2022年野外采样实验 .pdf

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1、野外取样实验方案2016041. 实验目的研究自然条件下东南景天不同生育期间，其内生菌多样性的动态变化。2. 实验设计选择在东南景天的 苗期、开花期、成熟期 ，于浙江衢州铅锌矿山采集具有代表性 5 个样点 的超累积生态型东南景天， 混合为一个样品并将其连同根际土壤放入无菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持鲜活状态，带回实验室，然后进行后续处理。3. 实验内容（1） powersoil 试剂盒提取根际土壤菌DNA （2） 可培养植物内生菌别离（3） CTAB 法提取植物内生菌DNA （4） 植物重金属含量测定（5） 土壤理化性质测定实验一powersoil 试剂盒提取根际土壤菌DNA1. 实验目

2、的powersoil 试剂盒提取根际土壤菌DNA ，保存，待之后送检2. 实验步骤（1） 获取东南景天根际土壤小心把东南景天从土壤中取出， 用镊子夹取粘附在根表的土壤。 每个样点夹取约 3g 土壤，取 1g 立即提取 DNA，余下装入封口袋，？ -20保存 。取出的东南景天外表洗净， 晾干。测量鲜重后，杀青，烘干。测量干重后，研磨，待测。植物重金属含量，3个重复，每个重复，共需要植物根茎叶鲜重各5g2 选取 Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA试剂盒提取土壤样品DNA。具体操作步骤如下：

3、1称取约 0.25g土壤样品，放入研磨珠套管PowerBead Tubes ，涡旋混匀。2套管中加入 60l C1 溶液裂解缓冲液，颠倒数次，涡旋5s混匀。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 7 页3将套管放入水平涡旋振荡仪，在最大速度振荡10min。4取出套管，在室温下10000 g 离心 30s。5把上清液约 400500l转移到新的 2mL 离心管。6加 250l C2 溶液抑制物去除液至离心管中，涡旋5s，4下放置 5min，在室温下 10000 g 离心 1min。7将上清液转移到另一新的2mL 离心管，总体积不超

4、过600l，同时防止吸出沉淀物。8加 200l C3 溶液抑制物去除液 至离心管中，涡旋混匀，4下放置 5min，在室温下 10000 g 离心 1min。9将上清液转移到另一新的2mL 离心管，总体积不超过750l，同时防止吸出沉淀物。10加 1.2mL C4 溶液高盐溶液至离心管中，涡旋混匀，从离心管中抽取约650l溶液至离心过滤管 Spin Filter 。11在室温下 10000 g 离心 1min，取出管中过滤柱，弃去液体，过滤柱放回管中。12加入第 10 步离心管中约 650l溶液，重复第步操作，加入第10 步离心管中剩余的溶液，重复第11步操作。13加 500l C5 溶液乙醇淋

5、洗缓冲液至离心过滤管中，在室温下10000 g离心 30s，弃去管中液体。14在室温下 10000 g 离心 1min。15取出过滤柱小心放入新的2mL 离心管中，防止任何C5 溶液溅到过滤柱上。16加入 60l C6 溶液 DNA 洗脱液或无菌超纯水至过滤柱白色薄膜中，在室温下 10000 g 离心 30s。17弃去离心柱，提取完成。分装-20保存，待下一步应用。实验二 可培养内生细菌的别离纯化保存1. 实验目的1别离东南景天内生菌，记录菌落数，菌落种类数，菌落形态，优势菌菌落数。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 7 页

6、2菌落纯化，保存菌种。2. 仪器和试剂内生菌别离1需要干热灭菌的仪器培养皿 150 个其中在 15 个培养皿中放入滤纸150mL 烧杯 75 个研砵 15 个（2） 需要高温湿热灭菌的仪器R2A 培养基 3000mL，分装至 15 个 250mL 三角瓶磷酸缓冲溶液 150mL，至于 200mL 灭菌瓶试管+蒸馏水 2*3*5=30 支试管2000mL 蒸馏水，装入 1000mL 三角瓶1mL 枪头两盒其中 30 个需要剪缺口锡箔纸 50 张（3） 其他试剂99%酒精、 35%双氧水、 3%次氯酸钠内生菌纯化保存1需要干热灭菌的仪器培养皿 50 个2需要高温湿热灭菌的仪器50%甘油 150mL

7、约 150 个菌种用量，倒入 200mL 灭菌瓶。150个冻存管，用保鲜袋包装。R2A 固体培养基 1000mL，分装至 5 个 250mL 三角瓶。R2A 液体培养基 1000mL，分装至 50 个 50mL 三角瓶。3. 实验步骤3.1 植物样品外表消毒灭菌烧杯：15 个植物样 5=75个制作 2000mL 无菌水。分别取 4g 植物样在自来水下冲洗 99%酒精1min 35%双氧水 +3%次氯酸钠 30min无菌水冲洗三次。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 7 页取 g植物样用锡箔纸包装，做3 个重复，液氮速冻， -

8、80保存。3.2 可培养细菌的培养及纯化保存1细菌的培养基配方R2A 培养基1000ml 蒸馏水，酵母粉、胰蛋白胨、酪蛋白氨基酸、 葡萄糖、可溶性淀粉、 KH2PO4、MgSO4 7H2O： 、丙酮酸钠，配制 R2A 培养基 3000mL，分装至15 个 250mL 三角瓶，高温湿热灭菌121,20min。2磷酸缓冲溶液灭菌处理磷酸缓冲溶液：氯化钠；2PO4；2HPO4； ；100ml 蒸馏水； PH 值。配制磷酸缓冲溶液 150mL， 至于 200mL灭菌瓶， 高温湿热灭菌 121,20min。3研磨把消毒后的叶、茎和根，分别放在灭菌的研钵中，研磨成汁，加入3ml 的磷酸缓冲溶液，搅拌均匀，

