核酸杂交技术ppt课件.ppt

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1、第四章第四章 核酸杂交技术核酸杂交技术 目 录第一节第一节 核酸分子杂交的概念核酸分子杂交的概念一、核酸探针一、核酸探针二、分子杂交信号检测二、分子杂交信号检测第二节第二节 经典的核酸分子杂交技术经典的核酸分子杂交技术一、固相杂交一、固相杂交二、液相杂交二、液相杂交目 录第四节第四节 影响杂交信号检测的因素影响杂交信号检测的因素一、探针的选择一、探针的选择二、探针的标记方法二、探针的标记方法三、探针的浓度三、探针的浓度四、杂交率四、杂交率五、杂交温度五、杂交温度六、杂交的严格谨性六、杂交的严格谨性七、杂交反应时间七、杂交反应时间八、杂交促进剂八、杂交促进剂核酸分子杂交(molecular hy

2、bridization of nucleic acid)核酸分子杂交核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程。链杂交体的过程。核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测：利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或定量检测特异定量检测特异RNARNA或或DNADNA序列片段的有力工具。序列片段的有力工具。第一节第一节 核酸分子杂交的概念核酸分子

3、杂交的概念变性变性 退火退火 复性复性核酸分子杂交的基本原理1 1、变性（、变性（denaturationdenaturation）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。形成无规则线团，双链解链成为单链。 2 2、融解温度、融解温度 (Melting Temperature, Tm)(Melting Temperature, Tm)定义：在定义：在DNADNA热变性时，其热变性时，其A260A260的升高达最大值一半时的温度。的升高达最大值一半时的温度。影响影响TmTm的因素：的因素： （1

4、）DNA碱基的组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低 （2）溶液的离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 Tm值越高 （3）pH值 pH值5-9 Tm值变化不明显 pH11 不利于氢键形成 （4）变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成3.3.复性复性 变性变性DNADNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素：影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度重点提示 分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，

5、形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。一、核酸探针一、核酸探针 核酸探针指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能由其标记被特异性检测的核酸分子。探针的种类探针的种类寡核苷酸探针寡核苷酸探针基因组基因组DNADNA探针探针cDNAcDNA探针探针RNARNA探针探针DNADNA探针探针（一一）常用探针的种类）常用探针的种类1. DNA探针探针 最常用的核酸探针三大三大优点：优点： 这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简便；备方法简便； DN

6、ADNA探针相对不易被降解，一般探针相对不易被降解，一般DNADNA酶活性能有效地酶活性能有效地被抑制；被抑制； DNADNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、如缺口平移法、随机引物法、PCRPCR标记法等，能用于标记法等，能用于放射性核素和非放射性物质标记。放射性核素和非放射性物质标记。 2.RNA探针探针 优点：优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少，未杂交探针可用杂交较少，未杂交探针可用RNase RNase 降解，降解，减少本底的干扰。减少本底的干扰。 缺点：缺点：易降解，标

7、记方法复杂易降解，标记方法复杂 。3.3.寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针一般由寡核苷酸探针一般由17175050个核苷酸组成。个核苷酸组成。优势：优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列；可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列；缺陷：缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针杂交的特异性。杂交的特异性。（二）探针的长度（二）探针的长度1.DNA和和RNA探针探针 DNA探针通常为探针通常为400500个碱基个碱基2. 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性探针的最小

8、长度取决于其靶序列的复杂性（三）核酸探针的标记 1. 1. 探针标记物的选择探针标记物的选择（1 1）放射性标记）放射性标记（2 2）非放射性标记）非放射性标记根据标记物掺入情况可分为根据标记物掺入情况可分为均匀标记均匀标记和和末端标记末端标记探针。探针。不同标记类型探针的比较： 优点优点缺点缺点放射性探放射性探针针可以准确定量；灵可以准确定量；灵敏度高；本底低；敏度高；本底低；易于除去旧探针易于除去旧探针, ,重新杂交新探针重新杂交新探针短半衰期的探针需临用短半衰期的探针需临用前制备；放射性递减使前制备；放射性递减使探针降解；放射性物质探针降解；放射性物质对人体有害；费用贵对人体有害；费用贵

