食品微生物实验ppt课件.ppt

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1、食品微生物实验目录目录1234实验目的实验目的实验原理实验原理实验器材实验器材实验方法实验方法657思考题思考题注意事项注意事项实验结果实验结果实验目的 了解配制微生物培养基的原理和培养基的种了解配制微生物培养基的原理和培养基的种类；类； 掌握配制培养基的一般方法和操作步骤；掌握配制培养基的一般方法和操作步骤； 懂得高压蒸汽灭菌的基本原理及使用注意事懂得高压蒸汽灭菌的基本原理及使用注意事项；项；了解几种常用灭菌方法。了解几种常用灭菌方法。实验原理 培养基培养基是按照微生物生长繁殖或积累是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的

2、一种基质。它包括碳源、氮法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。养要素。 根据据组成成分可分为根据据组成成分可分为: :1. 合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2. 半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。而成。3. 天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。根据用途可分为根据用途可分为:1. 基础培养基：能满足各种微生物的营养需求基础培养基

3、：能满足各种微生物的营养需求2. 加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质，使其加富培养基：加入某种微生物生长繁殖所需的营养物质，使其快速生长，便于分离快速生长，便于分离3. 选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目标微生选择培养基：加入某种物质抑制其他微生物生长，使目标微生物得到富集，便于分离物得到富集，便于分离4. 鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。鉴别培养基：用来检测微生物的某些代谢特性。从培养基的物理状态可分为从培养基的物理状态可分为: : 1. 液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2. 固体培养基：在液体培养基中加

4、入固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。的培养基或农副产品培养基。 3. 半固体培养基：在液体培养基中加入半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半凝固剂而成的半固体状培养基。固体状培养基。实验原理 灭菌灭菌: :是指应用物理或化学的方法，杀灭物是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。学药品法等。 消毒：消毒：使用理化因素方法杀死物体表面绝大使用

5、理化因素方法杀死物体表面绝大多数微生物的方法。多数微生物的方法。常用的灭菌法常用的灭菌法1、干热灭菌：、干热灭菌： 用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌 适合于培养皿，试管，吸管等的灭菌。适合于培养皿，试管，吸管等的灭菌。160-170，保持，保持2h。2、湿热灭菌、湿热灭菌加压蒸汽灭菌法其步骤如下：加压蒸汽灭菌法其步骤如下：1）灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。）灭菌器内加入一定量的水，将包扎好的物品放入其中。2）接通电源，进行加热）接通电源，进行加热3）排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭）排除高压锅内的冷空气，可将排

6、气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，时再打开排气阀，待压力回复到待压力回复到0时再关闭排气阀。时再关闭排气阀。4）当压力达）当压力达1.05kg/cm2时，此时灭菌器内的温度为时，此时灭菌器内的温度为121 ，维持，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。当降低压力，延长时间。5）灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，）灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌

7、器盖，取出物品。然后打开灭菌器盖，取出物品。间歇灭菌法：间歇灭菌法： 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮煮1次，每次煮沸次，每次煮沸1h，连续，连续3d重复进行。在重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可以使每次恒温条件下培养过夜，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。便下次蒸煮时杀灭。过滤除菌法：过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用

8、细菌过滤器进行除菌。清），一般可用细菌过滤器进行除菌。紫外线灭菌法：紫外线灭菌法： 一般一般30W灯管，灯管，9m3空间，距地面空间，距地面2m每次打开紫外线每次打开紫外线照射照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。面杀菌。化学药剂消毒灭菌：化学药剂消毒灭菌： 微生物

9、实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。菌剂。 1. 1. 药品和试剂药品和试剂 牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、NaClNaCl、1010 NaOHNaOH 溶液、溶液、1010盐酸溶液。盐酸溶液。 2. 2. 器材器材 天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、 PHPH试试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉纸、试管、三角瓶、分装漏

