应压力灭菌30min，趁热将琼脂倒弃处理。8.2 处置规定8.2.1 、检验过程中产生的任何污染材料未经消毒不能拿出实验室。8.2.2 、液体废弃物必须收集在防漏、未破的容器内，经高浓度化学消毒剂处理。8.2.3 、对剩余标本、接触过的培养基、菌种等丢弃前均须适当消毒。8.2.4 、对于任何有污染的锐器如针头、注射器、玻璃等在处理前不要用手接触。安徽人和净化名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 6 页 - - - - - - - - -