9、非放射性非放射性探针探针对人体危害小；稳对人体危害小；稳定，可供长时间内定，可供长时间内持续使用；检测过持续使用；检测过程快；可同时进行程快；可同时进行不同标记探针的杂不同标记探针的杂交；本底较低交；本底较低灵敏度不如放射性探针；灵敏度不如放射性探针；杂交条件受报告基团的杂交条件受报告基团的限制；重新杂交新探针限制；重新杂交新探针比较困难比较困难2.2.探针标记方法的选择探针标记方法的选择 制备探针步骤：制备探针步骤：探针标记探针标记清除未标记的核酸探针清除未标记的核酸探针检测探针标记效率检测探针标记效率 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法(1) DNA(1) DNA切口平移标记法切口平移标

10、记法(2) DNA(2) DNA随机引物标记法随机引物标记法(3) DNA(3) DNA的末端标记的末端标记(7) RNA(7) RNA探针的标记探针的标记(4) cDNA(4) cDNA探针的标记探针的标记(5) (5) 寡核苷酸探针的标记寡核苷酸探针的标记(6) (6) 单链单链DNADNA探针的标记探针的标记随机引物：含有各种可随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。片段的混合物。DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段片段：保留保留53DNA53DNA聚合酶聚合酶活性活性, ,弱弱3535外切酶外切酶活性，无活性，无5353外切外切酶活性。

11、酶活性。（1 1）DNADNA随机引物标记随机引物标记5 3 3 5 32P-部分标记的部分标记的单链单链DNA片段片段切口切口原始原始位置位置切口切口最终最终位置位置32P-标记的标记的DNADNA聚合酶聚合酶I-32P-dCTP变性变性DNase I，Mg2+dATP，dGTP，dTTPDNADNA酶酶：在双链：在双链DNADNA上随机打开若干个单上随机打开若干个单链缺口，产生链缺口，产生3-OH3-OH端。端。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶：53DNA53DNA聚合酶聚合酶活性；活性；53 53 外切外切核酸酶活性。核酸酶活性。（2 2）DNADNA切口平移标记切口平移标记 条

12、件是有条件是有5-5-OHOH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链DNADNA需用碱性磷酸酶切除需用碱性磷酸酶切除5-5-P P后再标记后再标记55p-HOp-HO-CpGpTpA3-CpGpTpA355HO-HO-CpGpTpA3CpGpTpA3T4T4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶-3232P-ATPP-ATP553232p p-O-CpGpTpA3-O-CpGpTpA33737，反应，反应10min, -10min, -3232P-ATP P-ATP 需需150 150 cici/ /反应反应1) DNA1) DNA的的55末端标记末端标记碱性磷酸酶

13、碱性磷酸酶(3) DNA(3) DNA的末端标记的末端标记5335完整双链完整双链DNADNA限制性内切酶限制性内切酶5335-3232P-P-dNTPdNTP其他其他3 3 种种dNTPdNTPKlenowKlenow DNA DNA聚合酶聚合酶5335变性533555末端突出的末端突出的DNADNA33末端标记的末端标记的DNADNA3232P-P-末端标记的末端标记的单链单链DNADNA探针探针2) DNA2) DNA的的33末端标记末端标记二、分子杂交信号检测（一）放射性标记探针检测（一）放射性标记探针检测1、放射自显影、放射自显影2、液体闪烁计数法、液体闪烁计数法（二）非放射性标记探

14、针的杂交检测（二）非放射性标记探针的杂交检测1、酶促显色检测、酶促显色检测2、荧光检测、荧光检测3、化学发光检测、化学发光检测4、多探针检测、多探针检测（一）放射性标记探针检测1. 1.放射自显影放射自显影 放射性杂交的检测基于放射性核素释放的放射性杂交的检测基于放射性核素释放的能量将照片纸感光的原理。能量将照片纸感光的原理。用用3232P P标记杂交最常用的检测方法是放射自标记杂交最常用的检测方法是放射自显影。显影。2.液体闪烁计数法 液体闪烁计数法的工作原理是被测样液体闪烁计数法的工作原理是被测样品辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪品辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪烁剂分子，当被激发的闪

15、烁剂分子从激发烁剂分子，当被激发的闪烁剂分子从激发态退激为稳态时，以荧光光子的形式辐射态退激为稳态时，以荧光光子的形式辐射能量，经光电倍增管放大并被测量，就可能量，经光电倍增管放大并被测量，就可以实现对放射性核素的测定。以实现对放射性核素的测定。（二）非放射性标记探针的杂交检测 1. 1.酶促显色检测酶促显色检测（1 1）直接检测）直接检测酶本身作为标记分子掺入到核酸中去，在洗脱后酶本身作为标记分子掺入到核酸中去，在洗脱后就可直接进行检测。就可直接进行检测。酶直接作用于酶直接作用于显色显色的底物，产生颜色沉淀，显色的底物，产生颜色沉淀，显色沉淀可用肉眼检测。沉淀可用肉眼检测。酶直接作用于酶直接