10、斗、牛皮纸、棉花、线绳、干燥箱、高压锅。花、线绳、干燥箱、高压锅。实验器材 培养基的配制培养基的配制 分离培养微生物常用器皿的准备分离培养微生物常用器皿的准备 培养基和玻璃器材的灭菌培养基和玻璃器材的灭菌实验步骤 培养基的制备过程培养基的制备过程配方及配量配方及配量-称取药品称取药品-加热溶解加热溶解-调调节节pH -pH -过滤过滤-分装分装-加棉塞加棉塞-包扎包扎- -灭菌灭菌-搁斜面搁斜面-贮存贮存实验方法2. 2. 溶解溶解 在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。热溶解。3. 3. 调节调节pHpH值值 用玻璃棒沾少许液体，测量用玻璃棒沾少许液体，

11、测量pHpH值。用值。用1mol/L1mol/L氢氧化钠和氢氧化钠和1mol/L1mol/L盐酸调节盐酸调节pHpH。4. 4. 加琼脂溶化：加琼脂溶化： 加热过程中要不断搅拌，可适当补水。加热过程中要不断搅拌，可适当补水。实验方法5. 分装：分装： 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。6. 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。种培养基。7

12、. 灭菌：灭菌：高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌，121，20min8. 搁斜面：搁斜面：9. 贮存贮存:培养基灭菌后必须在培养基灭菌后必须在37 下恒温培养下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。确定无菌生长，方可使用。实验方法实验方法注：灭菌后的培养基冷却至注：灭菌后的培养基冷却至50-6050-60后搁置斜面。后搁置斜面。 斜面的长度不超过试管总长的一半。斜面的长度不超过试管总长的一半。实验方法实验方法1 1、牛肉膏蛋白胨固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基2 2、察氏培养基（培养霉菌用）、察氏培养基（培养霉菌用）3 3、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基4 4、高氏、高氏1 1号

13、培养基（培养各种放线菌用）号培养基（培养各种放线菌用） 称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品； 蛋白胨极易吸湿，称取动作要迅速；蛋白胨极易吸湿，称取动作要迅速； 配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时， 再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，要求再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，要求 不断搅拌，以免糊底，并防止沸腾外溢；不断搅拌，以免糊底，并防止沸腾外溢； 分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量 约为管高的约为管

14、高的1/51/5，液体培养基约为管高的，液体培养基约为管高的1/41/4，三角瓶不，三角瓶不 超过瓶体的超过瓶体的1/2 1/2 ； 分装时不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免引起污染。分装时不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免引起污染。注意事项 1. 1. 思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养基？养基？2. 2. 为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？思考题 1. 1. 掌握各种微生物接种的基本操作技术；掌握各种微生物接种的基本操作技术；2. 2. 初步了解周围环境中微生物的分布状况；初步了解周围环境中微生物的分布状况；3. 3. 熟悉

15、四大类微生物菌落的形态特征。熟悉四大类微生物菌落的形态特征。实验目的 在我们周围环境中存在着种类繁多、数量庞在我们周围环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物，他们很小，人们用肉眼看不到，将大的微生物，他们很小，人们用肉眼看不到，将他们在适宜的温度下培养一段时间，可繁殖成一他们在适宜的温度下培养一段时间，可繁殖成一个个肉眼可见的细胞群体，此即为菌落。个个肉眼可见的细胞群体，此即为菌落。 接种是指在无菌操作条件下，将某种微生物接种是指在无菌操作条件下，将某种微生物的纯种移接到适合其生长繁殖的新鲜培养基中或的纯种移接到适合其生长繁殖的新鲜培养基中或生物体内的一种操作过程。实验室常用的接种方生物体内的

16、一种操作过程。实验室常用的接种方法有斜面接种、穿刺接种、三点接种和液体接种。法有斜面接种、穿刺接种、三点接种和液体接种。实验原理 实验器材 1. 1.菌种菌种 实验室环境微生物、大肠杆菌、酿酒酵母、实验室环境微生物、大肠杆菌、酿酒酵母、放线菌及霉菌。放线菌及霉菌。2. 2. 培养基培养基 马铃薯固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培马铃薯固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏一号固体培养基养基、高氏一号固体培养基3. 3. 器皿器皿 无菌培养皿、无菌棉签、火柴、超净工作无菌培养皿、无菌棉签、火柴、超净工作台及恒温培养箱。台及恒温培养箱。实验方法 1、融化培养基、融化培养基1）沸水浴融化法：沸水浴融化

