3.1重组DNA技术的基本工具课件--高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

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1、 基因工程是指按照人们的愿望，基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。的新的生物类型和生物产品。 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用过精心设计，用“分子工具分子工具”培育出了转基因番木培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 在培育转基因番木瓜时，首先要在体外对含有在培育转基因番

2、木瓜时，首先要在体外对含有所需要基因的所需要基因的DNADNA分子进行分子进行“切割切割”、改造和、改造和“拼拼接接”；然后将重组；然后将重组DNADNA分子导入番木瓜体细胞内，分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。并使其在细胞中表达。非转基因番木瓜非转基因番木瓜 转基因番木瓜转基因番木瓜 实现这一精确的操作过程至少需要三种实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具分子工具”。“分子运输车分子运输车”“分子手术刀分子手术刀”“分子缝合针分子缝合针” 一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀” 1 1作用作用 切割切割DNA分子。分子。 2 2来源来源 主要从主要从

3、原核生物原核生物中分离纯化。中分离纯化。 /你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？要作用是什么吗？/ 原核生物中的限制酶可以切割外源原核生物中的限制酶可以切割外源DNA，但对自身的，但对自身的DNA不起作用，不起作用，起到保护自身的作用。起到保护自身的作用。？ 3 3作用特点作用特点 能够识别双链能够识别双链DNA分分子的子的特定核苷酸序列特定核苷酸序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯特定部位的磷酸二酯键键（如右图）断开。（如右图）断开。 大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6

4、6个核苷酸个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由组成，也有少数限制酶的识别序列由4 4个、个、8 8个或其他数量的核苷酸组成。个或其他数量的核苷酸组成。TGAGTCATCA3535磷酸二酯键磷酸二酯键CGC CGGGCG GC CGCCG3535C C G GCGCGGTCATAA A T TCG 一、限制性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶“分子手术刀分子手术刀” 4 4作用结果作用结果 DNA分子经限制酶切割产生的分子经限制酶切割产生的DNA片段片段末端通常有两末端通常有两种形式种形式黏性末端和平末端。黏性末端和平末端。EcoR：识别：识别GAATTC序列，在序列，在G与与A之间切割。之间切

5、割。Sma：识别：识别CCCGGG序列，在序列，在G与与C之间切割。之间切割。AGA T TCTCAGTA3535黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端平末端平末端平末端中轴线中轴线中轴线中轴线科学思维训练科学思维训练 1 1想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？分子？ 细菌中限制酶之所以不切割自身的细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分分子或者子或者不具备这种限制酶的识别序列不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识将甲基转移到了限制酶所

6、识别序列的碱基上别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。，使限制酶不能将其切开。 2 2有有2 2个不同来源的个不同来源的DNA片段片段A和和B，A片段用限制酶片段用限制酶Spe进行切割，进行切割，B片段分别片段分别用限制酶用限制酶Hind、Xba、EcoR和和Xho进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。下。5- -ACTAGT- 3- 33- -TGATCA- 5- 5Spe 5- -AAGCTT- - 3 33- -TTCGAA- 5- 5Hind5- -TCTAGA- - 3 33- -AGATCT- 5- 5Xba5- -GATATC- -

7、3 33- -CTATAG- 5- 5EcoR 5- -CTCGAG- - 3 33- -GAGCTC- 5- 5Xho 哪种限制酶切割哪种限制酶切割B片段产生的片段产生的DNA片段能与限制酶片段能与限制酶Spe切割切割A片段产生的片段产生的DNA片段相连接？为什么？片段相连接？为什么？ Xba。因为。因为Xba与与Spe切割产生了相同的黏性末端。切割产生了相同的黏性末端。 不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？基因工程操作中有什么意义？ 识别识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同分子中不同核苷酸序列，但能切

8、割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。切割位点的选择范围扩大。 将限制酶将限制酶Spe和限制酶和限制酶Xba切割产生相同的黏性末切割产生相同的黏性末端，可以用端，可以用DNA连接酶连接酶“缝合缝合”吗？若可以则重组吗？若可以则重组DNA还还可以用这两种限制酶再切割吗？可以用这两种限制酶再切割吗？ 可以，只要两个黏性末端互补配对可以，只要两个黏性末端互补配对DNADNA连接酶连接酶即可对其即可对其“缝合缝合”；不能，不存在原来的识别序列了。；不能，不存在原来的识别序列了。 二、二、DNA连接酶连接酶“