16、作用于化学发光化学发光的底物发光的底物发光, , 发光的检测发光的检测要依赖于对蓝光敏感的要依赖于对蓝光敏感的X X胶片。胶片。这种检测法常用于这种检测法常用于寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交，这类杂交，这类杂交反应反应温度低温度低。 碱性磷酸酶显色反应示意图碱性磷酸酶显色反应示意图HRPHRP酶显色反应示意图酶显色反应示意图(DAB)(TMB)Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联Dig-DNADig-DNA探针探针 + + 抗抗DigDig抗体抗体- -碱性磷酸酶碱性磷酸酶（或辣根过（或辣根过氧化物酶）氧化物酶）+ + 底物底物（

17、2）间接检测）间接检测 检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时，检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时，就要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。就要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。 荧光素：一类能在激发光作用下发射出荧光的物质荧光素：一类能在激发光作用下发射出荧光的物质 荧光显微镜观察、免疫组织化学法荧光显微镜观察、免疫组织化学法 2 2荧光检测荧光检测 化学发光是指化学反应中释放的能量以光的形式化学发光是指化学反应中释放的能量以光的形式发射出来形成检测信号。发射出来形成检测信号。 化学发光酶免疫技术中目前常用的酶有化学发光酶免疫技术中目前常用的酶有碱性磷酸碱性磷酸酶及酶及辣根

18、过氧化物酶辣根过氧化物酶 发射光线的强度反映了酶的活性，反应了杂化分发射光线的强度反映了酶的活性，反应了杂化分子的量。子的量。 3 3化学发光底物化学发光底物 辣根过氧化物酶催化的化学发光反应辣根过氧化物酶催化的化学发光反应 采用发色体检测的最大益处是可同时检测一个以上的采用发色体检测的最大益处是可同时检测一个以上的杂化分子杂化分子 每种探针分别用不同的报告基团如生物素、荧光素和每种探针分别用不同的报告基团如生物素、荧光素和地高辛标记并同时与固定在滤膜上的核酸杂交地高辛标记并同时与固定在滤膜上的核酸杂交 采用不同的链霉抗生素或抗体采用不同的链霉抗生素或抗体- -酶和相应底物组合酶和相应底物组合

19、4 4多探针检测多探针检测 第二节第二节 经典的核酸分子杂交技术经典的核酸分子杂交技术核酸分子杂交分类核酸分子杂交分类根据杂交核酸分子的根据杂交核酸分子的种类种类 DNA DNA与与DNADNA杂交杂交 DNA DNA与与RNARNA杂交杂交 RNA RNA与与RNARNA杂交杂交根据杂交根据杂交探针标记探针标记 同位素杂交同位素杂交 非同位素杂交非同位素杂交根据根据杂交介质杂交介质 液相杂交液相杂交 固相杂交固相杂交 原位杂交原位杂交菌落杂交菌落杂交Southern印迹杂交印迹杂交Northern印迹杂交印迹杂交点杂交点杂交狭缝杂交狭缝杂交分子杂交技术一般过程分子杂交技术一般过程 探针制备及

20、标记（同位素或非同位素）探针制备及标记（同位素或非同位素） 待测核酸样品制备（分离，纯化）待测核酸样品制备（分离，纯化） 杂交（液相，固相，原位杂交）杂交（液相，固相，原位杂交） 杂交后处理（去掉非特异杂交分子）杂交后处理（去掉非特异杂交分子） 显示结果（显色，发光，放射自显影）显示结果（显色，发光，放射自显影） 结果分析结果分析固相杂交：固相杂交：先将待测单链核酸样品结合到先将待测单链核酸样品结合到固相固相支持物（常用有支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交，放射后与溶液中的已知序列的标记探

21、针进行杂交，放射自显影分析杂交结果。自显影分析杂交结果。（一）反向点杂交（一）反向点杂交反向点杂交（反向点杂交（reverse dot blot, RDBreverse dot blot, RDB） 是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品样品DNADNA又互不干扰，又互不干扰， 故能一次性筛查出多种故能一次性筛查出多种不同的序列。不同的序列。 特点：特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好简单、快捷、特异性强、稳定性好 较较Northern blotNorthern blot省去了电泳和毛细转膜过程省去了电泳和毛细转膜过程（二）（二）Souther