17、法：取装有无菌营养琼脂培养基的三角瓶一个，放在沸水浴中煮沸维持，待琼脂彻底融化（从水浴中取出，在不摇（从水浴中取出，在不摇动下对着透视光观察为均质无块状液态）动下对着透视光观察为均质无块状液态）后取出，室温下放置待冷却至冷却至50-6050-60（以手握不觉得十分烫手）（以手握不觉得十分烫手）时倒平板。2）微波炉融化法：微波炉融化法：采用微波炉加热融化琼脂培养基，应根据加热应根据加热功率大小及待融化培养基的量来决定所需时间。功率大小及待融化培养基的量来决定所需时间。否则将导致水分蒸发过多、培养基剧烈沸腾使三角瓶口棉塞冲脱而溢出培养基或引起棉花塞燃烧等事故。3 3）压力锅融化法：）压力锅融化法：

18、当需融化的培养基量较多时，用压力锅融化较快速。方法是将待融化琼脂培养基放入锅内，采用100-105的锅压维持5-10min即可。4）冷却需注意：）冷却需注意：融化的琼脂培养基一般采用室温冷却，但在室温在室温较低时切莫用冷水直冲瓶壁某处（会首先导致琼脂凝块现象）。较低时切莫用冷水直冲瓶壁某处（会首先导致琼脂凝块现象）。若将融化的培养基直接放在冰凉而热传导很快的瓷砖或不锈钢桌若将融化的培养基直接放在冰凉而热传导很快的瓷砖或不锈钢桌面上，也可因瓶底过冷而产生凝结现象。面上，也可因瓶底过冷而产生凝结现象。实验方法 实验方法 1. 1. 斜面接种斜面接种2. 2. 液体接种液体接种 由斜面菌接种到液体培

19、养基（如试管或三由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。角瓶等）中的方法。 将接种环送入液体培养基中时使环在液体将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接、触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，与管壁接、触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。液管或滴管接种。实验方法 3. 3.穿刺接种穿刺接种 用接种针挑取菌种后，插入固体培养基内用接种针挑取菌种后，插入固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于（不要刺到底部）

20、，再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。 4. 4.平板接种平板接种 将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：方法，可分为下面几种： 实验方法 1) 1) 斜面接平板斜面接平板 a. a. 划线法：见平板划线分离法。划线法：见平板划线分离法。 b. b. 点种法：常用于观察霉菌和酵母细胞，轻点点种法：常用于观察霉菌和酵母细胞，轻

21、点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点点3-43-4点）。点）。 2) 2) 平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。养、保存之用。 实验方法 实验方法 挑孢子：挑孢子： 将灭过菌的接种针在菌种管斜面上端冷却并湿润后，再将灭过菌的接种针在菌种管斜面上端冷却并湿润后，再用针尖挑少量孢子。当移出接种针前，须将针柄在管口轻轻用针尖挑少量孢子。当移出接种针前，须将针柄在管口轻轻碰几下，以抖落未粘牢的孢子。然后移出接种针，塞上棉塞，碰几下

22、，以抖落未粘牢的孢子。然后移出接种针，塞上棉塞，将菌种管插回试管。将菌种管插回试管。 点接：点接： 左手将预先倒置在煤气灯旁的含培养基的皿底取出（皿左手将预先倒置在煤气灯旁的含培养基的皿底取出（皿底朝上，仍放在煤气灯旁），随之将培养基一面朝向火焰，底朝上，仍放在煤气灯旁），随之将培养基一面朝向火焰，并使皿底垂直于桌面，将沾有孢子的接种针尖垂直地点接于并使皿底垂直于桌面，将沾有孢子的接种针尖垂直地点接于标记处，然后将皿底轻轻地放入皿盖中。最后将带菌的接种标记处，然后将皿底轻轻地放入皿盖中。最后将带菌的接种针烧红，以杀灭残留的孢子。针烧红，以杀灭残留的孢子。实验方法 实验方法 环境微生物的检测环境