9、分子缝合针分子缝合针” 1 1作用作用 将将DNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNA分子。分子。 2 2种类种类 Ecoli DNA连接酶连接酶 从大肠杆菌中分离得到，只能将具有从大肠杆菌中分离得到，只能将具有互补黏性互补黏性末端的末端的DNA片段片段连接起来。连接起来。 T4 DNA连接酶连接酶 从从T4噬菌体中分离出来，既可以噬菌体中分离出来，既可以“缝合缝合”双链双链DNA片段互补的黏性末端片段互补的黏性末端，又可以，又可以“缝合缝合”双链双链DNA片段的平末端片段的平末端，但连，但连接平末端的效率相对较低。接平末端的效率相对较低。 注意：注意：DNA连接酶连接的是连接酶连接的是2 2个

10、个DNA片段之间的磷酸二酯键。片段之间的磷酸二酯键。 /DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？/ 不是一回事。不是一回事。DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3 3末端的羟基上，形末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶以一条聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末连接酶催化具有互补黏性末端或

11、平末端的端的DNA片段连接起来，它不需要模板。片段连接起来，它不需要模板。？ 三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车” 外源基因不能进入受体细胞并复制自己，需要外力的帮助。外源基因不能进入受体细胞并复制自己，需要外力的帮助。 1 1载体的作用载体的作用 作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中。作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中。 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 2 2质粒质粒基因工程中最常用的载体基因工程中最常用的载体 是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核是一种裸露的、结构简单、独立于真核细

12、胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的之外，并具有自我复制能力的环状双链环状双链DNA分子。分子。拟核拟核DNADNA质粒质粒大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒 三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车” 阅读教材第阅读教材第7272页相关内容，分析作为载体必须具备的条件。页相关内容，分析作为载体必须具备的条件。 3 3载体的要求载体的要求 能在受体细胞中稳定保存并复制。即携带外源能在受体细胞中稳定保存并复制。即携带外源DNA片段进入受体细片段进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体上

13、，随受体DNA同步同步复制。复制。质粒质粒标记基因标记基因启动子启动子限制酶切割位点限制酶切割位点终止子终止子复制原点复制原点 具有一个至多个限制酶切割具有一个至多个限制酶切割位点，供外源位点，供外源DNADNA（基因）插入。（基因）插入。 具有标记基因。通常是一些具有标记基因。通常是一些抗生素的抗性基因，便于重组抗生素的抗性基因，便于重组DNA分子的筛选。分子的筛选。 对受体细胞无害，不影响受对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。体细胞正常的生命活动。 三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车” 4 4载体的种类载体的种类 在基因工程中使用的载体除在

14、基因工程中使用的载体除质粒质粒外，还有外，还有噬菌体噬菌体、动植物病毒动植物病毒等。它等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大片段的大小上也有很大差别。小上也有很大差别。重组重组DNA分子分子 请在两张纸上分别写上下列两段请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列：序列：5-5-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC- 3 - 3 5-5-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC- 3- 33-3-TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG- 5 - 5 3-3

15、-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG- 5- 5 请你用请你用EcoR限制酶对上述两限制酶对上述两DNA进行进行“切割切割”后。将右边后。将右边DNA链上链上切下的片段重组到左边那条切下的片段重组到左边那条DNA链的切口处。链的切口处。思考思考讨论讨论？5-5-ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC- - 3 3 3-3-TATCGTACGATAGGTACTTAA GCCGTATG- 5- 5AATTCATACCGAG GTATGGCTCTTAA练一练1 1利用某目的基因（图甲）和利用某目的基因（图甲）和P1噬菌体载体（图乙）构建重组噬菌体载体（图