22、n印迹杂交印迹杂交 Southern印迹杂交印迹杂交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指）是指DNA与与DNA分子之间的杂交。分子之间的杂交。可用于基因组可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。和噬菌体的分析等。（二）（二）Southern印迹杂交印迹杂交包括两个主要过程：包括两个主要过程：将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（即印迹（blot

23、tingblotting）。）。固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。SouthernSouthern印迹杂交的基本步骤：印迹杂交的基本步骤： 待测待测DNADNA样品的限制性内切酶消化样品的限制性内切酶消化 酶切酶切DNADNA样品的电泳分离样品的电泳分离 凝胶中凝胶中DNADNA的变性和的变性和SouthernSouthern转移转移 探针的制备探针的制备 Southern Southern杂交杂交 杂交结果的检测杂交结果的检测限制性内切酶消化限制性内切酶消化酶切酶切D

24、NADNA样品的电泳分离样品的电泳分离凝胶中凝胶中DNADNA的的NaOHNaOH变变性性凝胶中凝胶中DNADNA分离带分离带SouthernSouthern印迹印迹凝胶中凝胶中DNADNA带被带被转移到转移到NCNC膜上膜上标记标记探针探针杂交杂交探针杂交带曝光显探针杂交带曝光显影影SouthernSouthern杂交的应用杂交的应用 应用应用单基因遗传病的基因诊断单基因遗传病的基因诊断基因点突变的检测基因点突变的检测临床应用临床应用用于下列疾病的产前诊断用于下列疾病的产前诊断 镰型细胞贫血镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良假

25、肥大型肌营养不良 血友病血友病 慢性进行型舞蹈病慢性进行型舞蹈病（三）（三）Northern印迹杂交印迹杂交Northern 印迹（印迹（Northern blot）杂交是应用杂交是应用DNA探针探针检测特异检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。的另一种膜上印迹技术。此项技术的原理此项技术的原理和过程与和过程与Southern印迹基本相同，只是检印迹基本相同，只是检测的分子是测的分子是RNA，可用来对组织，可用来对组织或细胞中的或细胞中的mRNA进行定性或定进行定性或定量分析。量分析。Northern杂交应用杂交应用 1. RNA病毒的检测病毒的检测2. 基因表达的检测基因表达的检测North

26、ern印迹技术被认为是检测基因表达印迹技术被认为是检测基因表达水平的金标准。水平的金标准。 二、液相杂交 液相杂交是指待测核酸和探针都存在于液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液杂交液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。对形成杂交分子的过程。液相杂交液相杂交 一种研究最早且操作简便的杂交类型。一种研究最早且操作简便的杂交类型。 原理原理和反应条件与固相杂交基本相同，仅是将待和反应条件与固相杂交基本相同，仅是将待检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应。反应。 液相杂交

27、后过量的未杂交探针在溶液中除去较困液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较困难，同源与异源的难，同源与异源的DNA分子在杂交的过程中会发生分子在杂交的过程中会发生竞争，使得杂交结果的分析十分困难。竞争，使得杂交结果的分析十分困难。 因此液相杂交应用较少因此液相杂交应用较少三、原位杂交 应用核酸探针与应用核酸探针与组织或细胞中组织或细胞中的的核酸核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用杂交体，然后应用组织细胞化学或免疫组组织细胞化学或免疫组织化学织化学方法在显微镜下进行方法在显微镜下进行细胞内定位或细胞内定位或基因表达基因表达的检测技术。的检测技术。

28、（一）基本操作步骤：（一）基本操作步骤： 杂交前准备杂交前准备：保持细胞形态结构、保存核酸、：保持细胞形态结构、保存核酸、增加组织的通透性、减低背景。增加组织的通透性、减低背景。 杂交杂交：使探针与细胞中的把序列结合。：使探针与细胞中的把序列结合。 杂交后处理杂交后处理：盐溶液的漂洗，以减少背景。：盐溶液的漂洗，以减少背景。 显示显示：根据核酸探针标志物的种类选择相应：根据核酸探针标志物的种类选择相应的检测系统。的检测系统。 （二）原位杂交的应用（二）原位杂交的应用1. 细胞遗传学分析细胞遗传学分析产前诊断产前诊断生殖医学中的应用生殖医学中的应用血液疾病中染色体易位的检测血液疾病中染色体易位的