23、微生物的检测1 1） 空气空气 做实验室空气中微生物的检测时，只要打开无菌平板的做实验室空气中微生物的检测时，只要打开无菌平板的皿盖，让其在空气中暴露一段时间（皿盖，让其在空气中暴露一段时间（5-10min5-10min），即让空气中），即让空气中含微生物的尘埃或微粒以沉降法自然接种到平板培养基的表含微生物的尘埃或微粒以沉降法自然接种到平板培养基的表面，然后将皿盖盖上即可。面，然后将皿盖盖上即可。2 2） 桌面桌面 在做实验桌面的微生物检测时，可用一枚无菌棉签，先在做实验桌面的微生物检测时，可用一枚无菌棉签，先在手持无菌平板的半侧润湿后划数条在手持无菌平板的半侧润湿后划数条“Z”Z”型的接种线

24、，以型的接种线，以此作为无菌棉签试验的无菌对照区域。然后仍用此棉签去擦此作为无菌棉签试验的无菌对照区域。然后仍用此棉签去擦抹桌面，再在平板的另半侧的表面作同样的划线接种。上述抹桌面，再在平板的另半侧的表面作同样的划线接种。上述操作均应以无菌操作法进行，即在火焰旁的无菌操作区域内操作均应以无菌操作法进行，即在火焰旁的无菌操作区域内完成。完成。 3 3）头发）头发 移去无菌平板的皿盖，使自己的头发部位保持移去无菌平板的皿盖，使自己的头发部位保持在平板培养基的上方，然后以手指拨动头发数次，在平板培养基的上方，然后以手指拨动头发数次，再盖上皿盖，就可以粗略测知头发中所含带菌尘埃再盖上皿盖，就可以粗略测

25、知头发中所含带菌尘埃的多少及其含菌的种类等。的多少及其含菌的种类等。4 4）手指）手指 可用未经清洗的手指先在无菌的平板培养基的左半可用未经清洗的手指先在无菌的平板培养基的左半侧作划线接种，并在皿底做好标记。然后用肥皂洗侧作划线接种，并在皿底做好标记。然后用肥皂洗手，待手指冲洗干净后再在平板培养基的另半侧作手，待手指冲洗干净后再在平板培养基的另半侧作同样的划线接种，然后盖好皿盖。待培养后比较平同样的划线接种，然后盖好皿盖。待培养后比较平板两侧所形成的菌落或菌苔的差异来判断手指的含板两侧所形成的菌落或菌苔的差异来判断手指的含菌量。菌量。实验方法 5 5）口腔）口腔 打开无菌平板培养基的皿盖，使口

26、对着平板培养打开无菌平板培养基的皿盖，使口对着平板培养基的表面，以咳嗽或刺激鼻腔打喷嚏方式接种；也可基的表面，以咳嗽或刺激鼻腔打喷嚏方式接种；也可用长的无菌棉签从口腔或咽喉等处取菌样，然后在平用长的无菌棉签从口腔或咽喉等处取菌样，然后在平板表面作划线分离，再盖上皿盖，经培养后观察平板板表面作划线分离，再盖上皿盖，经培养后观察平板上的菌落或菌苔。上的菌落或菌苔。培养培养 将以上各种检测平板倒置于将以上各种检测平板倒置于2828温箱中培养，至温箱中培养，至下周实验时观察并计数各平板上的菌落数。若有时间，下周实验时观察并计数各平板上的菌落数。若有时间，可从可从24h24h起观察数次，以了解各种平板及

27、不同类型菌落起观察数次，以了解各种平板及不同类型菌落出现的顺序及菌落大小、外形和颜色等的变化。出现的顺序及菌落大小、外形和颜色等的变化。实验方法 实验结果 用于倒平板的培养基一定要彻底溶化，否则会用于倒平板的培养基一定要彻底溶化，否则会在所倒的平板培养基表面出现未融化的琼脂块。而在所倒的平板培养基表面出现未融化的琼脂块。而且，倒平板时的培养基温度不能过高（且，倒平板时的培养基温度不能过高（50-6050-60为为宜），否则会在皿盖内侧形成较多的冷凝水或在凝宜），否则会在皿盖内侧形成较多的冷凝水或在凝固的平板表面形成许多冷凝水微滴，不利于单菌落固的平板表面形成许多冷凝水微滴，不利于单菌落的形成。

