动物细胞融合与单克隆抗体课件ppt.ppt

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1、2.2.22.2.2动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体 又称为又称为细胞杂交细胞杂交。指两指两个或多个动物细胞结合形成个或多个动物细胞结合形成一个细胞一个细胞的过程。的过程。 杂交细胞：杂交细胞：融合后形成融合后形成的具有原来两个或多个细胞的具有原来两个或多个细胞遗传信息的遗传信息的单核细胞单核细胞，称为称为杂交细胞。杂交细胞。（一）（一）. .动物细胞融合概念动物细胞融合概念植物细胞植物细胞 A A（番茄）番茄）植物细胞植物细胞 B B（马铃薯）马铃薯）去除细胞壁去除细胞壁原生质体原生质体 A A原生质体原生质体 B B原生质体融合原生质体融合正在融合的原生质体正在融合的原生质

2、体再生出细胞壁再生出细胞壁杂种细胞杂种细胞脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株( (番茄马铃薯番茄马铃薯) )再分化再分化 1、植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？、植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？ 2、动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？、动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？ 3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？哪些？4、动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他、动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？方法吗？酶解法，纤维素酶和果胶酶。酶解法，纤维素酶和果胶酶。无需，因为动物细胞无

3、细胞壁。无需，因为动物细胞无细胞壁。物理方法：离心、振动、电激；化学方法：聚乙二醇物理方法：离心、振动、电激；化学方法：聚乙二醇能能 ； 还可以利用灭活的病毒进行诱导还可以利用灭活的病毒进行诱导5、为什么灭活的病毒能作为诱导剂？、为什么灭活的病毒能作为诱导剂？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。（二）（二）. .原理：原理：细胞膜的流动性。细胞膜的流动性。 （三）（三）. .促进细胞融合方法促进细胞融合方法物理法：电激、振动、离心等物理法：电激、振动、离心等化学法：聚乙

4、二醇（化学法：聚乙二醇（PEGPEG）生物法：灭活的病毒（最常用）生物法：灭活的病毒（最常用）不同不同DNADNA的两个细胞的两个细胞灭活病毒灭活病毒诱导细胞融合诱导细胞融合融合后的融合后的细胞（杂交细胞）细胞（杂交细胞）进进行行有丝分裂有丝分裂（动物细胞培养技术）（动物细胞培养技术）（四）（四）. . 动物细胞融合过程动物细胞融合过程 产生杂交细胞，即具有原来两个或多个细产生杂交细胞，即具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。胞遗传信息的单核细胞。（五）（五）. . 结果结果最重要的用途是制备单克隆抗体。最重要的用途是制备单克隆抗体。（六）（六）. . 用途用途主要用于制备主要用于制备单克

5、隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）生物：灭活的病毒生物：灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振动、电激）动、电激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导融合方法诱导融合方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合过程细胞融合过程细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞的全能性细胞的全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目（七）植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较（七）植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较 人们获

6、得抗体的传统方法人们获得抗体的传统方法是什么是什么? ?动物体内动物体内刺激刺激抗体抗体 筛选单一浆细胞筛选单一浆细胞不能无限增殖产生大量抗体不能无限增殖产生大量抗体 抗原抗原 浆细胞浆细胞 这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么? ? 产量低、纯产量低、纯度低度低，制备的抗体特异性差。，制备的抗体特异性差。血清血清每一个浆细胞每一个浆细胞只能产生一种只能产生一种特异性抗体特异性抗体体内产生的体内产生的特异性抗体特异性抗体多达百万种多达百万种如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术动物细胞融合技术动物细胞

7、融合技术单单克克隆隆抗抗体体 既能产生特异性抗体，既能产生特异性抗体， 又能大量繁殖的细胞又能大量繁殖的细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能无限增能无限增殖殖一个一个浆细胞只分泌浆细胞只分泌一种一种特异性抗体特异性抗体设计方案：设计方案：（一）（一）. .单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念 由由单个单个B B淋巴淋巴细胞（浆细胞）经过细胞（浆细胞）经过克隆克隆形成的形成的细胞群细胞群，这一细胞群所产生的，这一细胞群所产生的化学性质单一、特化学性质单一、特异性强异性强的抗体称为单克隆抗体。的抗体称为单克隆抗体。 （二）（二）. .单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程（二）（二）. .单克隆抗体的制备过程

8、单克隆抗体的制备过程（二）（二）. .单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程诱导诱导融合融合选择培养基选择培养基继续培养，筛选继续培养，筛选克隆能产生克隆能产生抗体的阳性细胞抗体的阳性细胞体外培养或体外培养或小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖动物细胞融合动物细胞融合动物细胞培养动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原蛋白给小鼠注射特定的抗原蛋白B B淋巴细胞（免疫）淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交细胞杂交细胞杂交细胞（杂交细胞（ B-B-瘤细胞）瘤细胞）单克隆抗体单克隆抗体杂交瘤细胞杂交瘤细胞瘤瘤-瘤细胞瘤细胞B-瘤细胞瘤细胞 B-B细胞细胞 骨髓瘤细胞是癌细胞吗？骨髓瘤细胞是癌细胞吗？ 有无限增