29、检测实体瘤研究实体瘤研究2. 比较基因组杂交比较基因组杂交3. 基因图谱绘制基因图谱绘制4. 病原学检测病原学检测荧光原位杂交荧光原位杂交(FISH, Fluorescence (FISH, Fluorescence in situ in situ Hybridization)Hybridization)利用利用荧光标记荧光标记的探针与的探针与待测标本的核酸进行待测标本的核酸进行原原位位杂交，在荧光显微镜杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组或基因异常的细胞、组织标本进行检测和诊断织标本进行检测和诊断 核酸分子杂交

30、技术类型核酸分子杂交技术类型 杂交类型杂交类型检测目的及范围检测目的及范围SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的膜上的DNADNA分子分子NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的膜上的RNARNA分子分子反向斑点杂交反向斑点杂交检测样品中的检测样品中的DNADNA或或RNARNA分子分子原位杂交原位杂交检测细胞或组织上的检测细胞或组织上的DNADNA或或RNARNA分子分子 第四节第四节 影响杂交信号检测的因素影响杂交信号检测的因素 在核酸杂交反应中影响杂交体形

31、成因素在核酸杂交反应中影响杂交体形成因素较多，主要有探针的选择、探针的标记方法、较多，主要有探针的选择、探针的标记方法、探针的浓度、杂交率、杂交最适温度、探针的浓度、杂交率、杂交最适温度、杂交杂交的严谨性的严谨性、杂交反应时间及杂交促进剂等。、杂交反应时间及杂交促进剂等。一、探针的选择在大多数情况下，可以选择克隆的在大多数情况下，可以选择克隆的DNADNA或或cDNAcDNA双链探针。双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和探针如寡核苷酸探针和RNARNA探针。探针。二、探针的标记方法探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视探针的

32、标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。三、探针的浓度随探针浓度增加，杂交率也增加。随探针浓度增加，杂交率也增加。在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。探针浓度过低会降低杂交的灵敏度，过高又会增加探针浓度过低会降低杂交的灵敏度，过高又会增加背景的染色。背景的染色。一般认为，一般认为，最

33、佳原则最佳原则是应用与靶核苷酸探针达到最是应用与靶核苷酸探针达到最大结合度的最低探针浓度。大结合度的最低探针浓度。四、杂交率传统杂交率分析主要用于传统杂交率分析主要用于DNADNA复性研究，在这种复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。列不在液相，故其浓度不能精确计算。五、杂交温度理想的情况是在杂交速率最大的温度条件下进行理想的情况是在杂交速率

34、最大的温度条件下进行杂交反应杂交反应对对RNARNA：DNADNA杂交来说，最大速率的产生点为杂交来说，最大速率的产生点为TmTm值下值下10151015；在在DNADNA：DNADNA杂交中选择低于杂交中选择低于TmTm值值20252025的的杂交温度。杂交温度。六、杂交的严谨性 严谨性（严谨性（stringency)stringency)是指杂交体系避免非同源性或部是指杂交体系避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严谨性，影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严谨性，一般认为在低于杂交体

35、一般认为在低于杂交体TmTm值值2525时杂交最佳，所以时杂交最佳，所以首先要根据公式计算杂交体首先要根据公式计算杂交体Tm Tm 值。通过调节值。通过调节 盐浓度、盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。七、杂交反应时间C C0 0t t1/21/2是杂交反应进行一半时杂化分子的浓度，是杂交反应进行一半时杂化分子的浓度， C C0 0t t1/21/2越大反应越快。越大反应越快。复杂性复杂性( complexity)( complexity)或者说序列的复杂性是指在或者说序列的复杂性是指在DNADNA或或RNARNA样品中不同序列的总长度，如果

36、有机体中不样品中不同序列的总长度，如果有机体中不存在重复序列，存在重复序列，DNADNA的复杂性与其基因组长度相当。的复杂性与其基因组长度相当。重复序列的复杂性与其单一拷贝的复杂性相当，和其重复序列的复杂性与其单一拷贝的复杂性相当，和其重复次数无关。重复次数无关。八、杂交促进剂惰性多聚体可用来促进惰性多聚体可用来促进250250个碱基以上的探针的杂个碱基以上的探针的杂交率。交率。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。短探针本身的杂交率就高。Questions1. 1. 核酸分子杂交的基本原理。核酸分子杂交的基本原理。2. 2. 核酸探针的种类及其标记方法。核酸探针的种类及其标记方法。3. 3. 核酸探针的检测。核酸探针的检测。4. 4. 核酸分子杂交的传统方法。核酸分子杂交的传统方法。5. 5. 原位杂交概念、基本步骤及其应用。原位杂交概念、基本步骤及其应用。