28、的形成。 在无菌操作倒平板过程中，切忌用手抓、握三在无菌操作倒平板过程中，切忌用手抓、握三角瓶的瓶口处，以防灼热的瓶口端烫伤手指，同时，角瓶的瓶口处，以防灼热的瓶口端烫伤手指，同时，手指上的微生物也会污染瓶的口端，造成严重的操手指上的微生物也会污染瓶的口端，造成严重的操作污染等。作污染等。 注意事项 1. 1. 了解平板划线法分离菌种的基本原理了解平板划线法分离菌种的基本原理及操作；及操作；实验目的 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中

29、的不同一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的就是某微生物的“纯种纯种”。实验目的 1. 1.样品样品 混合菌液混合菌液2. 2. 培养基培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基3. 3. 其它其它 盛盛9ml9ml无菌水的试管、盛无菌水的试管、盛90ml90ml无菌水并带无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、

30、无菌吸有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿。管、接种环、无菌培养皿。实验器材 实验方法 1. 1.用于划线的接种环，环柄宜长些（约用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm10cm），），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。2. 2.用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%2%左右左右），否则会因平板太软而被划破。），否则会因平板太软而被划破。3. 3.平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。平板不能倒得太薄，最好在使用前一

31、天倒好。为防平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基为防平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。温度不能太高。注意事项 1 1倒平板时，为什么要将融化的琼脂培养基冷倒平板时，为什么要将融化的琼脂培养基冷却到却到 45455050左右才能倾入装有菌液的培养左右才能倾入装有菌液的培养皿内？皿内？2 2划线分离时，为什么每次都要将接种环上多划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？余的菌体烧掉？3 3培养时为什么要将培养皿倒置培养？培养时为什么要将培养皿倒置培养？思考题 实验四实验四 细菌的革兰氏染色法和光学显微镜的使用细菌的革兰氏染色法和光学显微镜的使用1. 1. 了解普通光学显微镜的

32、构造和原理；了解普通光学显微镜的构造和原理；2. 2. 正确掌握使用显微镜的方法；正确掌握使用显微镜的方法；3. 3. 了解革兰氏染色的原理和操作方法。了解革兰氏染色的原理和操作方法。实验目的 实验原理 普通光学显微镜的构造普通光学显微镜的构造（1）机械装置）机械装置（2）光学系统）光学系统普通光学显微镜的工作原理普通光学显微镜的工作原理实验原理 d物镜的分辨距离，单位 nm 照明光线波长，单位 nm NA 物镜的数值孔径实验原理 实验方法普通光学显微镜的保养普通光学显微镜的保养实验原理 二二. . 革兰氏染色原理革兰氏染色原理 G G- -菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂菌的细胞壁中含

33、有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。色，再经复红复染后就成红色。 G G+ +菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时

34、的颜色。实验原理 1. 1. 菌种菌种 培养培养2424小时的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。小时的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。2. 2. 染色液和试剂染色液和试剂 结晶紫、碘液、结晶紫、碘液、95%95%酒精、石炭酸复红酒精、石炭酸复红 、蒸、蒸馏水、香柏油。馏水、香柏油。3. 3. 器材器材 载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微 镜。镜。实验器材 1. 1.革兰氏染色革兰氏染色（1 1）涂片）涂片 实验方法 （2）晾干）晾干实验方法 （3）固定）固定实验方法 （4）结晶紫染色：）结晶紫染色： 加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色加适量（以盖满细菌涂面）的结

