细胞免疫荧光染色操作步骤.pdf

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1、细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜 下即可观察到荧光。实验步骤如下：1.已转染 72h 的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS 洗三遍，每次5 分钟。2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15 分钟，避光。3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS 洗三遍，每次5 分钟。4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10 分钟，冰PBS 洗三遍，每次5 分钟。5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30 分钟。6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, S

2、igma, USA）： SAB+FBS=1:200。7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4 度避光过夜。次日：8.取出细胞复温至室温约1h。9.冰 1 Tween 洗两次，每次5 分钟，于摇床。冰PBS 洗一次， 5 分钟，于摇床。10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用 PBS 或 FBS配制。浓度1:200 11.加入二抗，室温孵育1 小时 (避光 )。12. 冰 1 Tween 洗两次，每次5 分钟，于摇床。冰PBS 洗一次， 5 分钟，于摇床。13.DAPI 染核，每皿1 滴，完全覆盖住细胞即可。14. 冰 1 Tween 洗

3、两次，每次5 分钟，于摇床。冰PBS 洗一次， 5 分钟，于摇床。15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。16.上机 confocol 建议： 1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。4.不管采用何种方法，在使用PBS 缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS

4、浸洗 3 次，每次 3min；2. 用 4% 的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片 3 次，每次 3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 ) 室温通透 20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min ，吸水纸吸干 PBS ，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37孵育 1h，PBST 浸洗

5、切片 3 次，每次 3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。7. 复染核：滴加 DAPI避光孵育 5min，对标本进行染核， PBST 5min 4 次洗去多余的 DAPI ；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。细胞免疫荧光步骤1.在 24 孔板里加 500 微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50% 汇合度较好。 10000-30000 左右 2.给药处理 24h。 3.PBS洗三遍。4. 4冷的多聚甲醛固定15 分钟， PBS洗三遍，每次 5min，摇床。（避光） 5.0.5 Triton X10

6、0（PBS配）破膜 15min ，PBS洗三遍，每次 5min，摇床。 6.5%BSA（牛血清白蛋白， PBS配）封闭 60 分钟,不用洗。 7.加一抗孵育（5%BSA 配），4摇床过夜。8. 收集一抗， PBS洗三遍，每次 5min，摇床。孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温 60min（避光）9. 回收二抗， PBS洗三遍，摇床，每次5min。10. 0.5ug/mLDAPI （5%BSA 配，2 滴/ml ）染核 15min。（避光）11. PBS 洗三遍，每次 5min ，摇床。12.取载玻片，滴加 10uL 抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲

7、油封片子的对角线。All steps for IF 1) Remove culture medium and fix cells (a common fixative is 4% formaldehyde in PBS, for 15 minutes) 2) Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical) 3) Permeabilize the cells (a common permeabilization reagent is 0.2% Triton X-100 in PBS for 30 minutes) 4) Wash well in PBS 5

8、) (optional: Block for non-specific dye binding using the Image-iT FX Image Enhancer Solution, I36933) 6) Block for non-specific antibody binding 30-60 minutes (a common blocking solution would be 3-6% bovine serum albumin / 5% normal goat serum / PBS, or commercial blocking reagents like our BlockA

9、id, product B10710) 7) Incubate in primary antibody for 30-60 minutes, in blocking solution or overnight at 4 degrees (antibody concentrations vary, but usually between 0.5-10ug/mL) 8) Wash well in PBS 9) Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 3-6% bovine serum albumin / PBS (a good starting antibody concentration is 5 ug/mL) 10) Wash well in PBS 11) Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306) 12) Mount in appropriate mounting medium (for fluorescent secondaries, a good antifade solution is best, such as ProLong Gold, P36934, or SlowFade Gold, S36937)