16、乙）构建重组DNA。限制性内切核酸。限制性内切核酸酶酶Bgl、EcoR和和Hind的切割位点分别如下图所示（已知这三种限制酶切割产生的的切割位点分别如下图所示（已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同）。下列分析错误的是（黏性末端不同）。下列分析错误的是（ ）A构建重组构建重组DNA时，可用时，可用Bgl和和Hind切割目的基因所在片段和切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体噬菌体载体B构建重组构建重组DNA时，可用时，可用EcoR和和Hind 切割目的基因所在片段和切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体噬菌体载体C图乙中图乙中P1噬菌体载体只用噬菌体载体只用EcoR切割后，含有两个游离的磷酸基团切

17、割后，含有两个游离的磷酸基团D用用EcoR切割目的基因所在片段和切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，两用噬菌体载体，两用DNA连接酶连接，只能产生连接酶连接，只能产生一种重组一种重组DNA目的基因目的基因BglBglHindEcoREcoR甲甲乙乙BglBglHindEcoRD选择限制酶的方法选择限制酶的方法 根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。 应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择应选择切割位点位于目

18、的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstPst；不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaSma。 为为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可以，也可以使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和质粒（双酶切），使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和质粒（双酶切），如图甲可选择用如图甲可选择用PstPst和和EcoREcoR两种限制酶（但确保质粒上也有这两种酶两种限制酶（但确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。的切割位点）。抗病基因抗病基因S

19、ma EcoRPstPstSma甲甲SmaPstEcoR标记基因标记基因乙乙选择限制酶的方法选择限制酶的方法 根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。 切割质粒时通常选择与切割含目的基因的切割质粒时通常选择与切割含目的基因的DNADNA片段相同的限制酶，片段相同的限制酶，以确保二者具有相同的末端。以确保二者具有相同的末端。 切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记

20、基因，即至少要保留一个标记基因，以便用于重组保留一个标记基因，以便用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用能使用SmaSma切割。切割。抗病基因抗病基因Sma EcoRPstPstSma甲甲SmaPstEcoR标记基因标记基因乙乙探究探究实践实践DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、实验思路一、实验思路 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。二、实验原理二、实验原理 初步分

21、离初步分离DNA和蛋白质：和蛋白质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 溶解溶解DNA：DNA能溶于能溶于2mol/L的的NaCl溶液。溶液。 鉴定鉴定DNA：在一定温度下，：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。遇二苯胺试剂会呈现蓝色。三、目的要求三、目的要求 了解了解DNA的物理和化学性质，理解的物理和化学性质，理解DNADNA粗提取和鉴定的原理。粗提取和鉴定的原理。 学会学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。进行鉴定。探究探究实践实践DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定四、方法步骤四、方法步骤 D

22、NA粗提取粗提取研磨研磨 称 取 约称 取 约 5 g菜花切碎，放菜花切碎，放入研钵中，倒入研钵中，倒入入10mL研磨液，研磨液，充分研磨。充分研磨。分离分离 将研磨液过滤后将研磨液过滤后在在44冰箱中放置几冰箱中放置几分钟或分钟或1500r/min离离心心5min后取上清液。后取上清液。提纯提纯 在上清液中加入体在上清液中加入体积相等的、积相等的、预冷的预冷的95%酒精酒精溶液，静置溶液，静置23min，溶液中出现的白色丝状溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的物就是粗提取的DNA。 析出析出DNA时为时为什么必须用预冷的什么必须用预冷的酒精？酒精？ 预冷的酒精具预冷的酒精具有以下优点：有以下优

23、点： 可抑制核酸可抑制核酸水解酶的活性，进水解酶的活性，进而抑制而抑制DNA降解。降解。 抑制分子运抑制分子运动，使动，使DNA易形成易形成沉淀析出。沉淀析出。 低温有利于低温有利于增加增加DNA分子的柔分子的柔韧性，减少其断裂。韧性，减少其断裂。探究探究实践实践DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定四、方法步骤四、方法步骤 DNA鉴定鉴定 取取两支两支20mL试管，各加入试管，各加入2mol/L的的NaCl溶液溶液5mL。将丝状物或沉淀物。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然溶液中。然后，向两支试管中各加入后，向两支试管中各加入4mL的二苯的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热水中加热5min。待试管冷却后，比较。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。两支试管中溶液颜色的变化。鉴定鉴定DNA鉴定结果鉴定结果