35、晶紫染色液染色1min；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。crystal violet stain wash with water 结晶紫染色 水洗实验方法 （5）媒染：）媒染： 碘液，媒染碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。；水洗：用水洗去碘液。（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色乙醇脱色 1520s至流出液无色，立即水洗。至流出液无色，立即水洗。（7）复染：滴加复红复染）复染：滴加复红复染1min；水洗：用水洗去涂；水洗：用水洗去涂 片上的复红染色液。片上的复红染色液。碘液复染95%酒精脱色沙黄复染实验方法 （8

36、 8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。（9 9）镜检：）镜检： 1）用低倍镜对光。最大光圈）用低倍镜对光。最大光圈 2）低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈）低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈 3）高倍镜观察（选取理想的观察目标）。）高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 4）油镜观察：高倍镜观察后）油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒上升镜筒-油镜转至正油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴油下方，在载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头小心地下降镜筒使镜头浸在油里浸在油里-用粗螺旋将镜筒慢上升，寻找目标（物象）用粗螺旋将镜筒慢上升，寻找目标（物象）用细螺

37、旋调节，使物象清晰用细螺旋调节，使物象清晰-观察记录。最大光圈观察记录。最大光圈实验方法 革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌 革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌实验结果 实验原理 菌种：菌种： 培养培养24小时小时的枯草芽孢杆菌菌种斜面的枯草芽孢杆菌菌种斜面试剂：试剂： 孔雀石绿，番红复染液，香柏油孔雀石绿，番红复染液，香柏油仪器及器材：仪器及器材： 显微镜，酒精灯，试管夹，载玻片，镊子，吸瓶显微镜，酒精灯，试管夹，载玻片，镊子，吸瓶，吸水纸，擦镜纸，吸水纸，擦镜纸实验器材 实验方法 制备菌悬液制备菌悬液染色染色涂片固定涂片固定水洗水洗复染复染镜检镜检加热加热实验方法 枯草芽孢杆菌培养枯草芽孢杆菌培养16

38、小时的芽孢染色图片小时的芽孢染色图片实验结果 实验结果 枯草芽孢杆菌培养枯草芽孢杆菌培养48小时的芽孢染色图片小时的芽孢染色图片注意事项 6. 用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次从小试管中挑取被染色的菌液时，应先用接液，其次从小试管中挑取被染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。涂片时菌体太少。5. 在芽孢染色涂片上为什么有时会出现大量游离的芽孢？在芽孢染色涂片上为什么有时会出现大量游离的芽孢？6. 芽孢染色的原理是什么？用一般染色法是

39、否能观察到芽孢染色的原理是什么？用一般染色法是否能观察到芽孢？芽孢？思考题 实验四实验四 微生物的间接计数法微生物的间接计数法水中细菌总数的测定水中细菌总数的测定1. 1. 了解利用平板菌落计数法测定微生物样品了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理。中活细胞的原理。2. 2. 熟练掌握平板菌落计数的操作步骤与方法。熟练掌握平板菌落计数的操作步骤与方法。实验目的 平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数，繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数，故又称活菌计数法。故又称活菌计数法。

40、 本法的原理和操作要点是：先将待测定的微生物样本法的原理和操作要点是：先将待测定的微生物样品按比例地做一系列稀释，再吸取一定量某几个稀释度品按比例地做一系列稀释，再吸取一定量某几个稀释度的菌悬液于无菌培养皿中（或凝固的无菌平板培养基的的菌悬液于无菌培养皿中（或凝固的无菌平板培养基的表面），再及时倒入表面），再及时倒入融化且冷却至融化且冷却至4545左右的培养基左右的培养基，立即充分摇匀，水平静置待凝（或用涂布棒将平板表面立即充分摇匀，水平静置待凝（或用涂布棒将平板表面的菌液及时涂布均匀）。经培养后，将各平板中计得的的菌液及时涂布均匀）。经培养后，将各平板中计得的菌落数的平均值换算成单位容积的含