9、殖能力有无限增殖能力（丧失凋亡机制，失去（丧失凋亡机制，失去接触抑制等）接触抑制等）的细胞是肿瘤细胞的细胞是肿瘤细胞，而具有转而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞。肿瘤细胞。肿瘤细胞不等于癌细胞。不等于癌细胞。1.1. 动物特异性免疫动物特异性免疫2.2. 分离分离B B淋巴细胞淋巴细胞（B B）；）；找到骨髓瘤细胞找到骨髓瘤细胞（G G）。）。3.3. 细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式: :（BB;BG;GGBB;BG;GG）4.4. 第一次筛选：在第一次筛选：在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂杂交瘤细胞交瘤细胞（只有（只有BGBG杂

10、交瘤细胞存活杂交瘤细胞存活）。5.5. 第二次筛选：对已经选择性培养的杂交瘤细胞进行第二次筛选：对已经选择性培养的杂交瘤细胞进行“克隆化培养克隆化培养”，并进行并进行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检检测阳性测阳性”的即是所需要的杂交瘤细胞。的即是所需要的杂交瘤细胞。6.6. 选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射或注射到到小鼠腹腔内小鼠腹腔内增殖。增殖。7.7. 提取单克隆抗体。提取单克隆抗体。单抗的制备过程要点：单抗的制备过程要点：第第1 1次筛选得到杂交瘤次筛选得到杂交瘤细胞（有多种）。细胞（有多种）。第第2 2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交

11、瘤细胞。次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。1 1、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合？细胞融合？ 这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体而可以获得大量单克隆抗体特特异性强，灵敏度高，可大量制备。异性强，灵敏度高，可大量制备。（三）（三）. .单克隆抗体的优点单克隆抗体的优点 1 1、作为诊断试、作为诊断试剂：剂： 具有准具有准确、高效、简易、快速特点确、高效、

12、简易、快速特点. . 2 2、用于治疗疾病和运载药物：、用于治疗疾病和运载药物： 主主要用于癌症治疗。要用于癌症治疗。 生生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+ +放射性同放射性同位素位素+ +化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导化学药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）向。准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。）（四）（四）. .单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用1.1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有 什么不同？什么不同？ 植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本植物体细胞杂交技术与动物细胞融

13、合技术基本相同，相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。合。 诱导融合方法有所不同诱导融合方法有所不同：动物细胞诱导融合：动物细胞诱导融合所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒所用的方法比植物体细胞杂交多一类灭活的病毒诱导；诱导； 结果不同：结果不同：植物体细胞杂交培养成了杂种植植物体细胞杂交培养成了杂种植株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。株，而动物细胞融合只培养出了杂交细胞。 1. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴

14、细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞 A B C D 有丝有丝3、下、下图表示单克隆抗体的制备过程，请分析完成下列问题：图表示单克隆抗体的制备过程，请分析完成下列问题：（1 1） A A过程是从小鼠的脾脏取得过程是从小鼠的脾脏取得 细细胞，该细胞能够产生胞，该细胞能够产生 。从小鼠体内提。从小鼠体内提取分离

15、该细胞之前，应给小鼠注射取分离该细胞之前，应给小鼠注射 类物质。类物质。能产生抗体的能产生抗体的B B特异性抗体特异性抗体抗原抗原（2 2）B B过程是一个过程是一个 过程，该过程的进行需过程，该过程的进行需要灭活的要灭活的 或或 诱导。诱导。CDCD是是 过程，选出能产生特异性抗体过程，选出能产生特异性抗体的的 ，继续培养。，继续培养。（3 3）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面与）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面与常规抗体相比，其特点是常规抗体相比，其特点是 。细胞融合细胞融合病病毒毒聚乙二醇聚乙二醇筛选筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞特异性强、灵敏度高，优越性非常明显。特异性强、灵敏度

16、高，优越性非常明显。 2. 2.制备单克隆抗体时，为什么要选用制备单克隆抗体时，为什么要选用B B淋淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B B淋巴细淋巴细胞，胞，B B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种原。动物在免疫反应的过程中，每一种B B淋巴细胞能淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的必须使能分泌该单一抗体的

17、B B淋巴细胞大量增殖。淋巴细胞大量增殖。B B淋淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种因此，把一种B B淋巴细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。 例：已知细胞

18、增殖时合成例：已知细胞增殖时合成DNA有有D和和S两条途径，两条途径，其中其中D途径能被氨基喋呤阻断。途径能被氨基喋呤阻断。 人淋巴细胞中有这两种人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般的合成途径，但一般不分裂增殖。不分裂增殖。 鼠骨髓瘤细胞中尽管没有鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增途径，但能不断分裂增殖，殖， 将两种细胞在培养液中混合，加聚乙二醇促融，将两种细胞在培养液中混合，加聚乙二醇促融，在培养液中有在培养液中有 种细胞。种细胞。 加入氨基喋呤后，使加入氨基喋呤后，使D合成途径阻断，仅有合成途径阻断，仅有D合成合成途径的途径的 及其彼此融合的细胞不能增殖。及其彼此融合的细胞不能增殖。 人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞中可利人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞中可利用淋巴细胞中的用淋巴细胞中的S途径合成途径合成DNA而增殖。从培养液中分而增殖。从培养液中分离出杂交细胞。离出杂交细胞。如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？5骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