第10章-吸光光度法ppt课件.ppt

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1、第第10章章 吸光光度法吸光光度法10.1 概述概述10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理10.3 分光光度计分光光度计10.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素10.5 光度分析法的设计光度分析法的设计10.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差10.7 常用的吸光光度法常用的吸光光度法10.8 吸光光度法的应用吸光光度法的应用 “目视比色法” “光电比色法” ,测量颜色深浅的仪器 出现了分光光度计，建立“分光光度法”。并且其原理已早不局限于溶液颜色深浅的比较。用光电比色计、分光光度计不仅可以客观准确地测量颜色的强度，而且还把比色分析扩大到紫外和红外吸收光谱，即扩大到无色溶液的测定

2、。10.1 概述概述吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁基于外层电子跃迁10.1 概述概述吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱散射光谱散射光谱分子光谱分子光谱原子光谱原子光谱 与化学分析法相比，它有一些不同于化学分析法的特点: 灵敏度高 准确度高 操作简便快速 应用广泛 10.1 概述概述物质物质颜色颜色红红紫红紫红紫紫蓝蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿吸收吸收光色光色紫紫蓝蓝绿蓝绿蓝蓝绿蓝绿绿绿黄绿黄绿橙橙红红波长波长400-450450-480480-490490-500500-

3、560560-580580-610610-650650-760白光白光绿绿紫紫橙橙青蓝青蓝黄黄蓝蓝红红青青760 650 600 560 500 480 450 400nm2 物质颜色和其吸收光关系物质颜色和其吸收光关系10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理1 吸收光谱产生的原因吸收光谱产生的原因 光光: :一种电磁波一种电磁波, ,波粒二象性波粒二象性 光谱名称波长范围X射线0.110nm远紫外光10200nm近紫外光200400nm可见光400750nm近红外光0.752.5um中红外光2.55.0um远红外光5.01000um微波0.1100cm无线电波11000m当光子的能量与

4、分子的当光子的能量与分子的 E匹配时，匹配时，就会吸收光子就会吸收光子 E=hu u=hc/l l原子光谱为线光谱原子光谱为线光谱分子光谱为带光谱分子光谱为带光谱电子跃迁能级电子跃迁能级分子振动能级分子振动能级分子转动能级分子转动能级 分子内部的运动和能级分子内部的运动和能级1、价电子运动分子的价电子可以在成键轨道和反键轨道间跃迁。电子能级差 120eV，相当于601250nm光子的能量。2、分子的振动分子内原子以平衡点为中心以非常小的振幅作周期性振动。振动能级差 0.051eV，相当于12502500nm光子的能量。3、分子的转动分子以其重心为轴转动。转动能级差10-40.05eV，相当于2

5、5 250um光子的能量。吸收光谱曲线：吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小物质在不同波长下吸收光的强度大小 Al l关系关系最大吸收波长最大吸收波长 l lmax：光吸收最大处的波长光吸收最大处的波长3 一些基本名词和概念一些基本名词和概念l lmax4 4 朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律光吸收定律朗伯光吸收定律朗伯-比尔比尔(Lambert-Beer)定律定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律I0 = Ir + It + IaI0 = It + IaI0IrItIa T = It / I0 , T: 透射比或透光度透射比或透光

6、度 A=lg (I0 / It )lg(1/T), A:吸光度吸光度朗伯定律（朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比年）：光吸收与溶液层厚度成正比比尔定律（比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比年）：光吸收与溶液浓度成正比 当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系朗伯比尔定律正比关系朗伯比尔定律 光吸收定律光吸收定律 数学表达：数学表达：Alg(1/T)=Kbc其中，其中，A:吸光度，吸光度，T:透射比，透射比， K:比例常数，比例常数，b:

7、溶液厚度，溶液厚度，c:溶液浓度溶液浓度注意：注意： 平行单色光平行单色光 均相介质均相介质 无发射、散射或光化学反应无发射、散射或光化学反应 A0.3000.2000.1000.000400 500 600 /nmmax不同物质的不同物质的max 不同，据此不同，据此同一物质的浓度越大，同一物质的浓度越大，A越大，据此越大，据此吸光度的加和性吸光度的加和性A1 = e e1bc1A2 = e e2bc2A = e e1bc1+ e e2bc2 根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化学反应平衡常数的测定某些化学反应平衡常数的测定在某一波长，溶

8、液中含有对该波长的光产生吸收在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和个吸光物质的吸光度之和摩尔吸光系数摩尔吸光系数 e e灵敏度表示方法灵敏度表示方法A = e e bcA = K Kbcc: mol/Le 表示物质的浓度为表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为液层厚度为1cm时溶液时溶液的吸光度。的吸光度。单位：单位： (Lmol-1 cm-1) e 反映吸光物质对光的吸收能力，也反映用吸光光反映吸光物质对光的吸收能力，也反映用吸光光度法测定该物质的灵敏度。度法测定该物质的灵敏度。c

9、: g/LA = abc a: 吸光系数吸光系数桑德尔桑德尔(Sandell)灵敏度：灵敏度： S 当仪器检测吸光度为当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。程内所能检测到的吸光物质的最低含量。 单位：单位：m mg/cm2 S=M/e e 氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30g，用2cm比色池，在650nm测定光吸收，A0.43,求S. (Nb原子量92.91)。根据A=bC,求3.3104 Lmol-1cm-1 1 分光光度计的组成分光光度计的组成光源光源单色器单色器样品池样品池检测器检测器读出系统读出系统10.3 吸光光

10、度计吸光光度计常用光源常用光源光源波长范围(nm)适用于氢灯185375紫外氘灯185400紫外钨灯3202500可见，近红外卤钨灯2502000紫外，可见，近红外氙灯1801000紫外、可见（荧光）能斯特灯10003500红外空心阴极灯特有原子光谱激光光源特有各种谱学手段单色器单色器棱镜单色器光栅单色器利用光的衍射和干射作用制成的元件优点适用波长范围宽色散均匀分辨率高缺点有重叠和相互干扰玻璃棱镜用于3503200nm波长 可见分光光度计石英棱镜用于1854000nm波长 紫外可见分光光度计单色光纯度由棱镜的色散率和出射狭缝宽度决定吸收池比色皿玻璃比色皿 用于可见光石英比色皿用于400nm的紫

11、外光比色皿的质量要求无色 透明 耐腐蚀同一厚度的透光率误差5%1cm2cm3cm0.5cm检测器检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器：常用检测器： 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 光二极管阵列光二极管阵列光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧化铯为红敏，适用化铯为红敏，适用6251000nm波长；阴极波长；阴极表面涂锑和铯为紫敏，适用表面涂锑和铯为紫敏，适用200625nm波长波长10.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素要求：要求：a. 选择性好选择性好b. 灵敏度高灵敏度高 (10

12、4)c. 产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d. 化学性质稳定化学性质稳定e. 反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别 ( l l60nm)没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定生成有色化合物再测定 显色反应显色反应1 显色反应显色反应大多数有机物可在紫外光区测定大多数无机离子无色或色浅，需要显色NNN NSO3HHO3SOHH O As32AsOOOHMO络合反应络合反应氧化还原反应氧化还原反应2 显色反应类型显色反应类型NNFe2+3NHHOOCCOOH+ VO3-+ H+NNCOOHCOOHHOOCHOOC+

13、VO2+ H O2离子缔合反应离子缔合反应CCOOHNN(C H )22 5(C H )22 5H+O-AuCl4.成盐反应成盐反应 (CH3)2NCHSCOCCHNS(CH3)2NCCOCCHNS+ AgAgS褪色反应褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂偶氮胂III络合物测定草酸络合物测定草酸吸附显色反应吸附显色反应 达旦黄测定达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色吸附达旦黄呈红色 3 显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂: 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾NNNNSO3HHO3SOHOHAsO H32H O As32有机显色剂：有机显色剂： 偶氮类：偶氮胂偶氮类：