41、菌量，在乘以样品菌落数的平均值换算成单位容积的含菌量，在乘以样品的稀释倍数，即可测知原始菌样的单位容积中所含的活的稀释倍数，即可测知原始菌样的单位容积中所含的活细胞数。细胞数。实验原理 1. 1. 牛肉膏蛋白胨培养基；牛肉膏蛋白胨培养基；2. 2. 无菌空瓶；灭菌生理盐水；灭菌培养无菌空瓶；灭菌生理盐水；灭菌培养皿、吸管、皿、吸管、 试管；试管；3. 3. 自来水、池水、河水或湖水。自来水、池水、河水或湖水。实验器材 实验方法 plate out 0.1 ml 试样稀释试样稀释 (10倍稀释法倍稀释法)100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-60.5ml试样在4.5ml

42、无菌生理盐水中逐级加入0.5ml稀释试样试试 样样 分别用分别用1ml的无菌移液的无菌移液管精确吸取三个稀释度的菌管精确吸取三个稀释度的菌液各液各0.2ml，加至相应编号，加至相应编号的无菌培养皿中。的无菌培养皿中。实验方法 10-410-510-6实验方法 实验方法 注意事项 1. 1. 各稀释度菌液移入无菌培养皿内时，要各稀释度菌液移入无菌培养皿内时，要“对号入对号入座座”，切勿混淆。，切勿混淆。2. 2. 每支移液管只能接触一个稀释度的菌液试管，每支每支移液管只能接触一个稀释度的菌液试管，每支移液管在移取菌液前，都必须在待移菌液中来回吹吸几移液管在移取菌液前，都必须在待移菌液中来回吹吸几

43、次，使菌液充分混匀并让移液管内壁达到吸附平衡。次，使菌液充分混匀并让移液管内壁达到吸附平衡。3. 3. 菌液加入培养皿后要尽快倒入融化并冷却至菌液加入培养皿后要尽快倒入融化并冷却至5050左右左右的琼脂培养基液，立即摇匀，否则菌体细胞常会吸附在的琼脂培养基液，立即摇匀，否则菌体细胞常会吸附在皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的皿底上，不易形成均匀分布的单菌落，从而影响计数的准确性。准确性。1. 平板菌落计数的原理是什么？它适合于哪平板菌落计数的原理是什么？它适合于哪些微生物的计数？些微生物的计数？2. 菌液样品移入培养皿后，若不尽快地倒入菌液样品移入培养皿后，若不尽快地倒入培养基并

44、充分摇匀，将会出现什么结果？培养基并充分摇匀，将会出现什么结果？为什么？为什么？3. 平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比，平板菌落计数法与显微镜直接计数法相比，各有何优缺点？各有何优缺点？思考题 实验六实验六 放线菌和真菌的培养与形态观察放线菌和真菌的培养与形态观察1. 1. 学会用插片法培养放线菌的制片方法。学会用插片法培养放线菌的制片方法。2. 2. 掌握用显微镜观察放线菌个体形态特征的掌握用显微镜观察放线菌个体形态特征的方法。方法。3. 3. 掌握用显微镜观察霉菌的个体形态特征。掌握用显微镜观察霉菌的个体形态特征。实验目的 在接种过放线菌的琼脂平板上，插上盖玻片或在平板上开槽在接种过放

45、线菌的琼脂平板上，插上盖玻片或在平板上开槽接种后在搭上盖玻片，放线菌的菌丝体可沿着培养基与盖玻片的交接种后在搭上盖玻片，放线菌的菌丝体可沿着培养基与盖玻片的交界线蔓延生长，从而较容易地黏附在盖玻片上。界线蔓延生长，从而较容易地黏附在盖玻片上。 待培养物成熟后再轻轻地取出盖玻片，就能获得在自然状态待培养物成熟后再轻轻地取出盖玻片，就能获得在自然状态下生长的直观标本。下生长的直观标本。 将它置于载玻片上（让含培养物的面朝上）做显微镜检查，将它置于载玻片上（让含培养物的面朝上）做显微镜检查，就可观察到放线菌在自然状态下着生的菌丝体的各种形态特征。就可观察到放线菌在自然状态下着生的菌丝体的各种形态特征