9、静置10 分钟，再搅拌。4稀释 2*3*5=30 支试管从研钵中取 1ml 的溶液分别稀释 10 倍、100倍5涂布分别从原液、 10 倍、100 倍的溶液中取 200 微升到细菌的培养基上培养，每个梯度做 3 个平行。 用酒精浸泡，烧的时间长一些，叶、茎，考虑用不同的三角刮刀 15 个植物样 *3 个浓度 *3 个重复 =135 个平板6平板培养一星期后，计数，并记录其菌落形态。同时，根据菌落特征。7菌种纯化保存约50 个菌种用量配制 50%甘油 150mL约 150 个菌种用量，倒入 200mL 灭菌瓶。准备 150 个冻存管，用保鲜袋包装。配制 R2A 固体培养基 1000mL，分装至

10、5 个 250mL 三角瓶，配制 R2A 液体培养基 1000mL，分装至 50个 50mL 三角瓶。以上仪器试剂使用高温湿热灭菌121,20min。挑选不同的菌落到新的培养基，纯化1 次。挑单个菌落到 R2A 液体培养基中， 30 、160r/min，摇床 12-16小时，摇到对数期或对数末期， 测 OD 值， 取 700 uL 菌液并加 300 uL 50%甘油于甘油管中，精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 7 页保存，每个菌保存3 个甘油管。实验三 CTAB 法提取植物内生菌DNA 1. 实验目的利用 CTAB 法提取

11、植物内生菌DNA ，保存待测。2. 实验原理十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)是一种阳离子去污剂， 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中 (0.7mol/L NaCl)，CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸别离出来。3. 实验材料实验分3 批完成1 液氮；2 研钵 6 个，干热灭菌；3 CTAB DNA 提取液：a. 100 mM Tris-HCl (pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；b.

12、20 mM EDTA (pH8.0) 螯合 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNase活性；c. 1.4 M NaCl 提供一个高盐环境，使DNA 蛋白复合物 DNP充分溶解；d. 2 % (w/v) CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于别离；e. 1% PVP 40,000 (polyvinyl pyrrolidone) (聚乙烯吡咯烷酮 )是酚的络合物， 能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚， 减少 DNA 中酚的污染； 同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。将上述试剂混合后，灭菌20 分钟，常温保存；4 酚

13、氯仿异戊醇按照酚 :氯仿:异戊醇 =48:48:4 的比例配置 蛋白质变性，同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子外表又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点： 1.有效变性蛋白质； 2 抑制了 DNase精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 7 页的降解作用。缺点： 1.能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA 。2.不能完全抑制 RNase的活性；5) 氯仿异戊醇按照氯仿 :异戊醇 =96:4 的比

14、例配置。 能克服酚的缺点； 加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚酚易溶于氯仿中 ；6) 异丙醇 沉淀 DNA；7) 70%的酒精 清洗 DNA ；8) 2 mL 与 1.5 mL 的离心管各 18个，高温湿热灭菌。4. 实验步骤1 收集大约 100 mg 的植物样品，在使用前保存于-80 。2 将样品放于研钵中，配合液氮，快速将样品磨成粉末状，将粉末尽量收集于一个 2 mL 的离心管中。3 将步骤 2 中的离心管中加入0.9 mL CTAB ，漩涡震荡均匀，于65 中水浴20-30 分钟。4 水浴后，加入 0.9 mL 氯仿异戊醇，上下翻转均匀，12000 rpm 离心

15、 8 分钟。5 将离心后上清液 510L 转至另一干净的1.5 mL 离心管中，加入340L上清液体积的 2/3异丙醇，上下翻转均匀至有沉淀产生，12000 rpm离心 8 分钟。6 离心后弃掉液体，用 0.7 mL 70 %的酒精清洗， 12000 rpm离心 2 分钟，小心地弃掉废液，防止将DNA 倒出。7 重复步骤 6。8 于通风橱中将酒精晾干，至透明状即可。9 加入 50 L 灭菌水或 TE 水pH8.0 TE 可延长 DNA 保存时间，将 DNA 于-20 、-80 长期保存。5. 注意事项：1) 实验前应先预热水浴锅。3. 2) 在对 DNA 质量要求不是特别高的情况下，用氯仿异戊

16、醇即可，不用酚氯仿异戊醇。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 7 页实验四 植物重金属含量及土壤理化性质测定1. 实验目的回校后保存植物样及土壤，待后续检测。2. 实验步骤在获取根际土壤后，将取出的东南景天外表洗净，晾干。测量鲜重后，杀青，烘干。测量干重后，研磨，待测。植物重金属含量，3 个重复，每个重复，共需要植物根茎叶鲜重各5g。内生菌别离试验后，取出土壤约100g，风干，研磨，过20 目筛，保存待测。实验安排出发前：订购试剂盒，液氮，配制CTAB 法所需试剂出发后：完成内生菌别离实验的灭菌及平板制作， 由莉敏 本科微生物实验课中学过，基本掌握负责，平香协助。回校第一天：完成土壤 DNA 提取需 3 个小时 ，梓灝负责已掌握。植物清洗，称重，量株高，由樊慧敏本科生负责。东南景天内生菌提取，由本人负责，丽婷协助。回校第 3-4 天完成 CTAB 法提取内生菌 DNA 1 批需要 3 个小时 ， 本人负责，丽婷协助。后续测定植物重金属含量，测定土壤理化性质。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 7 页