14、偶氮胂III三苯甲烷类三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料三苯甲烷酸性染料 铬天菁铬天菁S S OCH3COOHHOCClClSO3HCH3COOH 三苯甲烷碱性染料三苯甲烷碱性染料 结晶紫结晶紫 CN(CH3)2(H3C)2NN(CH3)2邻菲罗啉类：新亚铜灵邻菲罗啉类：新亚铜灵 NNCH3CH3肟类：丁二肟肟类：丁二肟 CCCH3NNOHHOCH34 多元络合物多元络合物混配化合物混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物离子缔合物 AuCl4-罗丹明B金属离子金属离子-配体配体-表面活性剂体系表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB a 跃迁类型跃迁类型

15、 价电子跃迁价电子跃迁：*, *; n*, n* E (h) 顺序: n* n* 有机化合物的生色原理有机化合物的生色原理b 生色团和助色团生色团和助色团 生色团生色团: 含有含有*跃迁的不饱和基团跃迁的不饱和基团 助色团助色团: 含非键电子的杂原子基团含非键电子的杂原子基团,如如-NH2, -OH, -CH3 与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强5 影响因素影响因素a 溶液酸度（溶液酸度（pH值及缓冲溶液）值及缓冲溶液）u 影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变lu 影响待测离子的存在状态，防止沉淀u 影响络合物组成形式形式 pH max(nm)

16、 形式形式 pH max(nm)H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550H2L- 8.4-9.0 512HL2- 11.4-12.0 532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响对苯芴酮及其络合物的颜色影响 b 显色剂的用量显色剂的用量稍过量，处于平台区稍过量，处于平台区 c 显色反应时间显色反应时间针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定d 显色反应温度显色反应温度加热可加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解e 溶剂溶剂f 干扰离子干扰

17、离子 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率消除办法：消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比选择合适参比 褪色空白褪色空白(铬天菁铬天菁S测测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰) 选择适当波长选择适当波长 10.5 光度分析法的设计光度分析法的设计1. 选择显色反应选择显色反应2. 选择显色剂选择显色剂3. 优化显色反应条件优化显色反应条件4. 选择检测波长选择检测波长5. 选择合适的浓度选择合适的浓度6. 选择参比溶液选择参比溶液7. 建立标准曲线建立标准曲线测量条件选择测量条件选

18、择1 测定波长选择测定波长选择选择原则：选择原则：“吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性2 测定浓度控制测定浓度控制控制浓度控制浓度 吸光度吸光度A：0.20.8减少测量误差减少测量误差3 参比溶液选择参比溶液选择仪器调零仪器调零消除吸收池壁和溶液对入射光的反射消除吸收池壁和溶液对入射光的反射 扣除干扰扣除干扰试剂空白试剂空白试样空白试样空白褪色空白褪色空白 4 标准曲线制作标准曲线制作0123456780.000.050.100.150.200.250.300.35Aconcentration理论基础：朗伯理论基础：朗伯-比尔定律比尔定律 相同条件下相同条件下测定不同浓度标准测

19、定不同浓度标准溶液的吸光度溶液的吸光度AAc 作图作图10.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差吸光度测量的误差 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏移比尔定律的偏移1 非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移复合光由复合光由l l1和和l l2组成，对于浓度不同的溶液组成，对于浓度不同的溶液a和和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。 克服非单色光引起的偏

20、离： 使用较好的单色器，获得较纯的单色光 应将入射波长选择在被测物质的最大吸收处 选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内1 非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移非均匀介质非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯吸光度增加，导致线性关系上弯2 物理化学因素物理化学因素离解、缔合、异构等离解、缔合、异构等如：如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H+2CrO42- PAR的偶氮醌腙式的偶氮醌腙式 化学反应化学反应 a. 控制溶液的酸度 b. 加入掩蔽剂 c. 改变干扰离子的价态 d. 选择合适的参