46、。 实验原理 1.菌种：放线菌、黑曲霉。菌种：放线菌、黑曲霉。2. 染色液：高氏染色液：高氏1号琼脂培养基，号琼脂培养基，PDA培养基。培养基。3. 器材：培养皿，盖玻片，镊子，载玻片，接器材：培养皿，盖玻片，镊子，载玻片，接种环，擦镜纸，酒精灯，显微镜。种环，擦镜纸，酒精灯，显微镜。实验器材 观察放线菌的形态特征常用的方法：观察放线菌的形态特征常用的方法： 插片法插片法 搭片法搭片法 玻璃纸法玻璃纸法 压片法压片法实验方法 插片法：插片法：1 1）倒平板：融化高氏）倒平板：融化高氏1 1号培养基，冷却至号培养基，冷却至5050左右倒平板。左右倒平板。平板宜厚些（利于插盖玻片，每皿倒入约平板宜

47、厚些（利于插盖玻片，每皿倒入约20ml20ml培养基）。培养基）。冷凝待用。冷凝待用。2 2）两种插片法：先划线接种后插片与先插片后划线接种。）两种插片法：先划线接种后插片与先插片后划线接种。1. 1. 先接种后插片：用接种环以无菌操作法从斜面菌种上挑先接种后插片：用接种环以无菌操作法从斜面菌种上挑取少量孢子，在平板培养基的一侧作来回划线接种。接取少量孢子，在平板培养基的一侧作来回划线接种。接种量可适当多些，然后以无菌操作法在接种线处插入无种量可适当多些，然后以无菌操作法在接种线处插入无菌盖玻片（常以菌盖玻片（常以4040-50-50角插入，深度约为盖玻片的角插入，深度约为盖玻片的1/31/3

48、长度）即可。长度）即可。实验方法 实验方法 实验方法 实验结果 霉菌的培养与观察：霉菌的培养与观察：倒平板：每皿约倒平板：每皿约15mL培养基培养基三点接种三点接种培养：培养：28，37d镜检：挑取菌落边缘菌丝，放置于载玻片上（预先加镜检：挑取菌落边缘菌丝，放置于载玻片上（预先加1d水或水或乳乳酸石炭酸棉蓝酸石炭酸棉蓝），用针适当挑开菌丝，盖上盖玻片，用低高），用针适当挑开菌丝，盖上盖玻片，用低高倍镜进行观察。倍镜进行观察。尽量避免挑断菌丝，可尽量避免挑断菌丝，可适当挑取培养基适当挑取培养基“挖挖”实验方法 观察黑曲霉菌观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生丝分隔情况和分生孢子着生情况（着孢子着生情况（

49、着重辨认分生孢子梗、重辨认分生孢子梗、分生孢子）分生孢子）实验结果 分生孢子分生孢子小梗小梗梗基梗基分生孢子梗分生孢子梗实验结果 1.1. 镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。细和色泽差异。2. 2.挑取霉菌时，应尽量避免挑段菌丝，可适当挑取培挑取霉菌时，应尽量避免挑段菌丝，可适当挑取培养基。养基。3. 3.观察时，应先用低倍镜沿着琼脂块的边缘寻找合适观察时，应先用低倍镜沿着琼脂块的边缘寻找合适的生长区，然后再换高倍镜仔细观察有关构造并绘的生长区，然后再换高倍镜仔细观察有关构造并绘图。图。注意事项 1 1镜检时，你如何区分放

50、线菌的基内菌丝和镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？气生菌丝？思考题思考题放线菌的菌落形态实验七实验七 微生物显微镜直接计数法微生物显微镜直接计数法1. 1. 学习使用血细胞计数板计酵母菌细胞学习使用血细胞计数板计酵母菌细胞的原理和方法。的原理和方法。2. 2. 了解微生物细胞活体染色的原理和计了解微生物细胞活体染色的原理和计数的方法。数的方法。实验目的 利用血细胞计数板计数的原理利用血细胞计数板计数的原理 将经过适当稀释的微生物细胞或孢子悬液，加将经过适当稀释的微生物细胞或孢子悬液，加至血细胞计数板的计数室中，在显微镜下逐格计至血细胞计数板的计数室中，在显微镜下逐格计数。由于计数室