21、比溶液 e. 增加显色剂用量 f. 分离3. 显色反应的干扰和消除方法显色反应的干扰和消除方法4 吸光度测量的误差吸光度测量的误差A0.434 ，T36. 8% 时，测量的相对误差最小时，测量的相对误差最小A=0.20.8, T=1565%，相对误差，相对误差4% dc/c= dA/A=dT/TlnT Er=dc/c100= dA/A100=dT/TlnT1002. 示差吸光光度法示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度目的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高解决高(低低)浓度组分浓度组分(i.e. A在在0.20.8以外以外)问题问题分类：高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸光光分类

22、：高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸光光 度法、精密示差吸光光度法度法、精密示差吸光光度法特点：特点： 以标准溶液作空白以标准溶液作空白原理：原理： A相对相对 = A = e ebcx- e ebc0= e eb c准确度：读数标尺扩展准确度：读数标尺扩展, 相对误差减少相对误差减少, c0愈接近愈接近cx, 准确度提高愈显著准确度提高愈显著10.7 常用的常用的吸光光度法吸光光度法1. 目视比色法目视比色法例：硫脲还原硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸例：硫脲还原硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸溶，硫酸高氯酸介质中，硫脲还原铁（溶，硫酸高氯酸介质中，硫脲还原铁（III）为铁）为铁(II),除

23、干扰，还原钼（除干扰，还原钼（VI）为五价，）为五价，2.00mg/100ml的的钼标准溶液为参比溶液，用钼标准溶液为参比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的钼标的钼标准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光度度,480nm测定测定A。 2.双波长吸光光度法双波长吸光光度法 目的：解决浑浊样品光度分析目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰消除背景吸收的干扰 多组分同时检测多组分同时检测 原理：原理： A = Al l1-Al l2 = （e el l1- e el l2）b c 波长对的选择：波长对的选择： a.等吸光度点法，等吸光度点法

24、，b.系数倍率法系数倍率法3.导数吸光光度法导数吸光光度法选选l l1为参比波长为参比波长, l l2为测量波长为测量波长得得 Al l1= e e xl l1bcx + e e yl l1bcy Al l2= e e xl l2bcx+ e e yl l2bcy A=Al l2-Al l1= (e e x2bcx+e e yl l2bcy)-(e e xl l1bcx+e e yl l1bcy)在等吸光度的位置在等吸光度的位置(G, F), e e yl l2 e e yl l1，则上式成为，则上式成为 A=(e e xl l2- e e xl l1）bcx A与与cx成正比成正比, 可用于

25、测定可用于测定例例,苯酚与苯酚与2,4,6-三氯苯酚三氯苯酚(y)混合物中混合物中苯酚苯酚(x)的双波长分光光度法测定。的双波长分光光度法测定。3.导数吸光光度法导数吸光光度法 目的：提高分辨率目的：提高分辨率 去除背景干扰去除背景干扰 原理：原理： dnA/dl ln l l 10.8 吸光光度法的应用吸光光度法的应用1 测定弱酸和弱碱的离解常数测定弱酸和弱碱的离解常数 AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以HB或B-形式存在。HB H+ + B- H+B-Ka = HBpKa=pH+ lg HBB-A=AHB+AB-pKa=pH+ lg AB- - A

26、A- AHBlg AB- - AA- AHB对对pH作图即可求得作图即可求得pKa 2 络合物组成确定络合物组成确定 饱和法（摩尔比法）饱和法（摩尔比法）制备一系列含钌制备一系列含钌3.010-5 mol/L (固定不变固定不变)和不和不同浓度（小于同浓度（小于12.010-5 mol/L）的）的PDT溶液，按溶液，按实验条件，实验条件，485nm测定吸光度测定吸光度,作图。作图。PDT:Ru=2:1等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法固定固定M+L,改变改变M,获得一系列吸光度值，吸获得一系列吸光度值，吸光度最大的值所对应的光度最大的值所对应的M与与L的比值，即获得的比值，即获得M:L比值。比值。Co(III)与与3，5二氯二氯PADAT的比值为的比值为1:23 分析应用分析应用 痕量金属分析痕量金属分析临床分析临床分析食品分析食品分析